Farklı Ekstraksiyon Yöntemleri ile Elde Edilen Phyllanthus emblica L. Ekstraktlarının Stabilitesini İncelemek İçin Çoklu Işık Saçılmasının Kullanılması

Summary

Burada, geleneksel Çin tıbbı ekstraktlarının stabilitesini değerlendirmek için çoklu ışık saçılma teknolojisine dayanan bir stabilite değerlendirme yöntemi sunuyoruz.

Abstract

Geleneksel Çin tıbbının ekstraksiyon ara maddesi, hazırlık sürecindeki kilit ara maddedir ve stabilitesi, nihai ürünün etkinliği ve kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bununla birlikte, mevcut stabilite değerlendirme yöntemleri genellikle zaman alıcı ve emek yoğundur, uzun süreli gözlem ve karmaşık ekipmanların (yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi) çalışmasını gerektirir ve sistemin kararsızlığı hakkında daha fazla fiziksel bilgi edinmek zordur. Bu nedenle, geleneksel Çin tıbbı için hızlı ve doğru bir stabilite analiz teknolojisi oluşturmak için acil bir ihtiyaç vardır. Çoklu ışık saçılması, geleneksel Çin ilaçlarının stabilitesini, numunenin doğasını veya durumunu değiştirmeden veya organik reaktifler kullanmadan çevre dostu bir şekilde doğru ve hızlı bir şekilde değerlendirebilen son teknoloji bir analitik yöntemdir.

Bu çalışmada, çoklu ışık saçılımının hassas tarama verilerini kullanarak, mevcut protokol zaman içinde katman kalınlığı, parçacık göç hızı ve ortalama parçacık boyutu için varyasyon eğrilerini hızla elde etti. Bu, mekanizmanın ve sistemin erken aşamalarında istikrarsızlığına neden olan önemli özelliklerin kesin olarak tanımlanmasını sağladı. Not olarak, ekstraksiyon işlemi için araştırma süresi, sistem kararlılığının ayrıntılı bir şekilde ölçülmesi ile önemli ölçüde kısaltılabilir, bu da çeşitli ekstraksiyon işlemlerinin Phyllanthus emblica L'nin stabilitesi üzerindeki etkilerinin hızlı, doğru ve derinlemesine bir analizine izin verir.

Introduction

Geleneksel Çin tıbbı (TCM) üretiminde, TCM ekstraksiyon ara ürünlerinin ve ilgili sıvı preparatların kararlılığı her zaman muayene^1'in odak noktası olmuştur. Tıbbi ürünlerin, özellikle de birincil etken madde olarak polifenollerin klinik etkinliği, önemli stabilite sorunları nedeniyle acı çekmektedir ^2,3. Sanajon oral sıvı ve Nuodikang oral sıvı, bu sayının tipik vakalarına örnektir⁴. Bu nedenle, TCM üretim sürecinde sıvı ara ürünlerin stabilitesini hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirmek ve optimize etmek için verimli araçların nasıl kullanılacağını öğrenmek çok önemlidir. Güneydoğu Asya'da yaygın bir tıbbi bitki olan Phyllanthus emblica L. (PE), iyi antioksidan özelliklere sahip olduğu düşünülmektedir⁵, ayrıca anti-enflamatuar⁶, antibakteriyel⁷ ve antitümör etkileri⁸. Termal ekstraksiyon prosedürü sırasında, PE'deki tanenler şiddetli bir şekilde dönüşür⁹. Yüksek sıcaklıklara sahip kataliz altında, bu tanenler gallik asit ve ellagik asit gibi moleküller üretmek için hızlı bir şekilde hidrolize olur, bu da zayıf çözünürlükleri nedeniyle kararsızlığa veya çökelmeye neden olur¹. Hızlandırılmış test veya santrifüjleme gibi TCM stabilitesini değerlendirmek için mevcut yöntemler genellikle hantaldır⁴, bu da ilgili hazırlık süreçlerinin daha da geliştirilmesini sınırlar.

Çoklu ışık saçılması (MLS) prensibine dayanarak, PEF ekstraktları için hızlı bir stabilite değerlendirme yöntemi oluşturduk ve kararsızlık mekanizmasını analiz ettik. MLS, yakın kızılötesi ışık kaynaklarının taranmasına dayanan bir ölçüm yöntemidir. Herhangi bir çözüm sistemi değişikliği, ışık yoğunluğunda bir değişikliğe neden olur. Gelen ışık, numunenin parçacıkları tarafından emildiğinde veya nüfuz ettiğinde dağılır. Sistem, numuneden geçerken iletim ışık sinyalini kaydeder; Numunenin ışık geçirgenliği zayıfsa, sistem geri saçılan ışık sinyalini kaydeder. Görsel gözlemle karşılaştırıldığında, bu çok zaman kazandırabilir¹ ve kararsızlık fenomenini ayrıntılı olarak hızlı ve doğru bir şekilde analiz edebilir, böylece ekstraksiyon işleminin optimizasyonuna rehberlik etmek için daha yararlı bilgiler sağlar.

Protocol

1. Ekstrakt hazırlama

1. Uygun miktarda PE'yi doğru bir şekilde tartın ve reflü ekstraksiyonu için 10x (ağırlık) deiyonize su ekleyin.
2. Tartımdan sonra 0 saat (E1), 0,5 saat (E2), 1 saat (E3), 1,5 saat (E4) ve 2 saat (E5) boyunca reflü ekstraksiyonu için beş numune ayarlayın.
3. Ekstraksiyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığına soğutun ve ekstraksiyon öncesi ağırlıklarla tutarlılık sağlamak için kaybedilen ağırlığı telafi etmek için tartım.
4. Çözünmeyen materyalin ve bitkisel kalıntıların numune çözeltisinden uzaklaştırılmasını sağlamak için numuneleri 10 dakika boyunca 8.581 × g'da santrifüj edin.
5. Her seferinde eklenen çözeltinin aynı yükseklikte olduğundan emin olmak için numune şişesine 20 mL numune çözeltisi eklemek için bir pipet kullanın.
   NOT: Numune şişesinin tarama kısmında parmak izi gibi kontaminasyonlardan kaçının, numune şişesinin temiz olduğundan emin olun ve şişe yüzeyinde görünür çizikler olup olmadığını kontrol edin. Numune çözeltisini eklerken, numune şişesine dökülmemeye veya sıçramamaya dikkat edin ve sıvı seviyesinin her şişede aynı yükseklikte olduğundan emin olun.

2. Cihazın çalışması

1. MLS algılama cihazını açın ve 30 dakika ısıtın.
2. Üst menüdeki Dosya oluştur düğmesine tıklayın (veya Dosya | Yeni dosya işlevi) kullanarak yeni bir test dosyası oluşturun.
3. Cihazın hedef sıcaklığını 25 °C'ye ayarlamak için üst menüdeki Show Turbiscan Lab Temperature (Türbiscan Laboratuvarı Sıcaklığını Göster ) düğmesine tıklayın.
   NOT: Cihazın ayarlanan sıcaklığı oda sıcaklığından daha yüksek olmalıdır; aksi takdirde, numune sıcaklığı oda sıcaklığından etkilenecektir.
4. Kurulum analizi programına girmek için üst menüdeki Program Taraması'na tıklayın. Programı listeye ekleyin ve görev çubuğuna döngü olarak 5 dakika ekleyin, analiz dizisine 48 saat tarayın ve denge süresini 20 dakika olarak ayarlayın. Sonraki tüm ölçümler için bu analiz programını seçin.
5. Hazırlanan numune şişesini MLS algılama sistemine taşıyın. Programı kurduktan sonra, ölçümü başlatmak için Başlat'a tıklayın.
   NOT: Numuneyi yüklerken cam şişeyi sallamamaya dikkat edin. Ölçüm ancak numune sıcaklığı ve ayar sıcaklığı dengelendikten sonra başlatılabilir.

3. Çoklu ışık saçılma analiz programı ayarı

1. Veri toplandıktan sonra, kararlılık indeksini (SI), parçacık boyutunu ve parçacık göç hızını hesaplamak üzere optik parametreleri ayarlamak için hesaplama parametreleri listesine tıklayın.
2. Optik parametreleri şu şekilde ayarlayın: sürekli faz ışık geçirgenlik yoğunluğu (T₀)% 99.99 (su), dağınık faz kırılma indisi (np) 1.36 ve sürekli faz kırılma indisi (nf) 1.33 olarak.

Representative Results

Şekil 1, çoklu ışık ölçümünün prensibini ve toplanan sonuçların anlamını göstermektedir. MLS spektrum sonuçlarında (Şekil 2), apsis örnek hücrenin yüksekliğiydi ve ordinat iletim (% T) ve geri saçılma (BS% ) yoğunluğuydu. MLS spektrum sonuçlarını hesaplayarak, sistem ölçüm periyodu boyunca delta iletim ortalama değeri (ΔT) (Şekil 3A), foton serbest yolu (Şekil 3B), SI (Şekil 3C) ve parçacık boyutu (Şekil 3D) dahil olmak üzere numunenin temel fiziksel parametrelerindeki değişiklikleri elde edebilir). Ölçüm süresinin uzamasıyla, kararlı ekstraktların MLS spektrumları çok az dalgalanır veya hiç dalgalanmaz ve ΔT, foton serbest yolu ve parçacık boyutu dahil olmak üzere fiziksel parametreleri kararlı olma eğilimindedir.

Tipik numune kararsızlığı sonuçları Şekil 2A,C-E'de gösterilmiştir. Kararlı numunelerin spektral sonuçları, kararlı numunelerin tipik bir özelliği olan Şekil 2B'de gösterildiği gibi, tüm tarama zamanlarında tutarlı olma eğilimindeydi. Kararlılık parametrelerini daha da ölçmek için, SI değerlendirme için kullanılabilir. Mevcut protokol, SI'ya (Şekil 3C) dayanan farklı ekstraksiyon yöntemleri altında stabilitenin hızlı bir şekilde tanımlanmasına ve kararsızlık mekanizmasının analizine izin vermektedir. Düşük SI değerlerinin daha iyi stabilite ile ilişkili olduğu unutulmamalıdır. SI, tarama süresi içinde <10 ise numune kararlı olarak kabul edilir. SI değerleri karşılaştırılarak, beş numunenin stabiliteleri doğru bir şekilde ayırt edilebilir ve ilgili stabilite karakteristik spektrumları elde edilebilir (Şekil 4). Yukarıdaki parametre ile birleştirilen partikül migrasyon hızı (Tablo 1), numunenin kararsızlık mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.

Şekil 1: MLS'nin analiz prensibi. MLS, ışık kaynağı olarak darbeli yakın kızılötesi ışık kullanır (dalga boyu: 880 nm) ve iki senkron optik dedektör, sırasıyla numuneden geçen iletim ışığını (T, olay radyasyonundan, iletim sensöründen 0 ° ') ve geri saçılma ışığını (BS, olay radyasyonundan 135 ° ', geri saçılma dedektörü) algılar. Işık kaynağı, iletim ışık dedektörü ve geri saçılan ışık dedektörü ölçüm probunu oluşturur. Numune hücresinin altından üstüne kadar olan ölçüm bir taramadan oluşur. Numunedeki herhangi bir kararsızlık, T ve BS sinyal güçleri üzerinde hafif bir etkiye sahip olacaktır. Bu etki, flokülasyon, tabakalaşma ve çökelme dahil olmak üzere çeşitli kararsız fenomenleri karakterize etmek için kaydedilir ve analiz edilir⁴. Çoklu tarama sonuçlarının hesaplanması yoluyla, kararsızlığın ilk aşamasında çözelti sisteminin kararsızlığının mekanizması ve hızı doğru bir şekilde analiz edilebilir ve tabaka kalınlığının (tortu tabakası, yüzer tabaka ve berraklaştırma tabakası) zamanla ilişki eğrisinin yanı sıra parçacık göç hızının ve parçacık boyutunun zamanla ilişki eğrisi, elde edilebilir. Kısaltma: MLS = çoklu ışık saçılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: PE ekstraktının MLS spektrumları (iletim ve geri saçılma) farklı ekstraksiyon yöntemleri ile. (A-E) E1-E5'in MLS spektrumları. Spektral verilerden, kabaca (B) E2 numunesinin daha az dalgalandığı, numunenin daha kararlı olduğunu gösterirken, (A) E1'in iletim ışığındaki genel düşüş nedeniyle bulanıklığa sahip olabileceği sonucuna varılabilir. (C-E) E3-E5 örnekleri oldukça kararsızdı ve farklı yüksekliklerdeki örneklerin spektral verileri farklıydı, bu da tabakalaşmanın daha sonraki dönemde gerçekleştiğini gösteriyordu. Kısaltmalar: MLS = çoklu ışık saçılması, PE = Phyllanthus emblica L., EN = N yöntemiyle elde edilen ekstrakt. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: MLS spektrum analizi sonuçları . (A) Zaman geçtikçe, T değeri yükselir ve örnek daha kararsız hale gelir. E3 ve E4 için, ΔT seviyesi sonunda önceki aşamaya geri döndü ve bu ekstraktlarda toplama ve yağışın meydana geldiğini gösterdi. E5'in ΔT'si bulanıklıktan sonra düşük bir seviyede kaldı, bu da E5'in büyük miktarda çökelmeye sahip olabileceğini gösteriyor. (B) Foton serbest yolundaki eğilim, numunenin iletilen ışığındaki değişiklikleri yansıtabilir. (C) Çeşitli ekstraktların stabilitesi zaman içinde sürekli olarak dalgalanmış, E2 > E1 > E5 > E3 > E4 depolama süresi boyunca kararlılık sırasıdır. (D) Partikül boyutundaki dinamik değişiklikler, numunedeki partiküllerin toplanmasını ortaya çıkarabilir. Sonuçlar, tüm numunelerin partikül boyutlarının 8-20 saat içinde önemli ölçüde değiştiğini, E3 ve E5'in partikül boyutunun ölçüm aralığını bile aştığını göstermektedir. Bu nedenle, bu aşama, numunedeki kararsız molekül veya parçacık agregalarının oluşumu için çok önemli bir aşamadır. Benzer şekilde, son aşamada, parçacıklar çekirdeklenmeye ve toplanmaya devam ettikçe, yeterli parçacık büyük aglomeralar oluşturduktan ve çökeldikten sonra parçacık boyutunda bir azalma gözlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı ekstraksiyon yöntemleri ile elde edilen PE ekstraktlarının instabilitesi. Apsis ve renk, iletilen ışığın veya geri saçılan ışığın yoğunluğunu temsil ettiği için sonuç zaman alır. Sonuç, numunelerin farklı zaman noktalarında ve yüksekliklerde bulanıklık ve tabakalaşmasının gerçek durumunu doğrudan yansıtabilir. Her sonucun üstündeki renklilik bandı, mavi kısmın% T'yi ve kahverengi kısmın% BS'yi temsil ettiği farklı renklere karşılık gelen ışık yoğunluğu değerlerini temsil eder. (A) E1'in %T'si 16 saat sonra azalmaya başladı, bu da numunenin bulanık olduğunu ve tüm prosesin delaminasyon veya çökelme olmadığını gösteriyor. (B) E2'nin %T'si ölçüm periyodu boyunca tutarlıydı ve bu da numunenin stabil olduğunu gösteriyordu. (C) E3 16 saatte bulanıktı ve BS% 'si 20 saatte aniden arttı, bu da numunedeki parçacıkların o anda toplandığını, tabakalaştığını ve çökeldiğini gösteriyor. (D) Buradaki sonuç (C)'dekine benzer. (E) E5, 20 saat sonra ölçümün sonuna kadar süren ciddi delaminasyon yaşadı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ölçüm	Hesaplama bölgesi	Migrasyon hızı (mm/h)
E1	0-24 saat	1.56
E2	0-24 saat	0.005
E3	0-24 saat	1.476
E4	0-19 saat	2.732
E5	0-24 saat	1.377

Tablo 1: Partikül migrasyon hızı sonuçları. Sonuçlarda, partikül göç hızı, numunenin stabilitesini belirli bir dereceye kadar yansıtabilen partikül çökeltme oranı olarak kabul edilebilir. Daha yüksek göç oranları daha zayıf istikrarı gösterir. Sonuçlardan, göç oranının E4 > E1 > E3 > E5 > E2 olarak sıralandığı ve bu sıranın kararlılık endeksi SI sonuçlarından biraz farklı olduğu görülebilir. Bunun nedeni, bu sonucun, numunenin hızlı çökelmesi sırasındaki partikül göç oranından ziyade, ölçüm periyodu boyunca numunedeki partiküllerin ortalama göç oranını yansıtmasıdır.

Discussion

TCM kararlılığının hızlı ve doğru bir şekilde değerlendirilmesi her zaman TCM araştırmasının odak noktası olmuştur. Ekstraksiyon işleminin iyileştirilmesini yönlendirmek için daha yararlı bilgiler sağlamak için, bu çalışma yakın kızılötesi tahribatsız bir teknoloji kullanarak bir numunenin stabilite ve kararsızlık mekanizmalarını analiz etmiştir.

Bu protokolde, önemli kararlılık parametreleri doğru MLS tarama verilerine dayanarak hesaplanır. MLS taramaları, numunenin iletimini (%T) ve geri saçılımını (BS%) gerçek zamanlı olarak toplayabilir ve kararlılık indeksini (SI), partikül boyutunu, parçacık göç hızını ve diğer önemli fiziksel parametreleri hesaplayabilir. Hesaplama formülü denklem (1)⁴ ile verilir:

TSI = (1)

burada x i, her ölçüm dakikası için ortalama iletimdir, x T, ortalama x _i, x _T = ( x ₁ + x₂ + ... x i + x_{i + 1} ... + x n)/n ve n, tarama sayısıdır. SI, numunenin kararlılığını yansıtan önemli bir parametredir ve SI değerindeki bir artış, stabilitede bir azalma olduğunu gösterir. SI, hesaplama için tüm ölçüm verilerini içerir, yani kısa vadede numunelerin kararlılığını tahmin etmek ve değerlendirmek için kullanılabilir.

Partikül boyutu hesaplaması Beer-Lambert yasasına dayanmaktadır. Hesaplama formülü denklem (2) ile verilir:

T(l,ri) = T₀ , l(d,φ) = (2)

burada ri , hücrenin iç çapıdır ve T₀ , sürekli fazın iletim ışık yoğunluğudur. Ölçülen iletim ışık yoğunluğuna (T), parçacık hacmi fraksiyonuna (φ) ve ayarlanan parametrelere göre partikül boyutu hesaplanabilir.

Sedimantasyon hızı denklem (3) kullanılarak hesaplanır:

(3)

V, parçacık göç hızıdır (ms−1), ρ _c sürekli faz yoğunluğudur (kgm−3), ρ_p parçacık yoğunluğudur (kgm⁻³), g yerçekimi sabitidir (9.81 ms⁻²), d ortalama parçacık çapıdır (μm), v sürekli faz viskozitesidir (cP) ve hacim yüzdesidir.

Isı ile ekstraksiyon işleminde, PE'deki çok sayıda hidrolize edilebilir tanen, çözünmeyen aglikon ellagik asidi serbest bırakarak hidrolize olur. Elagik asit düzlemsel polar olmayan bir molekül olduğundan, hidrofobik etkileşimler nedeniyle moleküller arası kümelenmeye ve çökelmeye uğrar ve bu, çözelti^1'deki çökelmenin ana nedenidir. Ekstraksiyon süresinin uzamasıyla, daha fazla ellagik asit oluşur, bu da numunenin zayıf stabilitesine neden olur ve ilgili numunenin berraklaştırma süresi kısalır. Bu, Şekil 4'teki sonuçlara iyi yansımıştır.

Yukarıdaki hesaplama sonuçlarına dayanarak, E3-E5 numunelerinde belirgin olan bileşenlerin veya parçacıkların toplanmasıyla ortaya çıkan yağışın, PE ekstraksiyon çözeltisinin kararsızlık mekanizmasının ana kaynağı olduğu sonucuna varılabilir. Ekstraksiyon işlemi sırasında çözünen polisakkaritler nedeniyle, E2 nispeten kararlıydı, çünkü çökeltme işlemi yüksek viskozitesi¹⁰ tarafından engellendi. Bununla birlikte, ekstraksiyon süresi uzadıkça, ellagik asit gibi büyük miktarlarda çözünmeyen bileşenler üretildi ve bu da kararlı durumun korunmasını zorlaştırdı. Genel olarak, hızlandırılmış kararsızlık ~ 12 saatte başladı ve ekstraksiyon süresi, proses optimizasyonu için çok önemli olan stabilite ile negatif bir korelasyona sahipti.

MLS yönteminin mevcut yöntemlere göre önemi aşağıdaki gibidir. İlk olarak, ölçüm sonuçları daha doğru ve gerçektir, çünkü yöntemin kullanımı kolaydır, numune ön işlemi gerektirmez ve ölçümler numuneye dokunmadan alınabilir. Yüksek konsantrasyonlu numunelerin bile herhangi bir seyreltmeye ihtiyacı yoktur. İkincisi, MLS yüksek hassasiyete sahiptir. Partikül konsantrasyonuna ve boyutuna bağlı olarak değişen hızlar, sıvı preparatta dağılan partiküllerdeki değişimin başlangıcında tespit edilebilir. Bu nedenle, görsel gözlemle karşılaştırıldığında, MLS ~ 200 kat daha fazla zaman verimlidir.

Sıcaklıktaki değişiklikler sistemin dağınık ışık yoğunluğunu etkileyebileceğinden, kurulumdan sonra numune sıcaklığının sabit tutulması gerektiği vurgulanmalıdır, bu da bir dengeleme süresi gerektirir. Ek olarak, ekstraktın stabilitesini uygun şekilde değerlendirmek için müdahale eden elementler (tıbbi malzeme kalıntıları gibi) uzaklaştırılmalıdır. Son olarak, parçacık boyutu ve foton serbest yolu gibi fiziksel parametreleri doğru bir şekilde belirlemek için testten önce fiziksel özellikleri hassas bir şekilde ölçmek önemlidir.

Bu yaklaşımın birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, uzun süreli depolamadan kaynaklanan oksidasyon, ekstraksiyon çözeltisinde ani renk değişikliklerine neden olur ve bu da yağış değerlendirmesini ve toplama davranışını etkileyebilir. Paralel numuneler gerektiğinde bazı numunelerin tutarlılığını garanti etmek zor olabilir, çünkü aynı anda birkaç numune ölçülemez. Bu teknoloji için gereken ekipman yatırımı nispeten pahalıdır, bu da uygulama ve tanıtımının önündeki birincil engeldir.

Gelecekte, bu yöntemin farmasötik preparatlar alanında, özellikle dispersiyon ve in vitro çözünme değerlendirmelerinde olağanüstü katkılar sağlayacağından eminiz. Lipozomlar, nanopartiküller ve in situ jeller gibi yeni ilaç dağıtım sistemlerini incelemek için kullanılabilir ve daha verimli, hızlı, basit ve kapsamlı olma avantajları nedeniyle, bu yöntem araştırma döngüsünü önemli ölçüde kısaltabilir^11,12. Ek olarak, büyük miktarda ilaç instabilite verisine dayanan bir stabilite tahmin modeli gerçekleştirilebilir. Bu teknoloji, gelecekte farmasötik araştırma ve geliştirmeye katkıda bulunabilecek diğer tespit teknikleriyle birleştirilebilir ve geliştirilebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com