Summary
Метанол можно использовать в качестве вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения, что полезно для исследования ганглиозных клеток сетчатки.
Abstract
Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs), которые являются проекционными нейронами сетчатки, распространяют внешнюю визуальную информацию в мозг. Патологические изменения в RGC имеют тесную связь с многочисленными дегенеративными заболеваниями сетчатки. Цельное иммуноокрашивание сетчатки часто используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки развития и патологических состояний сетчатки. При некоторых обстоятельствах некоторые ценные образцы сетчатки, например, от трансгенных мышей, может потребоваться хранить в течение длительного периода времени, не влияя на морфологию или количество RGC. Для получения достоверных и воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо использовать эффективную консервирующую среду. Здесь мы описываем действие метанола как вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения. Короче говоря, в процессе изоляции холодный метанол (-20 ° C) пипеткой наносится на поверхность сетчатки, чтобы помочь зафиксировать ткани и облегчить их проницаемость, а затем сетчатку можно хранить в холодном метаноле (-20 ° C) перед иммуноокрашиванием. Этот протокол описывает рабочий процесс выделения сетчатки и протокол хранения образцов тканей, что полезно и практично для исследования RGC.
Introduction
Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) являются единственными проекционными нейронами в сетчатке, и они интегрируют и передают внешнюю визуальную информацию в мозг1. Многие нейродегенеративные заболевания, такие как глаукома и травматическая нейропатия зрительного нерва, характеризуются необратимым повреждением и потерей RGCs 2,3. Анализ морфологических и количественных изменений RGC является важным шагом в определении того, как развиваются и прогрессируют нейродегенеративные заболевания 4,5.
Непрямой иммунофлюоресцентный анализ является широко распространенным методом мониторинга распределения белков и подсчета клеток. В лабораторных условиях иммуноокрашивание сетчатки обычно используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки физиологических и патологических состояний сетчатки6. Наиболее распространенные маркеры, используемые для количественной оценки RGC во всей сетчатке, включают Brn3a, РНК-связывающий белок с множественным сплайсингом (RBPMS) и так далее 7,8. Характеристика количества и распределения RGC требует высококачественного цельного иммуноокрашивания сетчатки. Как правило, в протоколах иммуноокрашивания сетчатка погружается в химические фиксаторы перед инкубацией в антителах. Идеальные фиксаторы не должны изменять форму клеток, доступность или сродство эпитопов к антителам или линейные размеры ткани 9,10.
Из-за сложной структуры сетчатки такие проблемы, как хрупкость и складчатость сетчатки, а также некоторые общие трудности, включая усадку клеток и неясные ядра, могут возникать при изготовлении цельного патча сетчатки, что отрицательно сказывается на экспериментальных исследованиях. Кроме того, не все сетчатки подвергаются немедленному иммуноокрашиванию, особенно когда речь идет о сетчатке трансгенных мышей с дорогими ценами, которые имеют драгоценное происхождение, что требует сохранения дополнительных образцов сетчатки для дальнейшего использования.
Соответствующий фиксирующий раствор может быстро фиксировать ткань, избегать тканевого аутолиза, сохранять нормальную морфологию и структуру клеток ткани и сохранять антигенность белков и других веществ10. В настоящее время фиксация на основе формальдегида широко используется в различных тканях, включая разделенные сетчатки, гемисектированные наглазники и целые глазные яблоки10. Усадка тканей и морфологическое изменение клеток являются двумя критическими проблемами, возникающими после погружения в формальдегид11. Кроме того, все чаще появляются модифицированные составы фиксации, чтобы максимизировать сохранение первоначальных свойств сетчатки и клеток-мишеней 9,10. Различные методы фиксации сетчатки могут по-разному влиять на структуру сетчатки, иммуногенность белка, возбуждение флуоресценции и цикл гашения затуханиязатухания 12,13. Сетчатки, зафиксированные раствором Дэвидсона, более морфологически интактны по сравнению с сетчатками, фиксированными формалином, но раствор Дэвидсона менее совместим с некоторыми антителами, такими как ионизированная микроглиальным маркером кальций молекула адаптера 112. Учитывая хрупкую природу сетчатки, исследователи, естественно, задаются вопросом, изменится ли целостность сетчатки, а также свойства и морфология клеток-мишеней после длительного хранения. Однако о возможном влиянии фиксирующего раствора на морфологию клеток сетчатки и RGC после хранения в течение нескольких месяцев сообщалось редко. Оптимизация фиксации сетчатки имеет решающее значение для оценки и сохранения RGC.
Мы приводим подробное описание надежного и технически простого метода, который мы используем для окрашивания сетчатки мыши целиком. Наш метод подчеркивает надлежащую подготовку и хранение сетчатки для исследования RGC, принимая во внимание необходимость длительного хранения ткани сетчатки, а также специфические аспекты образования или деградации флуорофоров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все действия выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Все использованные мыши C57BL / 6J были получены из Центра лабораторных животных Уханьского университета, и все связанные с этим эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Уханьского университета. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания мышей.
1. Энуклеация и фиксация глаз
- Усыпьте мышей удушьем углекислым газом и осторожно энуклеируйте глазное яблоко с помощью беззубого пинцета.
- Промойте глазное яблоко один раз в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
- Проколите глазное яблоко иглой шприца в роговице под микроскопом (окуляр WF: 10x/22; объектив непрерывного увеличения: 0,67x-4,5x), чтобы ускорить фиксацию в глазном яблоке и повысить эффективность фиксации.
- Перенос на 24-луночную пластину, содержащую 4% параформальдегида (ПФА).
- Зафиксируйте глазное яблоко в 4% PFA в течение 45 минут, а затем переведите его в 1x PBS, чтобы немедленно удалить излишки PFA (промыть три раза, 5 минут / раз).
2. Изоляция и уплощение сетчатки
- Перенесите глазное яблоко на предметное стекло и поместите его под препарирующий микроскоп (окуляр WF: 10x/22; объектив с непрерывным увеличением: 0,67x-4,5x).
- Держите щипцы в одной руке и используйте их, чтобы зажать край роговицы, чтобы предотвратить движение глазного яблока. Другой рукой держите рассекающие ножницы и разрежьте роговицу на глубину примерно 1 мм через корнеосклеральный лимб. Удалите хрусталик и стекловидное тело.
- Держите диск зрительного нерва в центре и с помощью рассекающих ножниц разрезайте сетчатку радиально вдоль четырех квадрантов, достигая примерно 2/3 радиуса сетчатки.
- Зажмите один из краев склеры с помощью зубчатых щипцов. Другой рукой придерживайте край склеры беззубыми щипцами и двигайтесь от того места, где склера фиксируется зубчатыми щипцами, к основанию склеры. Аккуратно очистите сетчатку.
- Удалите PBS с помощью пипетки (200 мкл), чтобы промыть и смочить сетчатку, а затем удалите излишки PBS небольшим кусочком впитывающей бумаги. При необходимости аккуратно разгладьте сетчатку с помощью небольшой щетинной щетки.
- Медленно пипеткой наносите холодный метанол (предварительно охлажденный в морозильной камере с температурой -20 ° C) по каплям на внутреннюю поверхность сетчатки (объем метанола не фиксируется, пока сетчатка может быть полностью покрыта метанолом). Сетчатка белеет и развивается повышенная живучесть.
- Аккуратно сплющите сетчатку и удалите загрязнения, такие как остаточные пигментные мембраны и стекловидное тело, с помощью небольших щетинистых щеток. Инвертируйте сетчатку с помощью небольших щетинных щеток и повторите вышеупомянутый процесс.
- Перенесите обработанную метанолом сетчатку в лунку с 24-луночной пластиной и держите ее пропитанной метанолом.
- Храните его при температуре -20 ° C в течение 1-2 ч для немедленного иммуноокрашивания или оставьте сетчатку в метаноле и храните при -20 ° C для длительного хранения.
- Удалите метанол из 24-луночной пластины и промойте сетчатку 1x PBS.
3. Иммунофлюоресцентное окрашивание РКК
- Осторожно перенесите сетчатку на 24-луночную гемагглютинирующую пластину с помощью пластиковой пипетки Пастера и заблокируйте 5% PBS-TX-BSA (5 г порошка бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 100 мл 1x раствора PBST; PBST образуют путем добавления 10 мл Triton X-100 к 2000 мл 1 x PBS) при комнатной температуре в течение 4 часов или на ночь при 4 ° C. Держите ганглий стороной вверх.
- Удалите PBS-TX-BSA и инкубируйте сетчатку при 4 ° C в течение 48-96 часов, добавляя 100 мкл выбранного первичного антитела (антитело морской свинки против RBPMS) с использованием разведения 1:400.
- Удалите первичное антитело и промойте сетчатку три раза (по 20 минут каждый) 1x PBS, встряхивая при комнатной температуре.
- Инкубируйте сетчатку с легким встряхиванием в течение ночи при 4 ° C со 100 мкл соответствующего вторичного антитела (см. Таблицу материалов), цианина Cy3 affiniPure осла против морской свинки IgG (H + L), используя разведение 1:400.
- Промойте сетчатку 1x PBS три раза (по 20 минут каждый).
- Положите сетчатку плашмя на предметное стекло слоем ганглиозных клеток вверх, капните соответствующее количество антифлуоресцентного гасящего агента вокруг сетчатки с помощью пипетки и накройте предметное стекло покровным стеклом (будьте осторожны, чтобы не было пузырьков).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить соответствующее количество антифлуоресцентного гасителя, убедитесь, что он покрывает всю сетчатку. После этого накройте предметное стекло, не позволяя сетчатке плавать и легко двигаться. - Запечатайте предметное стекло со всех сторон герметизирующим средством, чтобы предотвратить его перемещение. Храните образцы при температуре -20 ° C и защищайте их от света.
- Изображение сетчатки с помощью флуоресцентного/конфокального микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После рассечения сетчатка должна быть похожа на плоский четырехлистный клевер. В этом исследовании, используя протокол, описанный выше, сетчатка побелела после добавления метанола (рис. 1). Между тем, сетчатка изменилась с мягкой на податливую и плоскую. Затем RGC были помечены анти-RBPMS8. Четыре поля изображения были взяты в сетчатке (n = 3) с помощью конфокального микроскопа (окуляр: 10x; объектив: 40x). Репрезентативные виды визуализированных RGC сетчатки до переработки метанолом и после 12 месяцев длительного хранения в метаноле показаны на рисунке 2. Интенсивность флуоресценции не показала существенных изменений. Консервация метанола не влияла на иммуноокрашивание RGC.
Рисунок 1: Изменения сетчатки после обработки метанолом. (А) Перед обработкой метанолом. (B) После обработки метанолом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Влияние метанола на иммуноокрашивание ганглиозных клеток сетчатки (RGC). (A) Сетчатка без лечения метанолом. (B) Сетчатка с 12-месячным хранением в метаноле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фиксация является важным шагом для сохранения сетчатки, что может повлиять на любые последующие исследования RGC, основанные на морфологии. Успешная фиксация быстро фиксирует структуру и состояние сетчатки в момент воздействия на нее фиксирующей среды, что имеет решающее значение для дальнейшего анализа. Хотя формальдегид считается одним из наиболее распространенных фиксирующих агентов для фиксации и сохранения тканей и клеток, формальдегид сам по себе не всегда хорошо работает в качестве оптимального химического фиксатора для некоторых исследований10,14. Различные виды фиксаторов обладают различной способностью осаждать аминокислоты и нуклеотиды, стабилизировать белки и поддерживать морфологию клеток15. Используя смеси обоих типов фиксаторов, можно полностью использовать сильные стороны каждого из них16,17. Метанол часто используется во многих процедурах фиксации перед тем, как ткань будет свежезаморожена или помещена в идеальные режущие материалы16,18. Для экспериментов с цельным креплением используется 100% холодный (-20 °C) метанол для достижения фиксации образца сетчатки, что способствует пермеабилизации образца для последующей визуализации на основе флуоресценции19.
Ключевым преимуществом фиксации метанола является то, что она обеспечивает легкое сохранение. В этом протоколе метанол постепенно добавляется в переднюю и заднюю части сетчатки при -20 ° C после уплощения сетчатки. Можно легко заметить, что цвет сетчатки быстро меняется от полупрозрачного до молочно-белого, а загрязнения становятся более четкими. Следует отметить, что сетчатку следует аккуратно сплющивать щеткой, чтобы предотвратить скручивание вокруг нее во время процесса капания метанола. После обработки метанолом общая прочность сетчатки увеличивается, что затрудняет удаление примесей и перенос сетчатки. Постфиксация метанолом более удобна для сохранения сетчатки, которая была слегка предварительно зафиксирована с помощью PFA. Однако, когда прочность сетчатки улучшается, прочность стекловидного тела и других примесей также, вероятно, соответственно увеличивается. Можно попытаться аккуратно удалить некоторые примеси, которые легко удалить перед использованием метанола, а затем удалить оставшиеся примеси после капельного добавления метанола, что легче выполнить. Раннее удаление загрязнений требует достаточной практики и опыта. Рекомендуется аккуратно чистить оставшееся стекловидное тело на сетчатке радиально наружу от диска зрительного нерва.
В этом протоколе после лечения сетчатку пропитывают метанолом и помещают в морозильную камеру с температурой -20 ° C на некоторое время перед последующей герметизацией, а другие методы лечения могут еще больше повысить прочность сетчатки. Тем не менее, трудно установить точный промежуток времени, который был бы универсально оптимальным для фиксации погружения. При необходимости сетчатку можно хранить в холодном метаноле в течение длительного времени.
В этой работе, с помощью представленной методологии, было изучено влияние хранения в метаноле на окрашивание RGC - важнейший метод качественных и количественных оценок сетчатки. при использовании метанола интенсивность флуоресценции RGCs, которая повлияла бы на результаты качественного и количественного тестирования, не изменялась во время иммуноокрашивания. Сетчатку можно хранить неограниченное время в консервирующем растворе, холодном (-20 ° C) метаноле, по крайней мере, в течение 12 месяцев перед окрашиванием. Кроме того, наше предыдущее исследование не выявило существенной разницы в выживаемости RGC в модели мыши с раздавливанием зрительного нерва после длительного хранения в метаноле, и сохранение метанола также мало повлияло на количественный анализ сосудистой сети сетчатки и гипоксии сетчатки в модели кислород-индуцированной ретинопатии20. Мы рекомендуем последовательно использовать 4% PFA и холодный (-20 ° C) метанол для подготовки проб, а также использовать фиксацию метанола для стратегий хранения в лаборатории. Одним из ограничений является то, что анализы не полностью демонстрируют тонкие морфологические изменения на дендритном или аксональном уровне, хотя плотность RGC и морфология сомы, по-видимому, не изменяются21,22. Следует отметить, что в этом протоколе мы тестировали RBPMS только для RGC. Дальнейшая проверка различных белков RGC (например, Brn3a, ядер нейронов, нейрофиламента-L) обеспечит более надежный результат. Кроме того, протокол также может быть применен к любому другому типу клеток сетчатки, который нуждается в дальнейших исследованиях. Однако длительное вдыхание или прямое воздействие метанола на кожу может вызвать токсическое воздействие на организм человека. Поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности в процессе использования метанола.
Наш метод уделяет большое внимание использованию фиксации метанола для хранения сетчатки для исследований RGC и подчеркивает важные соображения, касающиеся количественной оценки RGC и интенсивности флуоресценции. Этот протокол обеспечивает простой и практичный метод для удовлетворения потребности в сохранении образцов сетчатки для дальнейшего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам не известно о каких-либо связях, членстве, финансировании или финансовых холдингах, которые могли бы повлиять на объективность этого исследования.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Проектом открытия ключевых лабораторий провинции Хубэй (грант No 2021KFY055), Фондом естественных наук провинции Хубэй (грант No 2020CFB240) и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (грант No 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
