Summary
메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.
Abstract
망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다1. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 4,5.
간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다6. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 7,8. RGC의 양과 분포를 특성화하려면 고품질의 전체 마운트 망막 면역염색이 필요합니다. 일반적으로, 면역염색 프로토콜에서, 망막은 항체에서 배양되기 전에 화학적 고정제에 담근다. 이상적인 고정제는 세포의 모양, 항체에 대한 에피토프의 접근성 또는 친화도, 또는 조직의 선형 치수를 변화시키지 않아야 한다 9,10.
망막의 복잡한 구조로 인해 망막의 취약성 및 접힘과 같은 문제뿐만 아니라 세포 수축 및 불분명한 핵을 포함한 몇 가지 일반적인 어려움이 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 발생하기 쉬우며 이는 실험 연구에 부정적인 영향을 미칩니다. 또한, 모든 망막이 즉시 면역염색되는 것은 아니며, 특히 귀중한 기원의 값비싼 가격을 가진 형질전환 마우스의 망막의 경우 추가 사용을 위해 여분의 망막 샘플을 보존해야 합니다.
적절한 고정액은 조직을 신속하게 고정하고, 조직 자가분해를 피하고, 조직 세포의 정상적인 형태와 구조를 보존하고, 단백질 및 기타 물질의 항원성을 유지할 수 있다10. 현재, 포름알데히드계 고정술은 분리된 망막, 반절제된 안구, 안구 전체를 포함한 다양한 조직에서 널리 사용되고 있다10. 조직 수축과 세포의 형태학적 변화는 포름알데히드에 담근 후 직면하게 되는 두 가지 중요한 문제이다11. 또한, 망막 및 표적 세포의 본래 특성의 보유를 최대화하기 위해 변형된 고정 제형이 점점 더 등장하고 있다 9,10. 다른 망막 고정 치료는 망막 구조, 단백질 면역원성, 형광 여기 및 감쇠 소멸 주기에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다12,13. 데이비슨 용액으로 고정된 망막은 포르말린으로 고정된 망막에 비해 형태학적으로 더 온전하지만, 데이비슨 용액은 소교세포 마커-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 112와 같은 일부 항체와의 호환성이 떨어진다. 망막의 깨지기 쉬운 특성을 고려할 때 연구자들은 망막 무결성과 표적 세포의 특성 및 형태가 장기 보관 후에 변할지 여부를 자연스럽게 궁금해할 것입니다. 그러나 수개월 보관 후 망막 및 RGC 세포 형태에 대한 고정 용액의 가능한 효과는 거의 보고되지 않았습니다. 망막 고정의 최적화는 RGC의 평가 및 보존에 중요합니다.
우리는 전체 마운트 쥐 망막 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 방법은 망막 조직의 장기 보관의 필요성과 형광단 형성 또는 분해의 특정 측면을 고려하여 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비 및 보관을 강조합니다.
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Protocol
모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 눈의 적출 및 고정
- 생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안구를 부드럽게 적출합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS)로 안구를 한 번 헹굽니다.
- 현미경으로 각막에 주사기 바늘로 안구를 뚫습니다(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 안구로의 고정을 가속화하고 고정 효율을 향상시킵니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 24웰 플레이트로 옮깁니다.
- 안구를 4% PFA에 45분 동안 고정한 다음 1x PBS로 옮겨 과잉 PFA를 즉시 제거합니다(3회 세척, 5분/회).
2. 망막 분리 및 평탄화
- 안구를 유리 슬라이드로 옮기고 해부 현미경(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 아래에 놓습니다.
- 한 손으로 집게를 잡고 각막의 가장자리를 고정하여 안구 움직임을 방지합니다. 다른 손으로 해부 가위를 잡고 각막 공막 윤부를 통해 약 1mm 깊이의 각막 주위를 자릅니다. 수정체와 유리체를 제거합니다.
- 시신경을 중앙에 놓고 해부 가위를 사용하여 4 개의 사분면을 따라 방사상으로 망막을 절단하여 망막 반경의 약 2/3에 도달합니다.
- 톱니 집게를 사용하여 공막 가장자리 중 하나를 클램프하십시오. 다른 손으로 톱니가 없는 집게로 공막의 가장자리를 잡고 공막이 톱니가 있는 집게에 의해 고정되는 곳에서 공막 바닥으로 이동합니다. 망막을 조심스럽게 껍질을 벗기십시오.
- 피펫(200 μL)을 사용하여 PBS를 빼내어 망막을 플러시하고 적신 다음 작은 흡수성 종이로 과도한 PBS를 제거합니다. 필요한 경우 작은 강모 브러시로 망막을 부드럽게 평평하게 만듭니다.
- 차가운 메탄올(-20°C 냉동고에서 예냉)을 망막 내부 표면에 한 방울씩 천천히 피펫팅합니다(망막이 메탄올로 완전히 덮일 수 있는 한 메탄올의 부피는 고정되지 않음). 망막이 하얗게 변하고 끈기가 증가합니다.
- 망막을 부드럽게 평평하게하고 작은 강모 브러시로 잔류 색소 막과 유리체와 같은 불순물을 제거합니다. 작은 강모 브러시를 사용하여 망막을 뒤집고 위에서 언급 한 과정을 반복하십시오.
- 메탄올-처리된 망막을 24-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 메탄올에 담근 상태로 유지한다.
- 즉각적인 면역 염색을 위해 -20°C에서 1-2시간 동안 보관하거나 망막을 메탄올에 그대로 두고 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관하십시오.
- 24-웰 플레이트로부터 메탄올을 제거하고, 망막을 1x PBS로 헹구었다.
3. RGC의 면역형광 염색
- 망막을 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 24웰 혈구 응집 플레이트로 조심스럽게 옮기고, 5% PBS-TX-BSA (1x PBST 용액 100mL에 용해된 소 혈청 알부민 분말 5g; PBST는 1 x PBS 2,000mL에 Triton X-100 10mL를 첨가하여 형성됨)를 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 차단합니다. 신경절 쪽을 위로 유지하십시오.
- PBS-TX-BSA를 제거하고, 1:400 희석액을 사용하여 선택된 1차 항체(기니피그 항-RBPMS 항체) 100 μL를 첨가하여 4°C에서 48-96시간 동안 망막을 배양합니다.
- 1차 항체를 제거하고, 실온에서 진탕하면서 1x PBS로 망막을 3회(각각 20분) 헹구었다.
- 1:400 희석액을 사용하여 해당 2차 항체( 재료 표 참조), 시아닌 Cy3 affiniPure 당나귀 항기니피그 IgG(H+L)와 함께 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들면서 망막을 배양합니다.
- 1x PBS로 망막을 세 번(각 20분) 헹굽니다.
- 신경절 세포층이 위를 향하도록 슬라이드에 망막을 평평하게 놓고 피펫으로 망막 주위에 적절한 양의 형광 소광제를 떨어뜨린 다음 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다(기포가 생기지 않도록 주의).
알림: 적절한 양의 항형광 소광제를 결정하려면 전체 망막을 덮고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 망막이 뜨지 않고 슬라이드를 덮고 쉽게 움직입니다. - 슬라이드가 움직이지 않도록 밀봉제로 슬라이드 전체를 밀봉하십시오. 샘플을 -20°C에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 형광/컨포칼 현미경을 사용하여 망막을 이미지화합니다.
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Representative Results
해부 후 망막은 편평한 네잎 클로버처럼 보일 것입니다. 이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 메탄올을 첨가한 후 망막이 하얗게 변했습니다(그림 1). 한편, 망막은 부드러움에서 유연하고 평평한 것으로 바뀌었습니다. 다음으로, RGC는 anti-RBPMS8로 라벨링되었습니다. 컨포칼 현미경(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 40x)을 사용하여 전체 마운트 망막(n = 3)에서 4개의 이미지 필드를 촬영했습니다. 메탄올 처리 전과 메탄올에서 12개월 동안 장기간 보존한 후 망막의 시각화된 RGC의 대표적인 모습이 그림 2에 나와 있습니다. 형광 강도는 큰 변화를 나타내지 않았다. 메탄올 보존은 RGC 면역염색에 영향을 미치지 않았다.
그림 1: 메탄올 처리 후 망막 변화. (a) 메탄올 처리 전. (b) 메탄올 처리 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 망막 신경절 세포(RGC) 면역염색에 대한 메탄올의 효과. (A) 메탄올 처리가 없는 망막. (B) 메탄올에 12개월 보관한 망막. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학 고정제로 항상 잘 작동하는 것은 아닙니다10,14. 고정제의 종류에 따라 아미노산과 뉴클레오티드를 침전시키고, 단백질을 안정화하며, 세포 형태를 유지하는 능력이 다양하다15. 두 가지 유형의 고정제를 혼합하여 사용함으로써 각각의 강점을 충분히 활용할 수 있습니다16,17. 메탄올은 조직이 신선하게 동결되거나 이상적인 절단 재료에 매립되기 전에 많은 고정 절차에서 자주 사용된다16,18. 전체 마운트 실험의 경우, 100% 저온(-20°C) 메탄올을 사용하여 망막 샘플 고정을 달성하고, 이는 후속 형광 기반 이미징을 위한 샘플 투과화를 돕는다19.
메탄올 고정의 주요 이점은 쉽게 보존할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜에서, 메탄올은 망막이 평탄화 된 후 -20 °C에서 점진적으로 망막의 앞면과 뒷면에 첨가된다. 망막의 색이 반투명에서 유백색으로 빠르게 변하고 불순물이 더 선명해지는 것을 쉽게 관찰할 수 있습니다. 망막은 메탄올이 떨어지는 과정에서 망막 주위가 말리는 것을 방지하기 위해 브러시로 부드럽게 평평하게 해야 합니다. 메탄올 처리 후, 망막의 전반적인 인성이 증가하여 불순물을 제거하고 망막을 옮기는 어려움이 줄어 듭니다. 메탄올을 사용한 사후 고정은 PFA로 약간 사전 고정된 망막을 보존하는 데 더 편리합니다. 그러나 망막의 강인성이 향상되면 유리체 및 기타 불순물의 강인함도 그에 따라 증가 할 수 있습니다. 메탄올을 사용하기 전에 제거하기 쉬운 일부 불순물을 부드럽게 제거한 다음 메탄올을 점적한 후 나머지 불순물을 제거하면 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 불순물을 조기에 제거하려면 충분한 연습과 경험이 필요합니다. 망막에 남아있는 유리체를 시신경에서 방사상으로 바깥쪽으로 부드럽게 닦는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에서는 처리 후 망막을 메탄올에 담그고 후속 밀봉 전에 -20°C 냉동고에 일정 시간 동안 두었으며 다른 처리는 망막의 인성을 더욱 증가시킬 수 있습니다. 그러나 침수 고정에 보편적으로 최적이 될 정확한 시간 길이를 말하기는 어렵습니다. 필요한 경우 망막을 차가운 메탄올에 장기간 보관할 수 있습니다.
이 연구에서는 제시된 방법론을 사용하여 메탄올 저장이 RGC 염색에 미치는 영향(망막 정성 및 정량 평가에서 중요한 기술)을 조사했습니다. 메탄올을 사용하면 정성 및 정량 검사 결과에 영향을 미치는 RGC의 형광 강도가 면역 염색 중에 변경되지 않았습니다. 망막은 염색 전 최소 12개월 동안 보존 용액인 차가운(-20°C) 메탄올에 무기한 보관할 수 있습니다. 또한, 우리의 이전 연구에서는 메탄올에 장기간 보관한 후 시신경 크러쉬 마우스 모델에서 RGC 생존율에 유의미한 차이가 없음을 보여주었고, 메탄올 보존도 산소 유발 망막병증 모델20에서 망막 맥관 구조 및 망막 저산소증의 정량 분석에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 시료 전처리를 위해 4% PFA와 저온(-20°C) 메탄올을 순차적으로 사용하고 실험실에서 보관 전략을 위해 메탄올 고정을 채택하는 것이 좋습니다. 한 가지 한계는 RGC의 밀도와 소마의 형태가 변하지 않는 것처럼 보이지만 분석이 수상돌기 또는 축삭 수준에서 미묘한 형태학적 변화를 완전히 보여주지 않는다는 것입니다21,22. 이 프로토콜에서는 RGC에 대해서만 RBPMS를 테스트했습니다. 다른 RGC 단백질(예: Brn3a, 신경 핵, 신경 필라멘트-L)을 추가로 검증하면 보다 강력한 결과를 얻을 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 추가 연구가 필요한 망막의 다른 세포 유형에도 적용될 가능성이 있습니다. 그러나 장기간 흡입하거나 메탄올에 직접 피부 노출되면 인체에 독성 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 메탄올을 사용하는 과정에서 좋은 예방 조치를 취할 필요가 있습니다.
우리의 방법은 RGC 조사를 위한 망막 저장을 위해 메탄올 고정을 사용하는 데 중점을 두고 RGC 정량 및 형광 강도와 관련된 중요한 고려 사항을 강조합니다. 이 프로토콜은 추가 사용을 위해 망막 샘플을 보존할 필요성을 충족하기 위한 간단하고 실용적인 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이 연구의 객관성에 영향을 미칠 수 있는 소속, 회원 자격, 자금 또는 재정 보유에 대해 알지 못합니다.
Acknowledgments
이 작업은 후베이 핵심 연구소 개설 프로젝트(보조금 번호 2021KFY055), 후베이성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020CFB240) 및 중앙 대학 기초 연구 기금(보조금 번호 2042020kf0065)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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