Summary
Dette manuskript præsenterer et sæt meget reproducerbare adfærdstests for at validere en Angelman syndrom musemodel.
Abstract
Dette manuskript beskriver et batteri af adfærdsmæssige tests til rådighed for at karakterisere Angelman syndrom (AS) -lignende fænotyper i en etableret murin model af AS. Vi bruger rotarod-læringsparadigmet, detaljeret ganganalyse og redebygningstest til at opdage og karakterisere dyremotoriske svækkelser. Vi tester dyrs følelsesmæssighed i det åbne felt og forhøjede plus labyrinttest samt påvirkningen i haleophængstesten. Når AS-mus testes i testen i det åbne felt, skal resultaterne fortolkes med forsigtighed, da motoriske dysfunktioner påvirker museadfærd i labyrinten og ændrer aktivitetsscore.
Reproducerbarheden og effektiviteten af de præsenterede adfærdstests er allerede blevet valideret i flere uafhængige Uba3a-muselinjer med forskellige knockout-varianter, hvilket etablerer dette sæt tests som et fremragende valideringsværktøj i AS-forskning. Modeller med den relevante konstruktion og ansigtsvaliditet vil berettige yderligere undersøgelser for at belyse sygdommens patofysiologi og give udvikling af årsagsbehandlinger.
Introduction
Angelman syndrom (AS) er en sjælden neurodevelopmental sygdom. Den mest almindelige genetiske oprindelse af AS er en stor deletion af 15q11-q13-regionen af det maternelt afledte kromosom, som findes hos næsten 74% af patienterne1. Sletning af denne region forårsager tab af UBE3A, det vigtigste forårsagende gen af AS, der koder for en E3 ubiquitin ligase. Den faderlige allel af UBE3A-genet i neuroner bringes til tavshed i en proces kendt som prægning. Som følge heraf tillader faderlig prægning af genet kun moderekspression i centralnervesystemet (CNS)2. Derfor fører UBE3A-gensletning fra det maternelle afledte kromosom til udvikling af AS-symptomer. Hos mennesker manifesterer AS sig omkring 6 måneders alderen med udviklingshæmning, der vedvarer gennem alle udviklingsstadier og resulterer i alvorlige svækkende symptomer hos berørte individer 3,4. De centrale symptomer på lidelsen omfatter underskuddet af fine og grove motoriske færdigheder, herunder rykkende ataxisk gang, alvorlig talehæmning og intellektuel handicap. Ca. 80% af AS-patienterne lider også af søvnforstyrrelser og epilepsi. Til dato er den eneste tilgængelige behandling symptomatiske lægemidler, som reducerer epileptiske anfald og forbedrer søvnkvaliteten1. Derfor vil udviklingen af robuste dyremodeller med reproducerbare adfærdsmæssige fænotyper sammen med raffineret fænotypeanalyse være afgørende for at belyse lidelsens patofysiologiske mekanismer og opdage effektive lægemidler og behandlinger.
Kompleksiteten af den menneskelige lidelse, der påvirker CNS, kræver, at modelorganismer besidder et sammenligneligt genom, fysiologi og adfærd. Mus er populære som modelorganisme på grund af deres korte reproduktionscyklus, lille størrelse og relative lethed ved DNA-modifikation. I 1984 foreslog Paul Willner tre grundlæggende valideringskriterier for sygdomsmodellen: konstruktionen, ansigtet og prædiktiv validitet, som bruges til at bestemme modellens værdi5. Simpelthen afspejler konstruktiv validitet de biologiske mekanismer, der er ansvarlige for lidelsens udvikling, ansigtsvaliditulerer dens symptomer, og prædiktiv validitet beskriver modelresponsen på terapeutiske lægemidler.
For at overholde ovenstående principper har vi valgt den mest almindelige genetiske ætiologi, en stor deletion af moderens 15q11.2-13q locus inklusive UBE3A-genet, for at skabe AS-modelmus. Vi brugte CRISPR/Cas9-teknikken til at slette et 76.225 bp langt område, der spænder over hele UBE3A-genet, og som omfatter både de kodende og ikke-kodende elementer i genet, i mus fra en C57BL/6N-baggrund6. Vi opdrættede derefter dyrene for at opnå UBE3A+/− heterozygote mus. Til ansigtsvalidering af modellen brugte vi dyr fra krydsninger af UBE3A+/− hunner og vildtypehanner til at få UBE3A+/- afkom (stamme kaldet C57BL/6NCrl-UBE3A
De adfærdstests, der præsenteres her, tilhører de almindelige fænotypeværktøjer i genetisk forskning takket være deres høje prædiktive værdi og tilstrækkelige konstruktionsvaliditet 8,9,10. Vi brugte disse tests til at validere en musemodel af AS ved at rekapitulere kernesymptomer på den menneskelige sygdom på en reproducerbar, aldersuafhængig måde. Dyrets følelsesmæssighed blev evalueret i den forhøjede plus labyrint og åbne feltforsøg. Begge disse tests er baseret på konflikten mellem tilgang og undgåelse, hvor dyr udforsker et nyt miljø på jagt efter mad, husly eller parringsmuligheder, samtidig med at de undgår angstfyldte rum11. Derudover bruges den åbne felttest til at teste en mus' bevægelsesaktivitet8. Halesuspensionstesten bruges i vid udstrækning i depressionsforskning til at screene for nye antidepressive lægemidler eller depressive-lignende fænotyper i muse-knockout-modeller12. Denne test evaluerer den fortvivlelse, som dyr udvikler over tid i en uundgåelig situation. Motorindlæring og detaljerede gangegenskaber blev bestemt på henholdsvis rotarod og i DigiGait. Dyrs udholdenhed på accelerationsstangen karakteriserer dens balance- og bevægelseskoordinationsevner, mens detaljeret analyse af en mus' trinmønstre er en følsom evaluering af neuromuskulære svækkelser forbundet med mange neurogenerative bevægelsesforstyrrelser 13,14,15. Nestlet makuleringstesten er en del af standardmetoden til påvisning af impulsiv adfærd hos gnavere, og da den bruger naturlig gnaveropbygningsadfærd, indikerer den dyrets trivsel16,17.
Størrelsen af forsøgsgrupperne var et resultat af et kompromis for at imødekomme 3R-regelkravene og effektiv brug af koloniavlspræstationer. For at opnå statistisk styrke havde grupperne imidlertid ikke færre end 10 individer på grund af etableringen af en tilstrækkelig mængde ynglepar. Desværre resulterede avlspræstationen ikke altid i et tilstrækkeligt antal dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr og eksperimenter, der blev anvendt i denne undersøgelse, gennemgik etisk gennemgang og blev udført i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63 / EU. Undersøgelsen blev godkendt af den tjekkiske centralkommission for dyrevelfærd. Mus blev anbragt i individuelt ventilerede bure og holdt ved en konstant temperatur på 22 ± 2 °C med en 12 timers lys/mørk cyklus. Musene blev forsynet med musechow og vand ad libitum. Musene blev anbragt i grupper på tre til seks dyr pr. Bur. Der blev ikke udført anden håndtering end vejning før testen. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Generelle betragtninger før og under prøvning
BEMÆRK: Af hensyn til klarheden og forståeligheden fremsættes generelle bemærkninger før beskrivelsen af de enkelte prøver. Dette gælder for hver test, med den åbenlyse undtagelse af nestlet makuleringstesten, som udføres i et husrum og ikke kræver brug af eksperimentelt udstyr.
- Opstald dyr i forskningsanlægget i mindst 14 dage før testning for at minimere stress som følge af transport og ændringer i miljøet.
- Registrer dyrevægte før test, da vægt er en almindelig forvirrende faktor i adfærdsforskning.
- Lad dyrene akklimatisere sig i forsøgsrummet i mindst 1 time efter transporten fra deres staldrum for at minimere transportbelastningen, når en sådan transport finder sted (dvs. alle de nedenfor beskrevne test undtagen netopæling, som udføres i staldrummet).
- Mærk hvert dyr på halen med en giftfri, vandbaseret markør for at muliggøre hurtig identifikation under forsøget.
- Al urin og afføring, som dyrene har deponeret i forsøgsapparaturet under forsøget efter hvert forsøg, fjernes.
- Alle forsøgsapparater aftørres med 75% alkohol før og efter hvert testet dyr. Rengøringen fjerner olfaktoriske spor aflejret under test og hjælper med at bevare stabile eksperimentelle forhold.
- Transporter dyrene fra deres hjemmebur til forsøgsapparatet med så stor omhu som muligt, helst i en lille uigennemsigtig beholder, og slip dem derefter frit, medmindre andre manipulationer er nødvendige.
- Anbring hvert dyr i et midlertidigt bur efter testning for at forhindre dem i at påvirke de utestede dyr i hjemmeburet.
- Test mænd og kvinder på hinanden følgende dage. Skift rækkefølgen af forskellige genotyper under test for at opveje uforudsigelige miljøfaktorer mellem forsøgsgrupperne.
- Sæt dyrene tilbage i deres bur, når alle dyrene er blevet testet, og sæt dem tilbage i staldrummet.
- I tilfælde af gentagen dyreforsøg skal der opretholdes mindst 1 dags interval mellem hver test.
2. Adfærdsmæssige tests
- Forhøjet plus labyrint (EPM)
BEMÆRK: Begge køn af C57BL/6NCrl og UBE3AmGenedel/+ musestammer blev testet i dette studie i alderen 9-12 uger. Dyrenes vægt varierede fra 22 til 36 g for mænd og 18 til 28 g for kvinder på testtidspunktet.- Placer den plusformede labyrint på testplatformen lige under kameraet. Brug potentiometeret på væggen til at indstille lysintensiteten til 70 lux i midten ved hjælp af et luxometer, med sensoren placeret i midten af labyrinten under justering.
- Åbn softwaren ved at dobbeltklikke på Viewer softwareikonet og indlæse konfigurationen til EPM-test ved at klikke på ikonet øverst til venstre på fanen Konfiguration . Indlæs EPM-pluginet fra menuen Filer . Udfyld dyreoplysningerne ved hjælp af computerens tastatur - dyre-id, genotype, køn og eksperimentoplysningerne (dato, lysintensitet) - i de tilsvarende felter på fanen Eksperiment . Kontroller, om zonens position, åbne arme og lukkede arme er korrekt konfigureret. Ved hjælp af en visuel kontrol og computermus skal du sikre dig, at de virtuelle skitserede zoner matcher de tilsvarende EPM-zoner på videoeksemplet.
- EPM er en test, der bruges til at evaluere et dyrs generelle angst, som er baseret på tilgang-undgå konflikt. Gnavere har naturligvis en tendens til at undgå veloplyste ubeskyttede områder (åbne arme) til fordel for sikrere (lukkede arme). Da denne fuldautomatiske test er baseret på et videosporingssystem, skal softwaren automatisk beregne den tid, der bruges i hver zone samt antallet af indgange.
- Under testen optages dyrene på video via et industrielt, infrarødt lysfølsomt kamera. Lad softwaren registrere dyrets position i realtid under optagelsen. Herefter skal softwaren automatisk evaluere dyrets spor for at beregne alle parametre, der beskriver dyrets adfærd i labyrinten. Brug tiden i de angstfremkaldende åbne arme og procentdelen af åbne arme besøg til at evaluere niveauet af angstlignende adfærd hos dyr.
BEMÆRK: Den specialfremstillede labyrint er lavet af infrarødt lysgennemtrængeligt materiale og placeres på en lysdiode (LED) infrarød lyskildeplatform. - Placer musemarkøren på pilikonet øverst til venstre på fanen Erhvervelse . Fjern et dyr fra hjemmeburet med hånden og læg det forsigtigt i midten af EPM. Start protokollen ved at venstreklikke på computermusen og forlade eksperimentrummet med det samme.
- Når optagelsesprotokollen er færdig efter 5 minutters fri labyrintudforskning, skal du gemme de registrerede data ved at klikke på OK i vinduet, der vises efter protokolafslutning, navngive filen korrekt og klikke på Gem. Eksporter resultaterne til en .csv fil for hvert testet dyr til offline-analyse ved at klikke på ikonet i venstre lodrette panel på fanen Dataanalyse .
- Fjern dyret fra labyrinten med hånden og læg det i det midlertidige holdebur. Fortsæt med test af alle dyr på samme måde. Kopier resultaterne for alle testede dyr til en Notesblok-fil til offline-analyse ved at klikke på ikonet Kopier resultater på fanen Elevated Plus-labyrint-plugin .
BEMÆRK: Softwaren og hardwaren kan variere, og de relevante manualer skal følges. Derudover kan den eksperimentelle opsætning, såsom belysning eller computerplacering, variere afhængigt af opførelsen af dyreanlægget.
- Test af åbent felt (OF)
BEMÆRK: Den åbne felttest vurderer et dyrs samlede bevægelse, som udløses af udforskende adfærd i et nyt miljø. Derudover bruges det almindeligvis som et screeningsværktøj til at opdage generel angst i et ubeskyttet, godt oplyst rum. Dette er en fuldautomatisk test, der bruger et videosporingssystem, som også blev brugt i den forrige test.- Placer de fire OF-testbokse på testplatformen lige under kameraet. Brug potentiometeret på væggen til at indstille lysintensiteten til 200 lux i midten af hver OF-test ved hjælp af et luxometer, med sensoren placeret i midten af hver kasse under justering.
- Åbn softwaren ved at dobbeltklikke på Viewer softwareikonet og indlæse konfigurationen til OF-test ved at klikke på ikonet øverst til venstre på fanen Konfiguration . Udfyld dyreoplysningerne ved hjælp af computerens tastatur - dyre-id, genotype, køn og eksperimentoplysninger (dato, lysintensitet) - i de tilsvarende felter på fanen Eksperiment . Kontroller, om zonens position (center og periferi) matcher OF-testboksene, og juster dem om nødvendigt. Ved hjælp af en visuel kontrol og computermus skal du sikre dig, at de virtuelle skitserede center- og periferizoner matcher de tilsvarende OF-testzoner på videoeksemplet.
- Under forsøget optages dyrene på video via et industrielt, infrarødt lysfølsomt kamera. Lad softwaren registrere dyrets position i realtid under optagelse og automatisk evaluere dyrets spor for at beregne alle parametre, der beskriver dyrets adfærd i OF-testboksen. Den tilbagelagte afstand, gennemsnitshastighed og hviletid er parametre, der bruges til at evaluere dyreaktivitet i et nyt miljø, mens antallet af centerposter og varighed i centret beskriver angstlignende adfærd hos dyr.
BEMÆRK: Den specialfremstillede labyrint er lavet af infrarødt lysgennemtrængeligt materiale og placeres på en LED infrarød lyskildeplatform. - Placer musemarkøren på pilikonet øverst til venstre på fanen Erhvervelse . Fjern fire dyr fra hjemmeburet med hånden og placer dem forsigtigt i hjørnet af hver OF testboks. Start protokollen ved at venstreklikke på en computermus og straks forlade forsøgsrummet.
- Når protokollen er færdig efter 10 minutters gratis labyrintudforskning, skal du gemme dataene ved at klikke på OK i det vindue, der vises efter protokollens afslutning, navngive filen korrekt og klikke på Gem. Eksporter resultaterne til en .csv fil for hvert testet dyr til offlineanalyse ved at klikke på ikonet i venstre lodrette panel på fanen Dataanalyse .
- Fjern dyrene fra labyrinten med hånden og læg dem i det midlertidige holdebur. Fortsæt med test af alle dyr på samme måde. Analysér de eksporterede data.
BEMÆRK: Softwaren og hardwaren kan variere, og de relevante manualer skal følges. Derudover kan den eksperimentelle opsætning, såsom belysning, antal labyrinter eller computerplacering, variere afhængigt af opførelsen af dyreanlægget.
- Haleophængsprøvning (TST)
BEMÆRK: Tre mus testes samtidigt med det automatiske haleophængsapparat.- Hold rummets lysintensitet ved 100-120 lux.
- Tilslut TST-systemet til computeren via et USB-kabel. Indsæt USB-donglen i computeren, og start softwaren ved at dobbeltklikke på BIO-TST-softwareikonet . På fanen Indstillinger under Global skal du justere anskaffelsens varighed til 360 sekunder. Vælg Ny liste over forsøgspersoner under fanen Eksperiment , og opret en ny eksperimentfil og en ny liste over testede forsøgspersoner ved at følge instruktionerne på den åbne fane.
- Start kørslen ved at klikke på Start kørsel | fortsæt på fanen Anskaffelse . Forbered dyrene til testen ved at vikle enkeltsidet tape, såsom transpore medicinsk tape, omkring 3/4 af dyrets hale, startende fra bunden.
- Før suspensionskrogen gennem båndet og suspender dyret på den. Start med at indsamle data for hvert dyr individuelt umiddelbart efter at have hængt det på krogen ved at klikke på Start-ikonet under den visualiserede position for hvert dyr og observere dyrene kontinuerligt under testen.
- Når erhvervelsen for det første sæt dyr er afsluttet, skal du klikke på Start det næste løb, fjern dyrene fra krogen, løsn klæbebåndet fra deres haler, skær forsigtigt båndet med en saks langs halen og læg dyrene i det midlertidige holdebur.
- Rengør apparatet med 75% alkohol og papirvæv og fortsæt med resten af dyrene som beskrevet ovenfor. På fanen Analyse skal du vælge de sidste 4 minutter af anskaffelsen til analyse, derefter vælge alle gyldige kørsler i analyseperioden, klikke på Analysér valgte emner, vælge det ønskede dataformat og klikke på Eksportér valgte data for at eksportere de indsamlede data til yderligere analyse.
OBS: Testen varer 6 min. I løbet af de første 2 minutter vil dyrene kæmpe hårdt, men da fortvivlelsesreaktionen bliver fremherskende i løbet af de resterende 4 minutter, tages immobilitetstiden i denne periode til analysen. Software og hardware kan variere, og de relevante manualer skal følges. Derudover kan selve udstyret variere (f.eks. Antal testpositioner).
- Ganganalyse
- Tænd løbebåndet, og indstil manuelt bæltehastigheden til 20 cm/s på udstyrspanelet ved at klikke på + eller - symbolet ved siden af hastighedsindikatoren. Tænd apparatets lys ved at dreje knappen med uret. Start DigiGait Imager-softwaren ved at dobbeltklikke på softwareikonet, og indstil lukkertiden til 100 for albinomus eller 130 for sorte/mørke mus i feltet for lukkertid.
- Fjern det første dyr fra hjemmeburet med hånden og læg det forsigtigt på løbebåndet. Luk døren til dyrerummet. Undersøg visuelt for at sikre, at dyrets hale ikke sidder fast mellem døren og rammen.
- Lad musen udforske løbebåndsbæltet inden optagelse. Sørg for, at dyret er i stand til at udføre testen ved at indstille løbebåndet til en langsom ganghastighed i ~ 3 s og derefter stoppe det og observere dyret kontinuerligt.
- Start bæltet ved at trykke på Start-knappen på udstyrspanelet, og optag i ca. 10 sekunder. Sørg for, at en klar og flydende bevægelse på mindst 10-15 trin kan observeres. Stop bæltet ved at trykke på Stop-knappen på udstyrspanelet, og returner musen til det midlertidige holdebur manuelt.
- Vis optagelsen for en sekvens af billeder med flydende trin ved at klikke på AFSPIL og gennemse optagelsen med det visuelle kontrolelement i EDIT-tilstand . Vælg 10-15 flydende bevægelser ved manuelt at skrive deres start- og slutrammenumre i de relevante felter (Fra ramme# for det første billede og Til for det sidste billede). Udfyld dyrets oplysninger - dyre-id, fødselsdato, køn, vægt, bæltehastighed og bæltevinkel - og kommenter om nødvendigt i de relevante felter. Gem filen til yderligere analyse ved at klikke på Gem.
- Rens bæltet med vand og fortsæt med resten af dyrene på samme måde. Vælg KAMERA for at fortsætte med at optage det næste dyr, der går. Når der er erhvervet optagelser for alle dyrene, fortsæt til analysen.
BEMÆRK: Dyr, der ikke er i stand til at gå med en bestemt hastighed på bæltet, er udelukket fra testning. Baseret på vores erfaring observerer vi, at ældre dyr (over 50 uger) oplever flere vanskeligheder med at gå på løbebåndet, med en variabel frekvens mellem 2% og 50% afhængigt af genotypen. Animalsk affald opsamles i bakker på enten forsiden eller bagsiden af løbebåndet. Bakkerne tømmes efter hver undersøgelse og vaskes med varmt sæbevand. Bæltet tørres af med en fugtig klud. - Udfør ganganalyse baseret på en fuldautomatisk analyse af videooptagelser af dyrefodspor. Juster dataene i DigiGait Analysis-softwaren .
BEMÆRK: Ganganalyse giver ikke kun et mål for motorisk koordination, men også en detaljeret kinematisk beskrivelse baseret på analysen af dynamisk gangsignal, der repræsenterer den tidsmæssige historie om poteplacering gennem sekventielle skridt. Følgende parametre måles automatisk af softwaren: svingvarighed, procentdel af skridtvarighed i svingning, bremsevarighed, procentdel af skridtvarighed ved bremsning, fremdrivningsvarighed, procentdel af skridt i fremdrift, stancevarighed, procentdel af skridt i stance, skridtvarighed, bremseprocent af stillingen, fremdriftsprocent af stancefasen, sving til stance-forhold, skridtlængde, skridtfrekvens, potevinkel, potevinkelvariabilitet, stancebredde, trinvinkel, skridtlængdevariabilitet, skridtbreddevariabilitet, trinvinkelvariabilitet, variationskoefficient for skridtlængde, variationskoefficient for skridtbredde, variationskoefficient for trinvinkel, variationskoefficient for svingvarighed, poteareal ved spidsstilling, poteområdevariabilitet ved spidsstilling, bagbenets fælles holdningsvarighed, procentdel af delt holdning, forholdet mellem venstre og højre bageste holdningsvarighed, gangsymmetri, maksimal ændringshastighed for poteområde i kontakt med løbebåndsbæltet under bremsefasen, maksimal ændringshastighed for poteområde i kontakt med løbebåndsbæltet under fremdrivningsfasen, tau-fremdrift, poteoverlapningsafstand, Pote placering positionering, ataksi koefficient, midterlinje afstand, akse afstand, og pote træk. Softwaren giver mulighed for en lille korrektion af trinsporingsstøj, som skal udfyldes inden statistisk analyse. Software og hardware kan variere, og de relevante manualer skal følges.
- Rotarod
BEMÆRK: Rotarod-testen bruges til at vurdere gnavermotorfunktioner-balance og motorisk koordination. Testen kræver, at en mus går på en roterende stang med en fast diameter (5 cm), hvor rotationen accelererer over en given periode (5 min), indtil dyret ikke længere kan blive på.- Tænd rotarodudstyret ved at trykke på tænd/sluk-knappen på udstyret, og start softwaren ved at dobbeltklikke på Rod-softwareikonet. Initialiser en ny fil under fanen Filer, og gem den under passende navn. I vinduet Opsætning skal du udfylde eksperimentoplysningerne, f.eks. dato, brugerens navn og eventuelle kommentarer. Indstil hastighedsprofilen til 300 s, starthastigheden til 4 o / min og terminalhastigheden til 40 o / min.
- Udarbejd en tidsplan for de testede dyr i feltet Dyr , og tildel hvert dyr dets position på stangen. Positionerne er ikke angivet eksplicit i softwaren, men de svarer til listelinjen; For eksempel vil den første linje angive stangens første position, den femte linje vil angive stangens femte position osv. Husk at opveje hver stangposition mellem forsøgsgrupperne.
BEMÆRK: Fem dyr kan testes samtidigt. - Luk panelet Opsætning ved at klikke på Luk og åbn målepanelet ved at klikke på Mål. Start stangens indledende rotation ved 4 omdrejninger i minuttet ved at klikke på Start/Stop og placer de første fem dyr på deres tildelte positioner. Når alle dyrene er på stangen, skal du starte testprotokollen ved at klikke på Start profil, og stangen vil gradvist accelerere til 40 o / min over 5 minutter. Hvis et dyr falder af stangen, skal du returnere det til stangen, før protokollen begynder.
BEMÆRK: Dyr forbliver normalt ikke på stangen længe nok til at placere alle musene på den på én gang under det første forsøg. Det er vigtigt at være tålmodig, når du placerer dyr på stangen med den konstante rotationshastighed i starten. Formålet med testen er ikke at bestemme dyrets udholdenhed på stangen ved en fast rotationshastighed, men at finde den hastighed, hvormed dyret ikke er i stand til at blive på stangen. Stangens hastighed er proportional med latenstiden for at blive på den; Således bruges det til at udtrykke dyrets balance. - Flyt dyrene til det midlertidige holdebur, når de alle er faldet fra stangen eller efter 5 minutter er gået. Fjern eventuelt animalsk affald og rengør stangen og bakken med alkohol.
- Klik på Dyr -> for at fortsætte med den næste gruppe dyr på samme måde. Når du har testet alle dyrene, skal du lukke vinduet Måling ved at klikke på Luk og klikke på Vis for at få vist de indsamlede data. Eksporter de hentede data i .csv filformat til yderligere analyse ved at klikke på Eksportér CSV.
- Test hvert dyr på stangen tre gange med 15 minutters mellemrum. Brug den gennemsnitlige værdi af ventetiden til at falde over de tre forsøg til yderligere statistisk analyse. Evaluer dyrets motoriske læring ved at gentage testen i 5 på hinanden følgende dage.
BEMÆRK: Softwaren og hardwaren kan variere, og de relevante manualer skal følges. Derudover kan selve udstyret variere, for eksempel i antal testpositioner, samlet konstruktion og stangdimension.
- Nestlet makulering-rede bygning
- Adskil dyrene i enkelt polycarbonat musebure med standardudstyr (strøelse, madnet og vandforsyning) i 1 uge. Tag ca. 12 g bomuld nestlet ved hjælp af tang, registrer vægten manuelt ved hjælp af skalaer, og læg den tilfældigt i et bur, men på den modsatte side af vandforsyningen. Sæt burene tilbage med dyrene til boligrummet.
- Vej hver nestlet på samme tidspunkt hver dag i de næste 4 dage manuelt ved hjælp af vægte. Optag vægtene på papir eller i et foruddefineret regneark. Sørg for, at hver nestlet er tør, når den vejes; Hvis ikke, tør på en varmepude og returner alle nestlets til deres tildelte bur på samme tid på det sted, hvor musen lavede sin rede. Hvis nestlet er revet i flere dele, vejer den største.
- Til dataanalyse udtrykkes nedgangen i nestletvægt hver dag i forhold til startvægten og præsenteres som en procentdel af det anvendte materiale.
BEMÆRK: At bringe hanner tilbage til et fælles bur kan føre til øget aggression og uønskede skader blandt dyrene. Derfor bør nestlet-makuleringstesten planlægges mod slutningen af testregimet for at undgå at kompromittere dyrevelfærden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forhøjet plus labyrint og åbne felttest
EPM- og OF-testene bruger gnaveres naturlige tendens til at udforske nye miljøer18,19. Udforskningen styres af en konflikt om undgåelse af tilgang, hvor gnavere vælger mellem udforskning af et nyt miljø og undgåelse af mulig fare. Dyr udforsker ukendte steder i søgen efter ly, social kontakt eller fouragering. Nye steder kan dog indebære risikofaktorer som rovdyr eller konkurrenter. Både OF-testen og EPM består af sikre og risikable rum - periferien og midten i OF-testen og lukkede og åbne arme i EPM. Gnavere foretrækker naturligvis mørke, lukkede rum sammenlignet med åbne, forhøjede og stærkt oplyste områder. Således karakteriserer reduceret udforskning af de risikable / angstfremkaldende dele, udtrykt som et fald i antallet af besøg og besøgsvarighed, eller som øget latenstid til det første besøg, dyrs angstlignende adfærd 8,11. Hviletid, gennemsnitshastighed og samlet tilbagelagt afstand giver yderligere oplysninger om dyrenes spontane aktivitet. Ingen af parametrene relateret til angstlignende adfærd blev ændret i UBE3AmGenedel/+ mutanter i hverken OF-testen eller EPM (figur 1D-G). Imidlertid var UBE3AmGenedel/+ dyr signifikant hypoaktive, hvilket afspejles af en kortere krydset afstand, lavere gennemsnitshastighed og længere hviletid i OF-testen (figur 1A-C).
Figur 1: Spontan aktivitet og angstrespons på et nyt miljø i EPM- og OF-testen. (A-E) Udforskning af det åbne felt. UBE3AmGenedel/+ dyrene gik en kortere distance (A) med en lavere gennemsnitshastighed (B) og forlænget hviletid (C). Antallet af besøg og varighed i centret varierede ikke mellem dyr (D, E). En tovejs ANOVA afslørede en signifikant hovedgenotypeeffekt uden signifikant interaktion mellem genotype og køn (genotypeeffekt: p < 0,01; genotype/kønsinteraktion: p > 0,7). Procentdelen af besøg på åbne og lukkede arme afhang ikke af genotype (F), og tiden brugt i de angstfyldte åbne arme varierede heller ikke mellem eksperimentelle grupper (G). En tovejs ANOVA afslørede ikke signifikante hovedvirkninger eller genotype/kønsinteraktion (genotypeeffekt : p > 0,9; genotype/kønsinteraktion: p > 0,9). Data afbildet i boksplottet viser medianværdien, interkvartilområdet og værdiområdet. Signifikante post-hoc testresultater er angivet som *. Data for kontroldyr (hunner n = 10, handyr n = 11) præsenteres med rødt, og mutanter (hunner n = 9, han n = 10) med blåt. Dette tal er tilpasset fra Syding et al.6. Forkortelser: EPM = forhøjet plus labyrint; OF = åbent felt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Test af haleophæng
TST måler dyrs fortvivlelse, der er udviklet i en uundgåelig situation. Når de suspenderes af halen, bliver gnavere hurtigt immobile efter en indledende periode med kraftig aktivitet. Varigheden af immobiliteten angiver størrelsen af "fortvivlelsen". Talrige laboratorier har vist, at en bred vifte af klinisk aktive antidepressive lægemidler reducerer immobilitetens varighed 9,20,21. Denne ukomplicerede test er blevet almindeligt anvendt til screening for potentielle antidepressive stoffer, og den kan også bruges til at karakterisere fænotypen af forskellige dyrestammer såvel som transgene muriner i undersøgelser, der udforsker det neurobiologiske grundlag for depressive tilstande 9,21. UBE3AmGenedel/+ dyr var immobile signifikant længere end deres kontrolkuldkammerater, hvilket indikerer deres depressionslignende adfærd (figur 2).
Figur 2: Immobilitetstid i haleophængsprøven. UBE3AmGenedel/+ dyr viste en længere immobilitet under halesuspensionen. En tovejs ANOVA viste signifikante hovedvirkninger, men ingen betydning i genotype/kønsinteraktion (genotypeeffekt: p < 0,001; kønseffekt : p < 0,001; genotype/kønsinteraktion: p > 0,5). Data afbildet i boksplottet viser medianværdien, interkvartilområdet og værdiområdet. Signifikante post-hoc testresultater er angivet som *. Data for kontroldyr (hunner n = 10, handyr n = 14) præsenteres med rødt, og mutanter (hunner n = 10, han n = 11) med blåt. Dette tal er tilpasset fra Syding et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Rotarod og ganganalyse
Historien om rotarod-test i modeller af neuromotoriske underskud går tilbage til midten af det 20. århundrede22. Rotarod bruges til at vurdere dyrebalance og bevægelseskoordinering, da deres forringelser manifesterer sig i en signifikant kortere latenstid for at falde fra den roterende stang14. Gentagen test på rotarod bruges til at studere dyremotoriske læringsevner. Den hurtige udvikling af moderne udstyr og digitale teknologier har muliggjort automatiseret, præcis og upartisk evaluering af gnaverlokomotoriske fænotyper baseret på de detaljerede beskrivelser af deres gang23. Automatiseret ganganalyse erstattede fodaftryksanalyse og er også mere følsom over for neuromuskulære underskud14,24,25. Ændringer af spatio-temporale egenskaber ved dyrets gang er specifikke for den modellerede nosologiske enhed26,27,28. UBE3AmGenedel/+ mutanter havde en robust vekslen mellem gangindeks (figur 3A-G), yderligere bekræftet af en reduceret latenstid til at falde fra rotarod (figur 3H).
Figur 3: Detaljeret ganganalyse og motorisk indlæring på rotarod. (A-G) Gangindekserne for UBE3AmGenedel/+ dyr blev ændret. UBE3AmGenedel/+ dyr havde et længere sving (A) og holdning (B), der resulterede i forlænget skridtvarighed og længde (C,D). Deres bagben, fremdrivningsvarighed (E) og deceleration (F) blev også øget. Analysen afslørede også et større poteareal ved topstilling (G). Hverken dyrenes metriske parametre eller vægt var forskellige (data ikke vist), hvilket tyder på, at de observerede forskelle ikke skyldtes forskelle i dyrestørrelse. En tovejs ANOVA med gentagne målinger viste en signifikant hovedeffekt af genotype uden signifikant genotype/kønsinteraktion (genotypeeffekt: p < 0,001; genotype/kønsinteraktion: p > 0,2). (H) Resultaterne af rotarod-præstationen viser en kortere latenstid til at falde i UBE3AmGenedel/+ dyr. En tovejs ANOVA med gentagne målinger afslørede signifikante hovedeffekter uden en signifikant interaktion (genotypeeffekt: p < 0,001; sexeffekt : p < 0,01; genotype/kønsinteraktion: p > 0,1). Gangparametre, der er afbildet i boksplottet, viser medianværdien, interkvartilområdet og værdiområdet. Signifikante post-hoc testresultater er angivet som *. Data for latenstid til fald præsenteres i et linjediagram som middel ± SEM. Data for kontroldyr (hundyr n = 10, han n = 14) præsenteres med rødt, og mutanter (hun n = 10, han n = 11) med blåt. Dette tal er tilpasset fra Syding et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Nestlet-makulering - redebygning
Nestlet makuleringstesten bruges primært til at detektere stereotyp kompulsiv adfærd hos mus29,30. Mus viser dog en naturlig tendens til at rive forudsat materiale til at bygge deres rede. Manglende evne til at makulere en bomuldsnestlet bruges således som en indikator for deres velbefindende påvirket af neuroudviklingshæmning 16,31. UBE3AmGenedel/+ dyrene brugte betydeligt mindre materiale til at bygge deres reder, og denne forskel var særlig fremtrædende mellem transgene hunner og deres kontrolkolleger (figur 4A).
Figur 4: Brug af nestletmateriale til redebygning. UBE3AmGenedel/+ dyr strimlede mindre bomuldsmateriale end deres kontrolkuldkammerater. Dataene blev transformeret til justerede rækker for at opfylde normalitetsforudsætningen. En variansanalyse med gentagne målinger afslørede en signifikant genotypeeffekt uden betydning af genotype/kønsinteraktion (genotypeeffekt: p < 0,05; genotype/kønsinteraktion: p > 0,4). Data afbildet i linjediagrammet viser gennemsnitlige ± SEM. Væsentlige post-hoc testresultater er angivet som *. Data for kontroldyr (hunner n = 10, handyr n = 14) præsenteres med rødt, og mutanter (hunner n = 10, han n = 11) med blåt. Dette tal er tilpasset fra Syding et al.6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tidshorisont for test
Hver gruppe (kontrol og eksperimentel) udsættes for de samme tests på de samme dage. En pause på 1 dag mellem test anvendes for at minimere potentielle overførselseffekter. Hvis det er muligt, testes kvinder og mænd på hinanden følgende dage; Ellers testes hunnerne, efter at hannerne er blevet testet (figur 5)6.
Figur 5: Tidsplan for test. UBE3AmGenedel/+ dyr og deres kontroller blev testet i to kohorter. Testtidsskalaen for den første kohorte præsenteres i det øverste panel og for den anden kohorte i det nederste panel. De dage, hvor hannerne blev testet, er angivet med blåt, mens de dage, hvor hunnerne blev testet, er angivet med grønt. Dage, hvor begge køn blev testet, er angivet med gult. Der blev ikke udført test i weekenden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tallene er tilpasset fra Syding et al.6 i overensstemmelse med MDPI's licenspolitik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AS-modeller oprettet i forskellige murinstammer valideres almindeligvis med test af dyrs følelsesmæssige tilstand, motoriske funktioner og kognitive evner for at lette sammenligning med menneskelige symptomer31,32. Et motorisk underskud i AS-modeller er det mest konsistente fund på tværs af laboratorier, efterfulgt af en uændret følelsesmæssigitetstilstand hos mutanter og vanskeligheder med at bygge reder31,32,33. I modsætning hertil er kognitiv svækkelse enten mild eller fraværende 7,31,33. Uoverensstemmelse i den kognitive fænotype synes at afhænge af de testede dyrs alder, som vist af Huang et al.7. Derfor blev der til dette papir valgt et batteri af tests på grundlag af deres reproducerbarhed samt alders- og artsuafhængighed, da sammenlignelige resultater observeres i både mus og rotte AS-modeller 6,31,32.
Kritisk skal man huske på, at testning af dyr gentagne gange i forskellige eksperimentelle opsætninger kræver deres omhyggelige rækkefølge, begyndende med de test, der er mest følsomme over for forudgående manipulation, og samtidig med minimal effekt på følgende tests, såsom EPM- og OF-test34. Yderligere bekymringer vedrører nestlet-makuleringstesten, hvor dyr er enkelthusede, hvilket vides at være en stressende tilstand35. Efterfølgende samler hanner i et fælles bur fører ofte til øget aggression på grund af hierarkisk etablering. Således bør nestlet makuleringstesten afslutte testplanen. Det er også god praksis at teste hanner før hunner for at undgå, at mandlig adfærd bliver påvirket af efterfølgende kvindelige olfaktoriske spor. Skiftende dyr, der tilhører forskellige eksperimentelle grupper under test, er afgørende i adfærdsforskning for at afbalancere virkningerne af uforudsigelige faktorer på dyreadfærd. Det er velkendt, at håndtering af dyr før test i EPM påvirker deres observerede stressrespons. Derfor skal håndteringsmængden være ensartet for alle dyr36. Det er også meget vigtigt at opretholde opstaldningsforholdene (enkelt vs. gruppe), belysning under testning, testtidspunkt og før testerfaring for hvert dyr, da alle disse faktorer påvirker en mus' respons i EPM- og OF-testen og kan skævvride resultaterne37.
På trods af de præsenterede tests, der tilhører veletablerede screeningsværktøjer inden for lægemiddeludvikling og genetisk modificeret fænotypebestemmelse af mus, der giver reproducerbare resultater på tværs af laboratorier, kan nogle tests stadig være genstand for mindre ændringer. Da motorisk svækkelse er hovedtræk ved en AS-dyremodels fænotype, kan rotarodtesten begrænses til 1 dags test i stedet for 5 på hinanden følgende dage. Derudover kan parametre, der beskriver kvaliteten af en bygget rede, indarbejdes i nestlet-makuleringstesten38.
En klar begrænsning af de præsenterede resultater er tvetydigheden af deres fortolkning. Især AS-dyrs motoriske underskud kan forklare ændringer i bevægelsesbaserede opgaver, såsom OF-testen og EPM. Analogt kan en forlænget immobilitetstid i TST være et resultat af den større fysiske træthed, som AS-dyr udvikler under denne krævende test, i modsætning til depressiv adfærd. Også i nestlet makuleringstesten kan reduceret bomuldsforbrug skyldes den neuromuskulære fænotype snarere end tabet af redebygningsinstinktet. Fortolkningen af skridtlængdeændringer er tvetydig, da forkortelse observeres i nogle musemodeller af Parkinsons sygdom, mens forlængelse observeres hos aldrende mus39,40. Vi mener dog, at en stigning i den samlede skridtlængde er en konsekvens af en længere svingvarighed. Svingvarigheden øges med smerte og forlænges i arthritismodeller, hvilket indebærer, at en længere svingvarighed hos mus potentielt kan muliggøre korrekt placering af lemmerne, før de bærer vægt41,42. Fremdriftsvarighed refererer til den tid, der kræves for et dyr at starte og opretholde fremadgående bevægelse. Således kan en kort varighed hos raske dyr indikere større styrke og bedre kontrol. Disse fund karakteriserer ikke kun denne AS-musemodel, men indikerer også gangsvækkelse. Imidlertid er der behov for nærmere undersøgelse for at belyse det fysiologiske grundlag for en sådan svækkelse, såsom bestemmelse af muskelstyrke og undersøgelse af neuromuskulære forbindelser / transmission.
På trods af fortolkningsdilemmaet giver det præsenterede batteri af adfærdstest reproducerbare resultater, der er konsistente på tværs af laboratorier og kan tjene som et elegant valideringsværktøj til nye murinmodeller af Angelmans syndrom og nye terapeutiske tilgange 6,31,32,43,44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af det tjekkiske videnskabsakademi RVO 68378050, LM2018126 tjekkiske center for phenogenomics leveret af MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (opgradering af det tjekkiske center for phenogenomics: udvikling mod oversættelsesforskning af MEYS og ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II af MEYS og ESIF) og OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (højere kvalitet og kapacitet for transgene modeller af MEYS og EFRU). Derudover modtog denne undersøgelse finansiering fra NGO'en "Association of Gene Therapy (ASGENT)", Tjekkiet (https://asgent.org/) og LM2023036 tjekkiske center for phenogenomics leveret af Tjekkiets ministerium for uddannelse, ungdom og sport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
References
- Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
- Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
- Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
- Jolleff, N., Ryan, M. M.
- Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
- Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
- Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
- Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
- Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M.
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
- Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
- La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
- Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
- Hampton, T. G., et al.
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
- Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
- Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
- Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
- Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
- Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
- File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
- Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
- Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
- Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
- Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
- Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).
