Automatically Generated

Summary

Detta manuskript presenterar en uppsättning mycket reproducerbara beteendetester för att validera en musmodell med Angelmans syndrom.

Abstract

Detta manuskript beskriver ett batteri av beteendetester som finns tillgängliga för att karakterisera Angelmans syndrom (AS)-liknande fenotyper i en etablerad musmodell av AS. Vi använder rotarodinlärningsparadigmet, detaljerad gånganalys och bobyggnadstest för att upptäcka och karakterisera motoriska nedsättningar hos djur. Vi testar djurens emotionalitet i det öppna fältet och förhöjda plus labyrinttester, samt effekten i svansupphängningstestet. När AS-möss testas i det öppna fälttestet bör resultaten tolkas med försiktighet, eftersom motoriska dysfunktioner påverkar musens beteende i labyrinten och förändrar aktivitetspoängen.

Reproducerbarheten och effektiviteten hos de presenterade beteendetesterna har redan validerats i flera oberoende Uba3a-muslinjer med olika knockout-varianter, vilket gör denna uppsättning tester till ett utmärkt valideringsverktyg inom AS-forskning. Modeller med relevant konstrukt- och ansiktsvaliditet kommer att motivera ytterligare undersökningar för att belysa sjukdomens patofysiologi och möjliggöra utveckling av kausala behandlingar.

Introduction

Angelmans syndrom (AS) är en sällsynt utvecklingsneurologisk funktionsnedsättning. Det vanligaste genetiska ursprunget till AS är en stor deletion av 15q11-q13-regionen i den maternella kromosomen, som finns hos nästan 74 % av patienterna¹. Deletion av denna region orsakar förlust av UBE3A, den huvudsakliga orsakande genen för AS som kodar för ett E3 ubiquitinligas. Den faderliga allelen av UBE3A-genen i nervceller tystas i en process som kallas prägling. Som en följd av detta tillåter faderns prägling av genen endast moderns uttryck i det centrala nervsystemet (CNS)². Därför leder UBE3A-gendeletion från den maternella kromosomen till utveckling av AS-symtom. Hos människa manifesterar sig AS vid cirka 6 månaders ålder, med utvecklingshämning som kvarstår under alla utvecklingsstadier och resulterar i allvarliga försvagande symtom hos drabbade individer ^3,4. De viktigaste symtomen på sjukdomen är nedsatt fin- och grovmotorik, inklusive ryckig ataktisk gång, allvarlig talstörning och intellektuell funktionsnedsättning. Cirka 80 % av AS-patienterna lider också av sömnstörningar och epilepsi. Hittills är den enda tillgängliga behandlingen symtomatiska läkemedel, som minskar epileptiska anfall och förbättrar sömnkvaliteten¹. Därför kommer utvecklingen av robusta djurmodeller med reproducerbara beteendefenotyper tillsammans med förfinad fenotypningsanalys att vara avgörande för att belysa de patofysiologiska mekanismerna för sjukdomen och upptäcka effektiva mediciner och behandlingar.

Komplexiteten i den mänskliga störning som påverkar CNS kräver att modellorganismer har ett jämförbart genom, fysiologi och beteende. Möss är populära som modellorganismer på grund av deras korta reproduktionscykel, lilla storlek och relativt enkla DNA-modifiering. År 1984 föreslog Paul Willner tre grundläggande kriterier för validering av sjukdomsmodeller: konstruktionen, ansiktet och den prediktiva validiteten, som används för att bestämma modellens värde⁵. Enkelt uttryckt återspeglar begreppsvaliditet de biologiska mekanismer som är ansvariga för sjukdomsutvecklingen, ansiktsvaliditet rekapitulerar dess symtom och prediktiv validitet beskriver modellsvaret på terapeutiska läkemedel.

För att följa ovanstående principer har vi valt den vanligaste genetiska etiologin, en stor deletion av maternella 15q11.2-13q-lokus inklusive UBE3A-genen, för att skapa AS-modellmöss. Vi använde CRISPR/Cas9-tekniken för att ta bort ett 76 225 bp långt område som spänner över hela UBE3A-genen, som omfattar både de kodande och icke-kodande elementen i genen, i möss från en C57BL/6N-bakgrund⁶. Vi avlade sedan djuren för att få UBE3A^+/− heterozygota möss. För ansiktsvalidering av modellen använde vi djur från korsningar av UBE3A+/⁻ honor och vildtypshanar för att få UBE3A+/- avkomma (stam med namnet C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph och senare tilldelad UBE3A ^mGenedel/+) och kontrollera kullsyskon. Vi testade deras fin- och grovmotorik, känslosamhet och affekt för att rekapitulera AS-symtomen. I en tidigare artikel utvärderade vi även djurens kognitiva funktioner, då AS-patienter också lider av intellektuell funktionsnedsättning⁶. Vi fann dock inga kognitiva försämringar hos UBE3A^mGenedel/+-möss, kanske på grund av djurens unga ålder vid tidpunkten för test⁷. Senare undersökning av de äldre djuren, cirka 18 veckor gamla, avslöjade ett underskott i beteendemässig flexibilitet under reverseringsinlärning i platspreferensparadigmet. Komplexiteten hos den utrustning som används för denna analys kräver dock en separat metodologisk modul och den ingår inte här.

De beteendetester som presenteras här tillhör de vanligaste fenotypningsverktygen inom genetisk forskning, tack vare deras höga prediktiva värde och tillräckliga konstruktvaliditet ^8,9,10. Vi använde dessa tester för att validera en musmodell av AS genom att rekapitulera kärnsymtom på den mänskliga sjukdomen på ett reproducerbart, åldersoberoende sätt. Djurets emotionalitet utvärderades i den förhöjda plus labyrinten och de öppna fälttesterna. Båda dessa tester är baserade på konflikten mellan närmande och undvikande, där djur utforskar en ny miljö på jakt efter mat, skydd eller parningsmöjligheter samtidigt som de undviker ångestfyllda fack¹¹. Dessutom används det öppna fälttestet för att testa en mus motoriska aktivitet⁸. Svansupphängningstestet används ofta inom depressionsforskning för att screena för nya antidepressiva läkemedel eller depressiva fenotyper i musknockoutmodeller¹². Detta test utvärderar den förtvivlan som djur utvecklar över tid i en oundviklig situation. Motorisk inlärning och detaljerade gångegenskaper bestämdes på rotarod respektive i DigiGait. Djurens uthållighet på den accelererande staven kännetecknar dess balans- och rörelsekoordinationsförmåga, medan detaljerad analys av en mus stegmönster är en känslig utvärdering av neuromuskulära funktionsnedsättningar kopplade till många neurogenerativa rörelsestörningar^13,14,15. Fragmenteringstestet är en del av standardmetoden för att upptäcka impulsivt beteende hos gnagare, och eftersom det använder naturligt gnagarbyggande beteende indikerar det djurets välbefinnande^16,17.

Storleken på försöksgrupperna var ett resultat av en kompromiss för att uppfylla kraven på 3R-regeln och effektiv användning av bisamhällenas avelsprestanda. För att få statistisk styrka hade grupperna dock inte mindre än 10 individer, på grund av att det fanns tillräckligt många häckande par. Dessvärre resulterade avelsresultaten inte alltid i ett tillräckligt antal djur.

Protocol

Alla djur och försök som användes i denna studie genomgick etisk granskning och utfördes i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU. Studien har godkänts av den tjeckiska centralkommissionen för djurskydd. Mössen hölls i individuellt ventilerade burar och hölls vid en konstant temperatur på 22 ± 2 °C med en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Mössen försågs med musmat och fritt vatten. Mössen hölls i grupper om tre till sex djur per bur. Ingen annan hantering än vägning utfördes före pro…

Representative Results

Förhöjd plus labyrint och öppna fälttesterEPM- och OF-testerna använder gnagares naturliga tendens att utforska nya miljöer18,19. Utforskandet styrs av en närmande-undvikande konflikt, där gnagare väljer mellan att utforska en ny miljö och att undvika eventuell fara. Djur utforskar okända platser i jakt på skydd, social kontakt eller födosök. Nya platser kan dock innebära riskfaktorer som rovdjur eller konkurrenter. Både OF-te…

Discussion

AS-modeller som skapats i olika murina stammar valideras vanligtvis med tester av djurs känslomässiga tillstånd, motoriska funktioner och kognitiva förmågor för att underlätta jämförelse med mänskliga symtom^31,32. Ett motoriskt underskott i AS-modeller är det mest konsekventa fyndet i laboratorier, följt av ett oförändrat emotionalitetstillstånd hos mutanter och svårigheter att bygga bon^31,32,33…

Materials

Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.