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Summary
Aqui, apresentamos um método de avaliação da estabilidade baseado na tecnologia de espalhamento múltiplo de luz para avaliar a estabilidade de extratos da medicina tradicional chinesa.
Abstract
O intermediário de extração da medicina tradicional chinesa é o intermediário chave no processo de preparação, e sua estabilidade tem um impacto importante na eficácia e qualidade do produto final. No entanto, os métodos de avaliação de estabilidade existentes são frequentemente demorados e trabalhosos, exigindo observação de longo prazo e a operação de equipamentos complexos (como cromatografia líquida de alta eficiência), e é difícil obter mais informações físicas sobre a instabilidade do sistema. Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer uma tecnologia de análise de estabilidade rápida e precisa para a medicina tradicional chinesa. O espalhamento múltiplo de luz é um método analítico de ponta que pode avaliar com precisão e rapidez a estabilidade de medicamentos tradicionais chineses de uma maneira ambientalmente amigável sem alterar a natureza ou o estado da amostra ou usar reagentes orgânicos.
Neste trabalho, usando dados precisos de varredura de espalhamento múltiplo de luz, o presente protocolo adquiriu rapidamente as curvas de variação para espessura de camada, velocidade de migração de partículas e tamanho médio de partícula ao longo do tempo. Isso permitiu a identificação precisa do mecanismo e das características cruciais que causam a instabilidade do sistema em seus estágios iniciais. É importante ressaltar que o período de pesquisa para o processo de extração pode ser consideravelmente encurtado pela quantificação detalhada da estabilidade do sistema, o que também permite uma análise rápida, precisa e aprofundada dos efeitos de vários processos de extração na estabilidade de Phyllanthus emblica L.
Introduction
Na fabricação da medicina tradicional chinesa (MTC), a estabilidade dos intermediários de extração de MTC e preparações líquidas relacionadas sempre foi o foco da inspeção1. A eficácia clínica dos medicamentos, especialmente com polifenóis como princípio ativo primário, sofre devido a problemas significativos de estabilidade 2,3. Sanajon líquido oral e Nuodikang líquido oral são exemplos de casos típicos desta questão4. Portanto, é crucial aprender a usar ferramentas eficientes para avaliar e otimizar de forma rápida e precisa a estabilidade de intermediários líquidos no processo de produção de MTC. Acredita-se que Phyllanthus emblica L. (PE), uma planta medicinal amplamente difundida no Sudeste Asiático, tenha boas propriedades antioxidantes5, bem como ações anti-inflamatórias6, antibacterianas7 e antitumorais8. Durante o procedimento de extração térmica, os taninos em PE transformam-se violentamente9. Sob catálise com altas temperaturas, esses taninos hidrolisam-se rapidamente para produzir moléculas como o ácido gálico e o ácido elágico, que levam à instabilidade ou precipitação devido à sua baixa solubilidade1. Os métodos atuais para avaliar a estabilidade da MTC, como testes acelerados ou centrifugação, são geralmente complicados 4, o que limita o desenvolvimento de processos de preparaçãopertinentes.
Com base no princípio do espalhamento múltiplo de luz (MLS), estabelecemos um método rápido de avaliação da estabilidade de extratos de PFE e analisamos o mecanismo de instabilidade. MLS é um método de medição baseado na varredura de fontes de luz infravermelha próxima. Qualquer mudança no sistema de solução resulta em uma mudança na intensidade da luz. A luz incidente é espalhada quando é absorvida ou penetrada pelas partículas da amostra. O sistema registra o sinal luminoso de transmissão quando ele passa pela amostra; Se a transmitância da luz da amostra for fraca, o sistema regista o sinal luminoso de retroespalhamento. Em comparação com a observação visual, isso pode economizar muito tempo1 e pode analisar o fenômeno de instabilidade de forma rápida e precisa em detalhes, fornecendo assim informações mais úteis para orientar a otimização do processo de extração.
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Protocol
1. Preparação do extrato
- Pese com precisão uma quantidade adequada de PE e adicione 10x (peso) de água deionizada para extração de refluxo.
- Colocar cinco amostras para extração do refluxo por 0 h (E1), 0,5 h (E2), 1 h (E3), 1,5 h (E4) e 2 h (E5) após a pesagem.
- Após a extração, resfriar as amostras à temperatura ambiente e pesar para compensar o peso perdido para garantir a consistência com os pesos pré-extração.
- Centrifugar as amostras a 8.581 × g durante 10 min para garantir a remoção de material insolúvel e resíduos de ervas da solução da amostra.
- Utilizar uma pipeta para adicionar 20 ml de solução de amostra ao frasco de amostra para garantir que a solução adicionada de cada vez se encontra à mesma altura.
NOTA: Evite contaminação, como impressões digitais, na parte de digitalização do frasco de amostra, certifique-se de que o frasco de amostra esteja limpo e verifique se há arranhões visíveis na superfície do frasco. Ao adicionar a solução da amostra, tenha cuidado para não derramar ou espirrar no frasco da amostra e certifique-se de que o nível de líquido esteja na mesma altura em cada frasco.
2. Operação do instrumento
- Ligue o instrumento de detecção MLS e aqueça-o por 30 minutos.
- Clique no botão Criar arquivo no menu superior (ou clique no botão Arquivo | Nova função de arquivo) para criar um novo arquivo de teste.
- Clique no botão Mostrar temperatura do laboratório Turbiscan no menu superior para definir a temperatura alvo do instrumento para 25 °C.
NOTA: A temperatura definida do instrumento deve ser superior à temperatura ambiente; caso contrário, a temperatura da amostra será afetada pela temperatura ambiente. - Clique em Program Scan no menu superior para entrar no programa de análise de configuração . Adicione o programa à lista e, na barra de tarefas, adicione 5 min como um ciclo, digitalize por 48 h para a sequência de análise e defina o tempo de equilíbrio para 20 min. Selecione este programa de análise para todas as medições subsequentes.
- Mova o frasco de amostra preparado para o sistema de detecção MLS. Depois de configurar o programa, clique em Iniciar para iniciar a medição.
NOTA: Tenha cuidado para não agitar o frasco de vidro ao carregar a amostra. A medição só pode ser iniciada após o equilíbrio entre a temperatura da amostra e a temperatura de ajuste.
3. Configuração do programa de análise de espalhamento de luz múltipla
- Após a coleta de dados, clique na lista de parâmetros de cálculo para definir os parâmetros ópticos para calcular o índice de estabilidade (IS), o tamanho das partículas e a velocidade de migração das partículas.
- Defina os parâmetros ópticos da seguinte forma: a intensidade de transmissão de luz de fase contínua (T0) como 99,99% (água), o índice de refração de fase dispersa (np) como 1,36 e o índice de refração de fase contínua (nf) como 1,33.
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Representative Results
A Figura 1 mostra o princípio da medida da luz múltipla e o significado dos resultados coletados. Nos resultados dos espectros de MLS (Figura 2), a abscissa foi a altura da célula da amostra, e a ordenada foi a intensidade de transmissão (T%) e retroespalhamento (BS%). Através do cálculo dos resultados dos espectros MLS, o sistema pode obter as mudanças nos principais parâmetros físicos da amostra durante o período de medição, incluindo o valor médio de transmissão delta (ΔT) (Figura 3A), o caminho livre de fótons (Figura 3B), o SI (Figura 3C) e o tamanho da partícula (Figura 3D). Com a extensão do tempo de medição, os espectros de MLS de extratos estáveis flutuam pouco ou nada, e seus parâmetros físicos, incluindo ΔT, caminho livre de fótons e tamanho de partícula, tendem a ser estáveis.
Os resultados típicos de instabilidade da amostra são mostrados na Figura 2A,C-E. Os resultados espectrais das amostras estáveis tenderam a ser consistentes em todos os tempos de varredura, como mostrado na Figura 2B, que é uma característica típica das amostras estáveis. Para quantificar ainda mais os parâmetros de estabilidade, o SI pode ser usado para avaliação. O protocolo atual permite a rápida identificação da estabilidade sob diferentes métodos de extração baseados no SI (Figura 3C) e a análise do mecanismo de instabilidade. Deve-se notar que menores valores de IE estão associados a melhor estabilidade. A amostra é considerada estável se o SI for <10 dentro do período de varredura. Comparando-se os valores de SI, foi possível distinguir com precisão as estabilidades das cinco amostras e obter os espectros característicos de estabilidade relevantes (Figura 4). A taxa de migração de partículas (Tabela 1) combinada com o parâmetro acima pode fornecer informações adicionais sobre o mecanismo de instabilidade da amostra.
Figura 1: Princípio de análise da MFEL. O MLS usa luz infravermelha próxima pulsada como fonte de luz (comprimento de onda: 880 nm), e dois detectores ópticos síncronos detectam a luz de transmissão (T, 0° da radiação incidente, sensor de transmissão) e a luz de retroespalhamento (BS, 135° da radiação incidente, detector de retroespalhamento) que passa pela amostra, respectivamente. A fonte de luz, o detector de luz de transmissão e o detector de luz de retroespalhamento constituem a sonda de medição. A medição da parte inferior para a parte superior da célula de amostra compreende uma varredura. Qualquer instabilidade na amostra terá um ligeiro impacto nas intensidades dos sinais T e BS . Esse impacto é registrado e analisado para caracterizar vários fenômenos instáveis, incluindo floculação, estratificação e sedimentação4. Através do cálculo de múltiplos resultados de varredura, o mecanismo e a velocidade da instabilidade do sistema de solução no estágio inicial de instabilidade podem ser analisados com precisão, e a curva de relação da espessura da camada (camada de sedimento, camada flutuante e camada de clarificação) com o tempo, bem como a curva de relação da velocidade de migração de partículas e tamanho de partícula com o tempo, pode ser obtido. Abreviação: MLS = espalhamento múltiplo de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Espectros de MLS (transmissão e retroespalhamento) do extrato de PE com diferentes métodos de extração. (A-E) Espectros de MLS de E1-E5. A partir dos dados espectrais, pode-se inferir grosseiramente que (B) a amostra E2 flutuou menos, indicando que a amostra foi mais estável, enquanto (A) E1 pode ter tido turbidez devido ao declínio geral da luz de transmissão. (C-E) As amostras E3-E5 foram bastante instáveis, e os dados espectrais das amostras em diferentes alturas foram diferentes, indicando que a estratificação ocorreu no período mais tardio. Abreviações: MLS = espalhamento múltiplo de luz, PE = Phyllanthus emblica L., EN = extrato obtido pelo método N. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados da análise dos espectros MLS . (A) Com o passar do tempo, o valor de T torna-se maior, e a amostra fica mais instável. Para E3 e E4, o nível de ΔT retornou ao do estágio anterior no final, indicando que a agregação e a precipitação ocorreram nesses extratos. O ΔT de E5 permaneceu em um nível baixo após a turbidez, indicando que E5 pode ter tido uma grande quantidade de sedimentação. (B) A tendência no caminho livre de fótons pode refletir as mudanças na luz transmitida da amostra. (C) A estabilidade de vários extratos flutuou continuamente ao longo do tempo, sendo E2 > E1 > E5 > E3 > E4 a ordem de estabilidade ao longo do período de armazenamento. (D) Mudanças dinâmicas no tamanho das partículas podem revelar a agregação de partículas na amostra. Os resultados mostram que o tamanho das partículas de todas as amostras mudou consideravelmente dentro de 8-20 h, com o tamanho das partículas de E3 e E5 excedendo até mesmo a faixa de medição. Assim, esta etapa é crucial para a formação de agregados instáveis de moléculas ou partículas na amostra. Da mesma forma, no estágio final, à medida que as partículas começaram a se nuclear e continuam a se agregar, uma redução no tamanho das partículas foi eventualmente observada depois que partículas suficientes formaram grandes aglomerados e precipitaram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Instabilidade dos extratos de PE obtidos por diferentes métodos de extração. O resultado leva tempo, pois a abscissa e a cor representam a intensidade da luz transmitida ou retroespalhada. O resultado pode refletir diretamente a situação real de turbidez e estratificação das amostras em diferentes momentos e alturas. A faixa de cromaticidade no topo de cada resultado representa os valores de intensidade luminosa correspondentes a cores diferentes, onde a parte azul representa T% e a parte marrom representa BS%. (A) O T% de E1 começou a declinar após 16 h, indicando que a amostra estava turva, e todo o processo não delaminava nem precipitava. (B) O T% de E2 foi consistente durante todo o período de mensuração, indicando que a amostra estava estável. (C) E3 estava turvo em 16 h, e seu BS% aumentou subitamente em 20 h, o que indica que as partículas da amostra se reuniram, estratificaram e precipitaram naquele momento. (D) O resultado aqui é semelhante ao de (C). (E) E5 sofreu delaminação severa após 20 h, que durou até o final da medição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Medição | Zona de computação | Taxa de migração (mm/h) |
| E1 | 0-24 h | 1.56 |
| E2 | 0-24 h | 0.005 |
| E3 | 0-24 h | 1.476 |
| E4 | 0-19 h | 2.732 |
| E5 | 0-24 h | 1.377 |
Tabela 1: Resultados da taxa de migração de partículas. Nos resultados, a taxa de migração de partículas pode ser considerada como a taxa de precipitação das partículas, que pode refletir a estabilidade da amostra até certo ponto. Taxas de migração mais altas indicam menor estabilidade. Pode-se observar pelos resultados que a taxa de migração foi classificada como E4 > E1 > E3 > E5 > E2, e esta ordem é um pouco diferente dos resultados para o índice de estabilidade, SI. Isso ocorre porque esse resultado reflete a taxa média de migração de partículas na amostra durante o período de medição, em vez da taxa de migração de partículas durante a rápida precipitação da amostra.
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Discussion
A avaliação rápida e precisa da estabilidade da MTC sempre foi um foco da pesquisa da MTC. Para fornecer mais informações úteis para direcionar a melhoria do processo de extração, este estudo analisou os mecanismos de estabilidade e instabilidade de uma amostra usando uma tecnologia não destrutiva no infravermelho próximo.
Nesse protocolo, os parâmetros importantes de estabilidade são calculados com base em dados precisos da varredura da MLS. Os exames de MLS podem coletar a transmissão (T%) e o retroespalhamento (BS%) da amostra em tempo real e calcular o índice de estabilidade (SI), o tamanho das partículas, a velocidade de migração das partículas e outros parâmetros físicos importantes. A fórmula de cálculo é dada pela equação (1)4:
ETI = 
(1)
onde x i é a transmissão média para cada minuto de medição, x T é a média x i, x T = (x 1 + x2 + ... xi + xi+1 ... + x n)/n, e n é o número de varreduras. O IE é um parâmetro importante que reflete a estabilidade da amostra, e um aumento no valor do IE indica uma diminuição na estabilidade. O SI inclui todos os dados de medição para cálculo, o que significa que pode ser usado para prever e avaliar a estabilidade das amostras a curto prazo.
O cálculo do tamanho das partículas é baseado na lei de Beer-Lambert. A fórmula de cálculo é dada pela equação (2):
T(l,ri) = T0 
, l(d,φ) = 
(2)
onde ri é o diâmetro interno da célula, e T0 é a intensidade da luz de transmissão da fase contínua. De acordo com a intensidade luminosa de transmissão medida (T), a fração de volume de partícula (φ) e os parâmetros definidos, o tamanho da partícula pode ser calculado.
A taxa de sedimentação é calculada usando a equação (3):
(3º)
V é a taxa de migração de partículas (ms−1), ρ c é a densidade de fase contínua (kgm− 3), ρp é a densidade de partículas (kgm−3), g é a constante de gravidade (9,81 ms−2), d é o diâmetro médio da partícula (μm), v é a viscosidade de fase contínua (cP) e é a porcentagem de volume.
No processo de extração com calor, um grande número de taninos hidrolisáveis no PE hidrolisa, liberando o ácido elágico aglicona insolúvel. Como o ácido elágico é uma molécula planar apolar, ele sofre agregação intermolecular e precipitação devido a interações hidrofóbicas, sendo esta a principal causa de precipitação na solução1. Com a extensão do tempo de extração, mais ácido elágico é formado, resultando em baixa estabilidade da amostra, e o tempo de clarificação da amostra correspondente é encurtado. Isso está bem refletido nos resultados da Figura 4.
Com base nos resultados do cálculo acima, pode-se concluir que a precipitação provocada pela agregação de componentes ou partículas, que é evidente nas amostras E3-E5, é a principal fonte do mecanismo de instabilidade da solução de extração de PE. Devido aos polissacarídeos dissolvidos durante o processo de extração, o E2 foi relativamente estável, pois o processo de precipitação foi prejudicado por sua alta viscosidade10. No entanto, como o período de extração foi prolongado, grandes quantidades de componentes insolúveis, como o ácido elágico, foram produzidas, dificultando a manutenção do estado estacionário. No geral, a instabilidade acelerada começou em ~12 h, e a duração da extração teve uma correlação negativa com a estabilidade, que foi crucial para a otimização do processo.
A importância do método MLS em relação aos métodos existentes é a seguinte. Primeiro, os resultados das medições são mais precisos e autênticos, uma vez que o método é simples de usar, não requer pré-tratamento da amostra e as medições podem ser feitas sem tocar na amostra. Mesmo amostras com altas concentrações não precisam de diluição. Em segundo lugar, a MLS tem alta sensibilidade. As velocidades de mudança com base na concentração e tamanho das partículas podem ser detectadas no início da mudança nas partículas dispersas na preparação líquida. Assim, em comparação com a observação visual, a MLS é ~200x mais eficiente em termos de tempo.
Uma vez que mudanças de temperatura podem afetar a intensidade da luz espalhada do sistema, deve-se enfatizar que a temperatura da amostra deve ser mantida constante após a instalação, o que requer um tempo de equilíbrio. Além disso, os elementos interferentes (tais como resíduos de materiais medicinais) devem ser removidos para avaliar adequadamente a estabilidade do extracto. Finalmente, é essencial medir precisamente as características físicas antes do teste para determinar com precisão os parâmetros físicos, como o tamanho da partícula e o caminho livre de fótons.
Há várias limitações nessa abordagem. Por exemplo, a oxidação do armazenamento a longo prazo causa mudanças bruscas de cor na solução extratora, o que pode afetar a avaliação da precipitação e o comportamento da agregação. Pode ser um desafio garantir a consistência de algumas amostras quando amostras paralelas são necessárias, uma vez que várias amostras não podem ser medidas ao mesmo tempo. O investimento em equipamentos necessários para essa tecnologia é relativamente caro, o que é a principal barreira para sua aplicação e promoção.
No futuro, estamos confiantes de que este método fará contribuições notáveis no campo das preparações farmacêuticas, particularmente em avaliações de dispersão e dissolução in vitro. Pode ser utilizado para estudar novos sistemas de liberação de fármacos, como lipossomas, nanopartículas e géis in situ, e devido às suas vantagens de ser mais eficiente, rápido, simples e abrangente, poderia encurtar consideravelmente o ciclo de pesquisa11,12. Além disso, um modelo de predição de estabilidade baseado em uma grande quantidade de dados de instabilidade de medicamentos poderia ser realizado. Essa tecnologia poderá ser acoplada e aprimorada com outras técnicas de detecção no futuro, o que poderá contribuir para a pesquisa e o desenvolvimento farmacêutico.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81973493); Equipe Nacional Interdisciplinar de Inovação da Medicina Tradicional Chinesa (ZYYCXTD-D-202209); Sanajon Pharmaceutical Group Chengdu University of TCM produção, estudo e Projeto de Laboratório Conjunto de Pesquisa (2019-YF04-00086-JH); e Projeto Financiado pelo Plano de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2021YFN0100). Os autores agradecem ao Instituto Inovador de Medicina Chinesa e Farmácia da Universidade de Chengdu da MTC por seu apoio técnico no trabalho de espectrometria de massa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable electric heating jacket | Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd | MH-1000 | www.keweiyq.com |
| Analytical balance(1/10000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| CNC ultrasonic instrument | Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd | KQ-500DE | www.ks-csyq.com |
| GL-16 high-speed centrifuge | Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd | 18091403 | www.sklxj.com |
| Phyllanthus emblica L. | Hehuachi medicinal materials market | YJL2004 | Produced in Yunnan |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| UPR-II-5T ultra-pure water device | Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd | Z16030559 | www.ccdup.com |
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Medicina Phyllanthus emblica L. estabilidade espalhamento múltiplo de luz extratoErratum
Formal Correction: Erratum: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods
Posted by JoVE Editors on 08/04/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods. The Authors section was updated from:
Haozhou Huang1
Mengqi Li2
Chuanhong Luo3
Sanhu Fan4
Taigang Mo4
Li Han3
Dingkun Zhang3
Junzhi Lin5
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Sichuan Nursing Vocational College
3School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China
4Sanajon Pharmaceutical Group
5TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
to
Haozhou Huang1,2
Mengqi Li3
Chuanhong Luo4
Sanhu Fan5
Taigang Mo5
Li Han4
Dingkun Zhang4
Junzhi Lin6
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3Sichuan Nursing Vocational College
4State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Sanajon Pharmaceutical Group
6TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
