Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina
Summary
El metanol se puede utilizar como medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo, lo que es útil para la investigación de las células ganglionares de la retina.
Abstract
Las células ganglionares de la retina (CGR), que son las neuronas de proyección de la retina, propagan información visual externa al cerebro. Los cambios patológicos en las CGR tienen una estrecha relación con numerosas enfermedades degenerativas de la retina. La inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza con frecuencia en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones de desarrollo y patológicas de la retina. En algunas circunstancias, algunas muestras valiosas de retina, como las de ratones transgénicos, pueden necesitar ser retenidas durante un largo período sin afectar la morfología o el número de CGR. Para obtener resultados experimentales creíbles y reproducibles, es esencial utilizar un medio de conservación eficaz. Aquí, describimos el efecto del metanol como un medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo. En resumen, durante el proceso de aislamiento, el metanol frío (-20 ° C) se pipetea sobre la superficie de la retina para ayudar a fijar los tejidos y facilitar su permeabilidad, y luego las retinas se pueden almacenar en metanol frío (-20 ° C) antes de ser inmunoteñidas. Este protocolo describe el flujo de trabajo de aislamiento de retina y el protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para la investigación de CGR.
Introduction
Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro1. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR 2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas 4,5.
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta es un método ampliamente aceptado para monitorear la distribución de proteínas y el recuento celular. En el laboratorio, la inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza comúnmente en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones fisiológicas y patológicas de la retina6. Los marcadores más comunes utilizados para la cuantificación de RGC en toda la retina incluyen Brn3a, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), y así sucesivamente 7,8. La caracterización de la cantidad y distribución de las CGR requiere inmunotinción retiniana de montaje completo de alta calidad. Generalmente, en los protocolos de inmunotinción, la retina se sumerge en fijadores químicos antes de ser incubada en anticuerpos. Los fijadores ideales no deben cambiar la forma de las células, la accesibilidad o afinidad de los epítopos por los anticuerpos, o las dimensiones lineales del tejido 9,10.
Debido a la compleja estructura de la retina, problemas como la fragilidad retiniana y el plegamiento, así como algunas dificultades comunes, como la contracción celular y los núcleos poco claros, son propensos a ocurrir cuando se hace un parche retiniano de montaje completo, lo que tiene un impacto negativo en la investigación experimental. Además, no todas las retinas se inmunotiñen inmediatamente, especialmente cuando se trata de las retinas de ratones transgénicos con precios caros que son de origen precioso, lo que requiere la preservación de las muestras de retina adicionales para su uso posterior.
La solución fijadora adecuada puede fijar el tejido rápidamente, evitar la autólisis tisular, preservar la morfología y estructura normales de las células tisulares y mantener la antigenicidad de las proteínas y otras sustancias10. En la actualidad, la fijación a base de formaldehído se ha utilizado ampliamente en diversos tejidos, incluyendo retinas separadas, oculares hemisecados y globos oculares enteros10. La contracción del tejido y la alteración morfológica de las células son los dos desafíos críticos encontrados después de la inmersión en formaldehído11. Además, las formulaciones de fijación modificada están emergiendo cada vez más para maximizar la retención de las propiedades originales de la retina y las células diana 9,10. Diferentes tratamientos de fijación retiniana pueden afectar la estructura retiniana, la inmunogenicidad de proteínas, la excitación fluorescente y el ciclo de enfriamiento de atenuación de manera diferente12,13. Las retinas fijadas con la solución de Davidson están más morfológicamente intactas en comparación con las fijadas con formalina, pero la solución de Davidson es menos compatible con algunos anticuerpos, como la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada del marcador microglial 112. Teniendo en cuenta la naturaleza frágil de las retinas, los investigadores naturalmente se preguntarían si la integridad de la retina, así como las propiedades y la morfología de las células diana, cambiarán después del almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, rara vez se han informado los posibles efectos de la solución de fijación sobre la morfología de las células retinianas y RGC después del almacenamiento durante varios meses. La optimización de la fijación retiniana es crítica para la evaluación y preservación de las CGR.
Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción retiniana murina de montaje completo. Nuestro método enfatiza la preparación y almacenamiento adecuados de las retinas para la investigación de RGC, teniendo en cuenta la necesidad de almacenamiento a largo plazo del tejido retiniano, así como aspectos específicos de la formación o degradación de fluoróforos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fijación es un paso esencial para preservar la retina, lo que puede afectar cualquier investigación posterior de RGC basada en la morfología. La fijación exitosa captura rápidamente la estructura y el estado de las retinas en el momento de exponerlas al medio de fijación, lo cual es crítico para un análisis posterior. Aunque el formaldehído ha sido considerado como uno de los agentes fijadores más comunes para la fijación y preservación de tejidos y células, el formaldehído por sí solo no siempre funcio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Apertura de Hubei Key Laboratories (subvención no. 2021KFY055), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (subvención no. 2020CFB240) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (subvención no. 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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