תכשיר שלם על בסיס מתנול לחקר תאי גנגליון ברשתית

Summary

מתנול יכול לשמש כמדיום עזר קבוע עבור תכשירים ברשתית שלמות הר אחסון לטווח ארוך, אשר שימושי לחקירה של תאי גנגליון ברשתית.

Abstract

תאי גנגליון ברשתית (RGCs), שהם נוירוני ההקרנה של הרשתית, מפיצים מידע חזותי חיצוני למוח. לשינויים פתולוגיים ב- RGCs יש קשר הדוק עם מחלות ניווניות רבות ברשתית. Whole-mount retinal immunostaining משמש לעתים קרובות במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים ההתפתחותיים והפתולוגיים של הרשתית. בנסיבות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך לשמור כמה דגימות רשתית יקרות ערך, כגון אלה מעכברים טרנסגניים, לתקופה ארוכה מבלי להשפיע על המורפולוגיה או על מספר RGCs. לקבלת תוצאות ניסוי אמינות וניתנות לשחזור, שימוש במדיום שימור יעיל הוא חיוני. כאן, אנו מתארים את ההשפעה של מתנול כאמצעי עזר קבוע עבור תכשירים רשתית מלאה ואחסון לטווח ארוך. בקצרה, במהלך תהליך הבידוד, מתנול קר (-20 ° C) הוא pipeted על פני השטח של הרשתית כדי לעזור לתקן את הרקמות ולהקל על החדירות שלהם, ולאחר מכן הרשתית ניתן לאחסן מתנול קר (-20 ° C) לפני להיות immunostained. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה של בידוד הרשתית ואת פרוטוקול אחסון דגימות הרקמות, שהוא שימושי ומעשי לחקירת RGCs.

Introduction

תאי גנגליון ברשתית (RGCs) הם נוירוני ההקרנה היחידים ברשתית, והם משתלבים ומעבירים מידע חזותי חיצוני למוח¹. מחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון גלאוקומה ונוירופתיה אופטית טראומטית מאופיינות בנזק בלתי הפיך ואובדן RGCs ^2,3. ניתוח השינויים המורפולוגיים והכמותיים של RGCs הוא צעד מכריע בקביעת האופן שבו מחלות נוירודגנרטיביות מתפתחות ומתקדמות ^4,5.

בדיקת אימונופלואורסנציה עקיפה היא שיטה מקובלת לניטור התפלגות החלבונים וספירת התאים. במעבדה, אימונוסטיין רשתית מלאה משמש בדרך כלל במחקרים ניסיוניים על RGCs כדי להעריך את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של הרשתית⁶. הסמנים הנפוצים ביותר המשמשים לכימות RGC בכל הרשתית כוללים Brn3a, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), וכן הלאה ^7,8. אפיון הכמות והפיזור של RGCs דורש אימונוסטיין רשתית באיכות גבוהה. בדרך כלל, בפרוטוקולים של אימונוסטינינג, הרשתית שקועה בקיבועים כימיים לפני שהיא מודגרת בנוגדנים. קיבועים אידיאליים לא צריכים לשנות את צורת התאים, את הנגישות או הזיקה של האפיטופים לנוגדנים, או את הממדים הליניאריים של הרקמה ^9,10.

בשל המבנה המורכב של הרשתית, בעיות כגון שבריריות רשתית וקיפול, כמו גם כמה קשיים נפוצים כולל התכווצות תאים וגרעינים לא ברורים, נוטים להתרחש בעת ביצוע תיקון רשתית שלם, אשר יש השפעה שלילית על מחקר ניסיוני. בנוסף, לא כל הרשתיות עוברות חיסון מיידי, במיוחד כשמדובר ברשתיות של עכברים טרנסגניים עם מחירים יקרים שמקורם יקר, מה שמחייב שימור דגימות הרשתית הנוספות לשימוש נוסף.

הפתרון המקבע המתאים יכול לתקן את הרקמה במהירות, להימנע מאוטוליזה של רקמות, לשמר את המורפולוגיה והמבנה הרגילים של תאי הרקמה, ולשמור על האנטיגניות של חלבונים וחומרים אחרים¹⁰. נכון לעכשיו, קיבוע מבוסס פורמלדהיד נמצא בשימוש נרחב ברקמות שונות, כולל רשתיות מופרדות, משקפיים hemisected, וגלגלי עיניים שלמים¹⁰. התכווצות רקמות ושינוי מורפולוגי של תאים הם שני האתגרים הקריטיים שנתקלים בהם בעקבות טבילה בפורמלדהיד¹¹. בנוסף, ניסוחי קיבוע מותאמים צצים יותר ויותר כדי למקסם את השמירה על המאפיינים המקוריים של הרשתית ותאי היעד ^9,10. טיפולים שונים בקיבוע רשתית עשויים להשפיע על מבנה הרשתית, אימונוגניות חלבון, עירור פלואורסצנטי , ומחזור מרווה הנחתה באופן שונה^12,13. הרשתיות המקובעות בתמיסה של דוידסון שלמות יותר מבחינה מורפולוגית בהשוואה לאלה המקובעות בפורמלין, אך התמיסה של דוידסון פחות תואמת לנוגדנים מסוימים, כגון מולקולת מתאם קשירת סידן 1¹² של סמן מיקרוגליה. בהתחשב באופי השברירי של הרשתית, החוקרים יתהו באופן טבעי אם שלמות הרשתית, כמו גם התכונות והמורפולוגיה של תאי המטרה, ישתנו לאחר אחסון לטווח ארוך. עם זאת, ההשפעות האפשריות של תמיסת קיבוע על המורפולוגיה של תאי הרשתית וה-RGC לאחר אחסון במשך מספר חודשים דווחו רק לעתים רחוקות. אופטימיזציה של קיבוע הרשתית היא קריטית להערכה ושימור של RGCs.

אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה אמינה ופשוטה מבחינה טכנית בה אנו משתמשים לצביעת רשתית מורין בהרכבה שלמה. השיטה שלנו שמה דגש על הכנה ואחסון נכונים של רשתיות לחקירת RGC, תוך התחשבות בצורך באחסון לטווח ארוך של רקמת הרשתית וכן היבטים ספציפיים של היווצרות פלואורופור או התפרקות.

Protocol

כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת. כל עכברי C57BL/6J שנעשה בהם שימוש התקבלו ממרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת ווהאן, וכל הניסויים הקשורים אושרו על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת ווהאן. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של העכברים.

1. חינוך וקיבוע העיניים

1. הרדימו את העכברים בחנק פחמן דו חמצני, והפעילו את גלגל העין בעדינות באמצעות פינצטה חסרת שיניים.
2. יש לשטוף את גלגל העין פעם אחת במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
3. נקבו את גלגל העין עם מחט מזרק בקרנית תחת מיקרוסקופ (עינית WF: 10x/22; יעד הגדלה רציפה: 0.67x-4.5x) כדי להאיץ את הקיבוע לתוך גלגל העין ולשפר את יעילות הקיבוע.
4. מעבירים לצלחת בת 24 בארות המכילה 4% פרפורמלדהיד (PFA).
5. תקן את גלגל העין ב 4% PFA במשך 45 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו 1x PBS כדי להסיר PFA עודף (לשטוף שלוש פעמים, 5 דקות / זמן) מיד.

2. בידוד רשתית והשטחה

1. מעבירים את גלגל העין למגלשת זכוכית, ומניחים אותו תחת מיקרוסקופ מנתח (עינית WF: 10x/22; יעד הגדלה רציפה: 0.67x-4.5x).
2. החזיקו את המלקחיים ביד אחת, והשתמשו בה כדי להדק את שולי הקרנית כדי למנוע תנועת גלגל העין. השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את המספריים המנתחים ולחתוך סביב הקרנית בעומק של כ 1 מ"מ דרך הלימבוס corneoscleral. הסר את העדשה ואת גוף הזגוגית.
3. החזיקו את הדיסק האופטי במרכז, ובעזרת מספריים חותכים את הרשתית רדיאלית לאורך ארבעת הרבעים, ומגיעים לכ-2/3 מרדיוס הרשתית.
4. הדקו את אחד הקצוות הסקלרליים באמצעות מלקחיים עם שיניים. עם היד השנייה, החזיקו את קצה לובן העין עם מלקחיים ללא שיניים, ועברו מהמקום שבו לובן העין מקובע על ידי המלקחיים בעלי השיניים לכיוון בסיס הסקלרה. מקלפים בזהירות את הרשתית.
5. משוך PBS באמצעות פיפטה (200 μL) כדי לשטוף ולהרטיב את הרשתית, ולאחר מכן להסיר את כל PBS עודף עם פיסת נייר סופג קטנה. במידת הצורך, שטחו בעדינות את הרשתית בעזרת מברשת זיפים קטנה.
6. לאט לאט פיפטה מתנול קר (מקורר מראש במקפיא -20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפה על פני השטח הפנימיים של הרשתית (נפח מתנול אינו קבוע, כל עוד הרשתית יכולה להיות מכוסה לחלוטין על ידי מתנול). הרשתית הופכת לבנה ומפתחת עקשנות מוגברת.
7. שטחו בעדינות את הרשתית, והסירו זיהומים כגון שאריות פיגמנט וגוף הזגוגית בעזרת מברשות זיפים קטנות. הפוך את הרשתית באמצעות מברשות זיפים קטנות, וחזור על התהליך הנ"ל.
8. מעבירים את הרשתית המטופלת במתנול לבאר של צלחת בת 24 בארות, ושומרים אותה ספוגה במתנול.
9. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C למשך 1-2 שעות לניקוי מיידי של מערכת החיסון, או השאירו את הרשתית במתנול, ואחסנו אותה בטמפרטורה של 20°C לאחסון לטווח ארוך.
10. הסר את המתנול מהצלחת בת 24 הבארות, ושטוף את הרשתית עם PBS 1x.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית של RGCs

1. מעבירים בזהירות את הרשתית לצלחת המגלוטיציה של 24 בארות עם פיפטת פסטר מפלסטיק, וחוסמים פנימה 5% PBS-TX-BSA (5 גרם אבקת אלבומין בסרום בקר מומסת ב-100 מ"ל של תמיסת PBST אחת; PBST נוצר על ידי הוספת 10 מ"ל של טריטון X-100 עד 2,000 מ"ל של 1 x PBS) בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. שמור על צד הגנגליון למעלה.
2. הסר את PBS-TX-BSA, ודגר על הרשתית ב 4 ° C במשך 48-96 שעות, הוספת 100 μL של הנוגדן הראשוני שנבחר (נוגדן שרקן נגד RBPMS) באמצעות דילול 1:400.
3. הסר את הנוגדן הראשוני, ושטוף את הרשתית שלוש פעמים (20 דקות כל אחת) עם PBS 1x, רועד בטמפרטורת החדר.
4. לדגור על הרשתית עם רעד עדין במשך הלילה ב 4 ° C עם 100 μL של הנוגדן המשני המתאים (ראה טבלה של חומרים), ציאנין Cy3 affiniטהור חמור אנטי חזיר גינאה IgG (H+L), באמצעות דילול 1:400.
5. שטפו את הרשתית עם PBS אחד שלוש פעמים (20 דקות כל אחת).
6. הניחו את הרשתית שטוחה על המגלשה כששכבת תאי הגנגליון פונה כלפי מעלה, שחררו כמות מתאימה של חומר מרווה אנטי-פלואורסצנטי סביב הרשתית עם פיפטה, וכסו את המגלשה בכיסוי (היזהרו שלא יהיו בועות).
   הערה: כדי לקבוע את הכמות המתאימה של מרווה אנטי פלואורסצנטית, ודא שהוא מכסה את הרשתית כולה. לאחר מכן, כסו את המגלשה מבלי לאפשר לרשתית לצוף ולנוע בקלות.
7. אטמו את המגלשה מסביב עם חומר איטום כדי למנוע ממנה לזוז. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -20°C, והגנו עליהן מפני אור.
8. דמיינו את הרשתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי/קונפוקלי.

Representative Results

לאחר נתיחה, הרשתית צריכה להיראות כמו תלתן שטוח בעל ארבעה עלים. במחקר זה, על-ידי שימוש בפרוטוקול שתואר לעיל, הרשתית הפכה לבנה לאחר הוספת מתנול (איור 1). בינתיים, הרשתית השתנתה מרכה לגמישה ושטוחה. לאחר מכן, RGCs היו מסומנים עם anti-RBPMS⁸. ארבעה שדות תמונה צולמו ברשתית כולה (n = 3) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (עינית: 10x; מטרה: 40x). תצוגות מייצגות של RGCs של רשתית לפני עיבוד מתנול ולאחר 12 חודשים של שימור ארוך טווח במתנול, מודגמות באיור 2. עוצמת הפלואורסצנטיות לא הראתה שינויים משמעותיים. שימור מתנול לא השפיע על ההכתמה החיסונית של RGC.

איור 1: שינויים ברשתית לאחר טיפול במתנול. (A) לפני טיפול במתנול. (B) לאחר טיפול במתנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעת מתנול על מערכת החיסון של תאי גנגליון ברשתית (RGC). (A) רשתית ללא טיפול במתנול. (B) רשתית עם אחסון של 12 חודשים במתנול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

קיבוע הוא צעד חיוני לשימור הרשתית, אשר יכול להשפיע על כל חקירות RGC הבאות המבוססות על מורפולוגיה. קיבוע מוצלח לוכד במהירות את המבנה והמצב של הרשתיות ברגע חשיפתן למדיום הקיבוע, שהוא קריטי לניתוח נוסף. למרות שפורמלדהיד נחשב לאחד מסוכני הקיבוע הנפוצים ביותר לקיבוע ושימור רקמות ותאים, פורמלדהיד לבדו לא תמיד עובד טוב כקיבוע הכימי האופטימלי עבור חקירות מסוימות^10,14. לסוגים שונים של קיבועים יש יכולות שונות לזרז חומצות אמינו ונוקלאוטידים, לייצב חלבונים ולשמור על מורפולוגיה של התא¹⁵. על ידי שימוש בתערובות של שני סוגי החומרים המקבעים, ניתן לנצל את נקודות החוזק של כל אחד מהם באופן מלא^16,17. מתנול משמש לעתים קרובות בהליכי קיבוע רבים לפני שהרקמה מוקפאה טרייה או מוטמעת בחומרי חיתוך אידיאליים^16,18. עבור ניסויים שלמים, מתנול 100% קר (-20 ° C) משמש להשגת קיבוע דגימת רשתית, אשר מסייע לחדירת הדגימה עבור הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות¹⁹ שלאחר מכן.

יתרון מרכזי של קיבוע מתנול הוא שהוא מאפשר שימור קל. בפרוטוקול זה, מתנול מתווסף לחלק הקדמי והאחורי של הרשתית בהדרגה ב -20 ° C לאחר שטוחת הרשתית. ניתן לראות בקלות כי צבע הרשתית משתנה במהירות משקוף ללבן חלבי, והזיהומים הופכים ברורים יותר. יש לציין כי יש לשטח את הרשתית בעדינות עם מברשת כדי למנוע הסתלסלות סביבה בתהליך טפטוף מתנול. לאחר הטיפול במתנול, הקשיחות הכללית של הרשתית עולה, ומפחיתה את הקושי להסיר את הזיהומים ולהעביר את הרשתית. לאחר קיבוע עם מתנול נוח יותר לשימור רשתית שתוקנה מעט מראש עם PFA. עם זאת, כאשר העקשנות של הרשתית משופרת, עקשנות הזגוגית וזיהומים אחרים צפוי גם להגדיל בהתאם. אפשר לנסות להסיר בעדינות כמה זיהומים שקל להסיר לפני השימוש במתנול, ולאחר מכן להסיר את הזיהומים הנותרים לאחר הוספת מתנול בטפטוף, שהוא קל יותר לביצוע. הסרה מוקדמת של זיהומים דורשת מספיק תרגול וניסיון. מומלץ להבריש בעדינות את גוף הזגוגית שנותר על הרשתית רדיאלית החוצה מהדיסק האופטי.

בפרוטוקול זה, לאחר הטיפול, הרשתית ספוגה במתנול ומוכנסת למקפיא בטמפרטורה של 20°C למשך זמן מה לפני האיטום הבא, וטיפולים אחרים יכולים להגביר עוד יותר את הקשיחות של הרשתית. עם זאת, קשה לקבוע משך זמן מדויק שיהיה אופטימלי אוניברסלית לקיבוע טבילה. במידת הצורך, הרשתית יכולה להיות מאוחסנת במתנול קר לפרקי זמן ארוכים.

בעבודה זו, במתודולוגיה שהוצגה, נבחנה השפעת האחסון במתנול על צביעת RGC - טכניקה מכרעת בהערכות איכותיות וכמותיות של הרשתית. עם השימוש במתנול, עוצמת הפלואורסצנטיות של RGCs, אשר תשפיע על התוצאות של בדיקות איכותיות וכמותיות, לא השתנו במהלך immunostaining. הרשתית יכולה להישמר ללא הגבלת זמן בתמיסה משמרת, מתנול קר (-20 מעלות צלזיוס), לפחות 12 חודשים לפני הצביעה. בנוסף, המחקר הקודם שלנו לא גילה הבדל משמעותי בשיעור ההישרדות של RGC במודל עכבר ריסוק עצב הראייה לאחר אחסון ארוך טווח במתנול, ולשימור מתנול הייתה גם השפעה מועטה על הניתוח הכמותי של כלי הדם ברשתית והיפוקסיה ברשתית במודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן²⁰. אנו ממליצים להשתמש ב-4% PFA ובמתנול קר (-20°C) ברצף להכנת הדגימה, וכן לאמץ קיבוע מתנול לאסטרטגיות אחסון במעבדה. מגבלה אחת היא שהניתוחים אינם מראים באופן מלא שינויים מורפולוגיים עדינים ברמת הדנדריט או האקסונל, אם כי נראה כי צפיפות ה-RGCs והמורפולוגיה של הסומה אינם משתנים^21,22. יש לציין כי בפרוטוקול זה, בדקנו רק RBPMS עבור RGCs. אימות נוסף של חלבוני RGC שונים (למשל, Brn3a, גרעינים עצביים, נוירופילמנט-L) יספק תוצאה חזקה יותר. יתר על כן, לפרוטוקול יש גם פוטנציאל להיות מיושם על כל סוג תא אחר ברשתית הדורש מחקר נוסף. עם זאת, שאיפה ארוכת טווח או חשיפה עורית ישירה למתנול עלולה לגרום להשפעות רעילות על גוף האדם. לכן, יש צורך לנקוט אמצעי זהירות טובים בתהליך השימוש מתנול.

השיטה שלנו שמה דגש חזק על שימוש בקיבוע מתנול לאחסון רשתית לחקירות RGC ומדגישה שיקולים חשובים לגבי כימות RGC, ועוצמת פלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומעשית כדי לספק את הצורך בשימור דגימות רשתית לשימוש נוסף.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools