Summary
Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.
Abstract
Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.
Introduction
Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn1. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet 2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten 4,5.
Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay ist eine weithin anerkannte Methode zur Überwachung der Verteilung von Proteinen und der Zellzählung. Im Labor wird die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut häufig in experimentellen Studien an RGCs verwendet, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten6. Zu den gebräuchlichsten Markern, die für die RGC-Quantifizierung in der gesamten Netzhaut verwendet werden, gehören Brn3a, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) usw. 7,8. Die Charakterisierung der Menge und Verteilung von RGCs erfordert eine qualitativ hochwertige Immunfärbung der gesamten Netzhaut. Im Allgemeinen wird die Netzhaut bei Immunfärbeprotokollen in chemische Fixiermittel getaucht, bevor sie in Antikörpern inkubiert wird. Ideale Fixiermittel sollten die Form der Zellen, die Zugänglichkeit oder Affinität der Epitope für Antikörper oder die linearen Abmessungen des Gewebes nicht verändern 9,10.
Aufgrund der komplexen Struktur der Netzhaut treten bei der Herstellung eines Whole-Mount-Netzhautpflasters häufig Probleme wie Fragilität und Faltung der Netzhaut sowie einige häufige Schwierigkeiten wie Zellschrumpfung und unklare Zellkerne auf, was sich negativ auf die experimentelle Forschung auswirkt. Darüber hinaus werden nicht alle Netzhäute sofort immungefärbt, insbesondere wenn es sich um die Netzhaut von transgenen Mäusen handelt, die zu teuren Preisen wertvoller Herkunft sind, was die Konservierung der zusätzlichen Netzhautproben für die weitere Verwendung erforderlich macht.
Die geeignete Fixierlösung kann das Gewebe schnell fixieren, eine Gewebeautolyse vermeiden, die normale Morphologie und Struktur der Gewebezellen erhalten und die Antigenität von Proteinen und anderen Substanzen erhalten10. Gegenwärtig wird die Fixierung auf Formaldehydbasis häufig in verschiedenen Geweben eingesetzt, darunter getrennte Netzhaut, halbgeschnittene Augenmuscheln und ganze Augäpfel10. Die Schrumpfung des Gewebes und die morphologische Veränderung von Zellen sind die beiden entscheidenden Herausforderungen, die nach dem Eintauchen in Formaldehydauftreten 11. Darüber hinaus werden zunehmend modifizierte Fixierungsformulierungen entwickelt, um die Erhaltung der ursprünglichen Eigenschaften der Netzhaut und der Zielzellen zu maximieren 9,10. Verschiedene Netzhautfixationsbehandlungen können die Netzhautstruktur, die Proteinimmunogenität, die Fluoreszenzanregung und den Abschwächungslöschzyklus unterschiedlich beeinflussen12,13. Netzhäute, die mit Davidson-Lösung fixiert wurden, sind morphologisch intakter als solche, die mit Formalin fixiert wurden, aber Davidsons Lösung ist weniger kompatibel mit einigen Antikörpern, wie z. B. dem Mikroglia-Marker-ionisierten Kalzium-bindenden Adaptermolekül 112. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut würden sich die Forscher natürlich fragen, ob sich die Integrität der Netzhaut sowie die Eigenschaften und die Morphologie der Zielzellen nach längerer Lagerung verändern werden. Über die möglichen Auswirkungen der Fixierlösung auf die Morphologie der Netzhaut und der RGC-Zellen nach mehrmonatiger Lagerung wurde jedoch nur selten berichtet. Die Optimierung der Netzhautfixierung ist entscheidend für die Beurteilung und Erhaltung von RGCs.
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode, die wir für die Total-Mount-Färbung der murinen Netzhaut verwenden. Unsere Methode legt den Schwerpunkt auf die richtige Präparation und Lagerung von Netzhäuten für die RGC-Untersuchung, wobei die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhautgewebe sowie spezifische Aspekte der Fluorophorbildung oder des Fluorophorabbaus berücksichtigt werden.
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Protocol
Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle verwendeten C57BL/6J-Mäuse stammen aus dem Versuchstierzentrum der Universität Wuhan, und alle damit verbundenen Experimente wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Universität Wuhan genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Mäuse zu minimieren.
1. Enukleation und Fixierung der Augen
- Einschläfern Sie die Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung ein und entkernen Sie den Augapfel sanft mit einer zahnlosen Pinzette.
- Spülen Sie den Augapfel einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
- Punktieren Sie den Augapfel mit einer Spritzennadel an der Hornhaut unter dem Mikroskop (Okular WF: 10x/22; kontinuierliches Vergrößerungsobjektiv: 0,67x-4,5x), um die Fixierung in den Augapfel zu beschleunigen und die Fixiereffizienz zu verbessern.
- Transfer auf eine 24-Well-Platte mit 4 % Paraformaldehyd (PFA).
- Fixieren Sie den Augapfel 45 Minuten lang in 4% PFA und übertragen Sie ihn dann auf 1x PBS, um überschüssiges PFA (dreimal waschen, 5 min/Zeit) sofort zu entfernen.
2. Isolierung und Abflachung der Netzhaut
- Übertragen Sie den Augapfel auf einen Objektträger und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop (Okular WF: 10x/22; Objektiv mit kontinuierlicher Vergrößerung: 0,67x-4,5x).
- Halten Sie die Pinzette in einer Hand und klemmen Sie damit den Rand der Hornhaut ab, um eine Bewegung des Augapfels zu verhindern. Halten Sie die Präparierschere mit der anderen Hand fest und schneiden Sie in ca. 1 mm Tiefe um die Hornhaut herum durch den Hornhaut-Limbus. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper.
- Halten Sie die Papille in der Mitte und schneiden Sie die Netzhaut mit einer Präparierschere radial entlang der vier Quadranten, wobei Sie etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen.
- Klemmen Sie eine der Sklerakanten mit einer gezahnten Pinzette. Halten Sie mit der anderen Hand den Rand der Sklera mit einer unverzahnten Pinzette fest und bewegen Sie sich von der Stelle, an der die Sklera durch die gezahnte Zange fixiert ist, zur Basis der Sklera. Schälen Sie die Netzhaut vorsichtig.
- Ziehen Sie PBS mit einer Pipette (200 μl) ab, um die Netzhaut zu spülen und zu befeuchten, und entfernen Sie dann überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Glätten Sie die Netzhaut bei Bedarf vorsichtig mit einer kleinen Borstenbürste.
- Kaltes Methanol (vorgekühlt in einem −20°C Gefrierschrank) langsam tropfenweise auf die Innenfläche der Netzhaut pipettieren (das Methanolvolumen ist nicht fixiert, solange die Netzhaut vollständig vom Methanol bedeckt werden kann). Die Netzhaut verfärbt sich weiß und entwickelt eine erhöhte Zähigkeit.
- Glätten Sie die Netzhaut sanft und entfernen Sie Verunreinigungen wie Restpigmentmembranen und den Glaskörper mit kleinen Borstenbürsten. Drehen Sie die Netzhaut mit kleinen Borstenbürsten um und wiederholen Sie den oben genannten Vorgang.
- Übertragen Sie die mit Methanol behandelte Netzhaut in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und halten Sie sie in Methanol getränkt.
- Lagern Sie es 1-2 h lang bei −20 °C für eine sofortige Immunfärbung oder lassen Sie die Netzhaut in Methanol und lagern Sie es zur Langzeitlagerung bei −20 °C.
- Entfernen Sie das Methanol von der 24-Well-Platte und spülen Sie die Netzhaut mit 1x PBS.
3. Immunfluoreszenzfärbung der RGCs
- Übertragen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf eine 24-Well-Hämagglutinationsplatte und blockieren Sie sie in 5 % PBS-TX-BSA (5 g Rinderserumalbuminpulver, gelöst in 100 ml 1x PBST-Lösung; das PBST wird durch Zugabe von 10 ml Triton X-100 zu 2.000 ml 1 x PBS) bei Raumtemperatur für 4 h oder über Nacht bei 4 °C. Halte das Ganglion mit der Seite nach oben.
- Entfernen Sie das PBS-TX-BSA und inkubieren Sie die Netzhaut bei 4 °C für 48-96 h, wobei 100 μl des ausgewählten Primärantikörpers (Meerschweinchen-Anti-RBPMS-Antikörper) in einer Verdünnung von 1:400 hinzugefügt werden.
- Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Netzhaut dreimal (jeweils 20 Minuten) mit 1x PBS unter Schütteln bei Raumtemperatur.
- Inkubation der Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 °C mit 100 μL des entsprechenden Sekundärantikörpers (siehe Materialtabelle), Cyanin Cy3 affiniPure Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L), in einer Verdünnung von 1:400.
- Spülen Sie die Netzhaut dreimal (je 20 min) mit 1x PBS.
- Legen Sie die Netzhaut flach mit der Ganglienzellschicht nach oben auf den Objektträger, tropfen Sie mit einer Pipette eine angemessene Menge Antifluoreszenzlöschmittel um die Netzhaut und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen).
Anmerkungen: Um die geeignete Menge an Anti-Fluoreszenz-Quencher zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Netzhaut bedeckt. Decken Sie danach den Objektträger ab, ohne dass die Netzhaut schweben und sich leicht bewegen kann. - Versiegeln Sie den Objektträger rundum mit einem Dichtungsmittel, um ein Verrutschen zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei −20 °C und schützen Sie sie vor Licht.
- Stellen Sie die Netzhaut mit einem Fluoreszenz-/Konfokalmikroskop dar.
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Representative Results
Nach der Präparation sollte die Netzhaut wie ein flaches vierblättriges Kleeblatt aussehen. In dieser Studie wurde die Netzhaut nach der Zugabe von Methanol nach Anwendung des oben beschriebenen Protokolls weiß (Abbildung 1). Währenddessen veränderte sich die Netzhaut von weich zu biegsam und flach. Als nächstes wurden die RGCs mit Anti-RBPMS8 gekennzeichnet. Vier Bildfelder wurden in der Whole-Mount-Netzhaut (n = 3) mit einem konfokalen Mikroskop (Okular: 10x; Objektiv: 40x) aufgenommen. Repräsentative Ansichten von visualisierten RGCs der Netzhaut vor der Methanolverarbeitung und nach 12-monatiger Langzeitkonservierung in Methanol sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Fluoreszenzintensität zeigte keine signifikanten Veränderungen. Die Methanolkonservierung hatte keinen Einfluss auf die RGC-Immunfärbung.
Abbildung 1: Veränderungen der Netzhaut nach der Methanolbehandlung . (A) Vor der Methanolbehandlung. (B) Nach der Methanolbehandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wirkung von Methanol auf die Immunfärbung von retinalen Ganglienzellen (RGC). (A) Netzhaut ohne Methanolbehandlung. (B) Netzhaut mit 12-monatiger Lagerung in Methanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allein nicht immer gut als optimales chemisches Fixiermittel für einige Untersuchungen10,14. Verschiedene Arten von Fixiermitteln haben unterschiedliche Fähigkeiten, Aminosäuren und Nukleotide auszufällen, Proteine zu stabilisieren und die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten15. Durch die Verwendung von Mischungen beider Arten von Fixiermitteln können die Stärken beider Fixiermittel voll ausgeschöpft werden16,17. Methanol wird häufig bei vielen Fixierungsverfahren verwendet, bevor das Gewebe frisch eingefroren oder in ideale Schneidmaterialien eingebettet wird16,18. Für Whole-Mount-Experimente wird 100 % kaltes (−20 °C) Methanol verwendet, um eine Fixierung der Netzhautprobe zu erreichen, die die Permeabilisierung der Probe für die anschließende fluoreszenzbasierte Bildgebung unterstützt19.
Ein wesentlicher Vorteil der Methanolfixierung besteht darin, dass sie eine einfache Konservierung ermöglicht. Bei diesem Protokoll wird Methanol progressiv bei −20 °C auf die Vorder- und Rückseite der Netzhaut gegeben, nachdem die Netzhaut abgeflacht wurde. Es ist leicht zu beobachten, dass sich die Farbe der Netzhaut schnell von durchscheinend zu milchig weiß ändert und die Unreinheiten klarer werden. Es ist zu beachten, dass die Netzhaut vorsichtig mit einer Bürste abgeflacht werden sollte, um zu verhindern, dass sie sich während des Methanol-Tropfprozesses um sie herum kräuselt. Nach der Methanolbehandlung erhöht sich die Gesamtzähigkeit der Netzhaut, wodurch die Schwierigkeit verringert wird, die Verunreinigungen zu entfernen und die Netzhaut zu übertragen. Die Nachfixierung mit Methanol ist bequemer für die Konservierung von Netzhäuten, die leicht mit PFA vorfixiert wurden. Wenn jedoch die Zähigkeit der Netzhaut verbessert wird, steigt wahrscheinlich auch die Zähigkeit des Glaskörpers und anderer Verunreinigungen entsprechend an. Man kann versuchen, einige leicht zu entfernende Verunreinigungen vor der Verwendung von Methanol vorsichtig zu entfernen und dann die verbleibenden Verunreinigungen nach der Tropfzugabe von Methanol zu entfernen, was einfacher durchzuführen ist. Die frühzeitige Entfernung von Verunreinigungen erfordert ausreichend Übung und Erfahrung. Es wird empfohlen, den verbleibenden Glaskörper auf der Netzhaut sanft radial von der Papille nach außen zu bürsten.
Bei diesem Protokoll wird die Netzhaut nach der Behandlung in Methanol eingeweicht und vor der anschließenden Versiegelung für einige Zeit in einen Gefrierschrank von −20 °C gelegt, und andere Behandlungen könnten die Zähigkeit der Netzhaut weiter erhöhen. Es ist jedoch schwierig, eine genaue Zeitspanne anzugeben, die für die Immersionsfixierung universell optimal wäre. Bei Bedarf könnte die Netzhaut über lange Zeiträume in kaltem Methanol gelagert werden.
In dieser Arbeit wurde mit der vorgestellten Methodik der Einfluss der Lagerung in Methanol auf die RGC-Färbung - eine entscheidende Technik in der qualitativen und quantitativen Bewertung der Netzhaut - untersucht. Durch die Verwendung von Methanol wurde die Fluoreszenzintensität der RGCs, die die Ergebnisse der qualitativen und quantitativen Tests beeinflussen würde, während der Immunfärbung nicht verändert. Die Netzhaut konnte vor der Färbung mindestens 12 Monate lang in einer konservierenden Lösung, kaltem (−20 °C) Methanol, aufbewahrt werden. Darüber hinaus zeigte unsere vorherige Studie keinen signifikanten Unterschied in der RGC-Überlebensrate im Sehnerven-Crush-Mausmodell nach Langzeitlagerung in Methanol, und die Methanolkonservierung hatte auch nur geringen Einfluss auf die quantitative Analyse der retinalen Gefäße und der retinalen Hypoxie im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Modell20. Wir empfehlen die sequentielle Verwendung von 4 % PFA und kaltem (−20 °C) Methanol für die Probenvorbereitung sowie die Anwendung der Methanolfixierung für Lagerstrategien im Labor. Eine Einschränkung besteht darin, dass die Analysen subtile morphologische Veränderungen auf dendritischer oder axonaler Ebene nicht vollständig zeigen, obwohl sich die Dichte der RGCs und die Morphologie des Soma nicht zu ändern scheinen21,22. Es sollte beachtet werden, dass wir in diesem Protokoll RBPMS nur für RGCs getestet haben. Eine weitere Überprüfung verschiedener RGC-Proteine (z. B. Brn3a, neuronale Kerne, Neurofilament-L) würde zu einem robusteren Ergebnis führen. Darüber hinaus hat das Protokoll auch das Potenzial, auf jeden anderen Zelltyp in der Netzhaut angewendet zu werden, der weiter erforscht werden muss. Eine langfristige Inhalation oder direkte Hautexposition gegenüber Methanol kann jedoch toxische Wirkungen auf den menschlichen Körper haben. Daher ist es notwendig, bei der Verwendung von Methanol gute Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.
Unsere Methode legt einen starken Schwerpunkt auf die Verwendung der Methanolfixierung für die Lagerung von Netzhaut für RGC-Untersuchungen und hebt wichtige Überlegungen bezüglich der RGC-Quantifizierung und Fluoreszenzintensität hervor. Dieses Protokoll bietet eine unkomplizierte und praktische Methode, um die Notwendigkeit der Konservierung von Netzhautproben für die weitere Verwendung zu erfüllen.
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Disclosures
Den Autoren sind keine Zugehörigkeiten, Mitgliedschaften, Finanzierungen oder finanziellen Beteiligungen bekannt, die die Objektivität dieser Studie beeinträchtigen könnten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Hubei Key Laboratories Opening Project (Zuschussnummer 2021KFY055), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Hubei (Zuschussnummer 2020CFB240) und den Fonds für Grundlagenforschung für die zentralen Universitäten (Zuschussnummer 2042020kf0065) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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