Summary
Methanol kan worden gebruikt als een hulpmedium voor retinale preparaten voor de gehele montage van het netvlies en langdurige opslag, wat nuttig is voor het onderzoek van retinale ganglioncellen.
Abstract
Retinale ganglioncellen (RGC's), de projectieneuronen van het netvlies, verspreiden externe visuele informatie naar de hersenen. Pathologische veranderingen in RGC's hebben een nauwe relatie met tal van retinale degeneratieve ziekten. Whole-mount retinale immunostaining wordt vaak gebruikt in experimentele studies op RGC's om de ontwikkelings- en pathologische omstandigheden van het netvlies te evalueren. Onder sommige omstandigheden moeten sommige waardevolle netvliesmonsters, zoals die van transgene muizen, mogelijk gedurende een lange periode worden bewaard zonder de morfologie of het aantal RGC's te beïnvloeden. Voor geloofwaardige en reproduceerbare experimentele resultaten is het gebruik van een effectief conserveringsmedium essentieel. Hier beschrijven we het effect van methanol als een hulpmedium voor retinale preparaten voor de gehele montage en langdurige opslag. Kortom, tijdens het isolatieproces wordt koude methanol (−20 °C) op het oppervlak van het netvlies gepipetteerd om de weefsels te helpen fixeren en hun permeabiliteit te vergemakkelijken, en vervolgens kunnen de netvliezen worden opgeslagen in koude methanol (−20 °C) voordat ze worden immunogekleurd. Dit protocol beschrijft de retina-isolatieworkflow en het protocol voor de opslag van weefselmonsters, wat nuttig en praktisch is voor het onderzoek van RGC's.
Introduction
Retinale ganglioncellen (RGC's) zijn de enige projectieneuronen in het netvlies en ze integreren en verzenden externe visuele informatie naar de hersenen1. Veel neurodegeneratieve ziekten zoals glaucoom en traumatische optische neuropathie worden gekenmerkt door onomkeerbare schade en verlies van RGCs 2,3. Het analyseren van de morfologische en kwantitatieve veranderingen van RGC's is een cruciale stap om te bepalen hoe neurodegeneratieve ziekten zich ontwikkelen en bevorderen 4,5.
Indirecte immunofluorescentietest is een algemeen aanvaarde methode om de verdeling van eiwitten en het aantal cellen te controleren. In het laboratorium wordt whole-mount retinale immunostaining vaak gebruikt in experimentele studies op RGC's om de fysiologische en pathologische omstandigheden van het netvlies te evalueren6. De meest voorkomende markers die worden gebruikt voor RGC-kwantificering in het hele netvlies zijn Brn3a, RNA-bindend eiwit met multiple splicing (RBPMS), enzovoort 7,8. Het karakteriseren van de hoeveelheid en distributie van RGC's vereist hoogwaardige retinale immunostaining van de hele mount. Over het algemeen wordt het netvlies in immunostainingprotocollen ondergedompeld in chemische fixatieven voordat het wordt geïncubeerd in antilichamen. Ideale fixatieven mogen de vorm van cellen, de toegankelijkheid of affiniteit van de epitopen voor antilichamen of de lineaire afmetingen van het weefsel niet veranderen 9,10.
Vanwege de complexe structuur van het netvlies zijn problemen zoals retinale kwetsbaarheid en vouwen, evenals enkele veel voorkomende problemen, waaronder celkrimp en onduidelijke kernen, vatbaar voor optreden bij het maken van een hele retinale pleister, wat een negatieve invloed heeft op experimenteel onderzoek. Bovendien zijn niet alle netvliezen onmiddellijk immunogekleurd, vooral als het gaat om de netvliezen van transgene muizen met dure prijzen die van kostbare oorsprong zijn, waardoor de extra retinale monsters moeten worden bewaard voor verder gebruik.
De juiste fixatieve oplossing kan het weefsel snel fixeren, weefselautolyse vermijden, de normale morfologie en structuur van de weefselcellen behouden en de antigeniciteit van eiwitten en andere stoffen behouden10. Op dit moment is op formaldehyde gebaseerde fixatie op grote schaal gebruikt in verschillende weefsels, waaronder gescheiden netvliezen, gehemisecteerde oogschelpen en hele oogbollen10. Weefselkrimp en de morfologische verandering van cellen zijn de twee kritieke uitdagingen die zich voordoen na onderdompeling in formaldehyde11. Bovendien ontstaan er steeds meer gemodificeerde fixatieformuleringen om het behoud van de oorspronkelijke eigenschappen van het netvlies en de doelcellente maximaliseren 9,10. Verschillende retinale fixatiebehandelingen kunnen de retinale structuur, eiwitimmunogeniciteit, fluorescentie-excitatie en verzwakkings-bluscyclus anders beïnvloeden12,13. Netvliezen gefixeerd met Davidson's oplossing zijn morfologisch meer intact in vergelijking met die gefixeerd met formaline, maar Davidson's oplossing is minder compatibel met sommige antilichamen, zoals microgliale marker-geïoniseerde calciumbindingsadapter molecuul 112. Gezien de fragiele aard van netvliezen, zouden onderzoekers zich natuurlijk afvragen of de retinale integriteit, evenals de eigenschappen en morfologie van de doelcellen, zullen veranderen na langdurige opslag. De mogelijke effecten van fixatieoplossing op retinale en RGC-celmorfologie na opslag gedurende enkele maanden zijn echter zelden gemeld. De optimalisatie van retinale fixatie is van cruciaal belang voor de evaluatie en het behoud van RGC's.
We geven een gedetailleerde beschrijving van een betrouwbare en technisch eenvoudige methode die we gebruiken voor het hele-mount murine retinale kleuring. Onze methode benadrukt de juiste voorbereiding en opslag van netvliezen voor RGC-onderzoek, rekening houdend met de noodzaak van de langdurige opslag van netvliesweefsel en specifieke aspecten van fluorofoorvorming of -afbraak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Alle gebruikte C57BL/6J-muizen werden verkregen van het Proefdiercentrum van de Universiteit van Wuhan en alle gerelateerde experimenten werden goedgekeurd door het Comité voor de Ethiek van Dierproeven van de Universiteit van Wuhan. Alles werd in het werk gesteld om het lijden van de muizen te minimaliseren.
1. Enucleatie en fixatie van de ogen
- Euthanaseer de muizen met kooldioxide-verstikking en enucleeer de oogbol voorzichtig met een tandeloos pincet.
- Spoel de oogbol eenmaal in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Prik de oogbol met een spuitnaald bij het hoornvlies onder een microscoop (oculair WF: 10x/22; continu vergrotingsobjectief: 0,67x-4,5x) om de fixatie in de oogbol te versnellen en de bevestigingsefficiëntie te verbeteren.
- Breng over op een plaat met 24 putten die 4% paraformaldehyde (PFA) bevat.
- Bevestig de oogbol gedurende 45 minuten in 4% PFA en breng deze vervolgens over naar 1x PBS om overtollige PFA (drie keer wassen, 5 min / tijd) onmiddellijk te verwijderen.
2. Netvliesisolatie en afvlakking
- Breng de oogbol over op een glasplaat en plaats deze onder een ontleedmicroscoop (oculair WF: 10x/22; continu vergrotingsobjectief: 0,67x-4,5x).
- Houd de tang in één hand en gebruik deze om de rand van het hoornvlies vast te klemmen om oogbolbewegingen te voorkomen. Gebruik de andere hand om de ontleedschaar vast te houden en knip rond het hoornvlies op ongeveer 1 mm diepte door de corneosclerale limbus. Verwijder de lens en het glasachtig lichaam.
- Houd de optische schijf in het midden en knip met een ontleedschaar het netvlies radiaal langs de vier kwadranten en bereik ongeveer 2/3 van de straal van het netvlies.
- Klem een van de sclerale randen vast met een getande tang. Houd met de andere hand de rand van de sclera vast met een niet-getande tang en beweeg van waar de sclera is bevestigd door de getande tang naar de basis van de sclera. Pel voorzichtig het netvlies.
- Trek PBS af met een pipet (200 μL) om het netvlies te spoelen en nat te maken en verwijder vervolgens overtollig PBS met een klein stukje absorberend papier. Druk indien nodig het netvlies voorzichtig plat met een kleine borstel.
- Pipetteer langzaam koude methanol (voorgekoeld in een vriezer van −20°C) druppelsgewijs op het binnenoppervlak van het netvlies (het volume methanol is niet gefixeerd, zolang het netvlies volledig door de methanol kan worden bedekt). Het netvlies wordt wit en ontwikkelt een verhoogde vasthoudendheid.
- Druk het netvlies voorzichtig plat en verwijder onzuiverheden zoals resterende pigmentmembranen en het glasachtig lichaam met kleine borstels. Keer het netvlies om met kleine borstels en herhaal het bovengenoemde proces.
- Breng het met methanol behandelde netvlies over in een put van een 24-putplaat en houd het gedrenkt in methanol.
- Bewaar het bij −20°C gedurende 1-2 uur voor onmiddellijke immunokleuring, of laat het netvlies in methanol en bewaar het bij −20°C voor langdurige opslag.
- Verwijder de methanol uit de 24-putplaat en spoel het netvlies af met 1x PBS.
3. Immunofluorescente kleuring van de RGC's
- Breng het netvlies voorzichtig over op een 24-well hemagglutinatieplaat met een plastic Pasteur-pipet en blokkeer in 5% PBS-TX-BSA (5 g runderserumalbuminepoeder opgelost in 100 ml 1x PBST-oplossing; de PBST wordt gevormd door 10 ml Triton X-100 tot 2.000 ml 1 x PBS toe te voegen) bij kamertemperatuur gedurende 4 uur of 's nachts bij 4 °C. Houd het ganglion met de kant omhoog.
- Verwijder de PBS-TX-BSA en incubeer het netvlies bij 4 °C gedurende 48-96 uur, waarbij 100 μL van het geselecteerde primaire antilichaam (cavia anti-RBPMS-antilichaam) wordt toegevoegd met behulp van een verdunning van 1:400.
- Verwijder het primaire antilichaam en spoel het netvlies drie keer (elk 20 minuten) met 1x PBS, schuddend bij kamertemperatuur.
- Incubeer het netvlies met zacht schudden gedurende een nacht bij 4 °C met 100 μL van het overeenkomstige secundaire antilichaam (zie tabel met materialen), cyanine Cy3 affiniPure ezel anti-cavia IgG (H+L), met een verdunning van 1:400.
- Spoel het netvlies drie keer af met 1x PBS (elk 20 min).
- Leg het netvlies plat op de dia met de ganglioncellaag naar boven gericht, laat een geschikte hoeveelheid antifluorescentie-blusmiddel rond het netvlies vallen met een pipet en bedek de dia met een coverslip (pas op dat er geen bubbels zijn).
OPMERKING: Om de juiste hoeveelheid antifluorescentie-quencher te bepalen, moet u ervoor zorgen dat deze het hele netvlies bedekt. Bedek daarna de dia zonder het netvlies te laten zweven en gemakkelijk te laten bewegen. - Sluit de schuif rondom af met een afdichtingsmiddel om te voorkomen dat deze beweegt. Bewaar de monsters bij −20°C en bescherm ze tegen licht.
- Beeld het netvlies in met behulp van een fluorescentie/confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na dissectie moet het netvlies eruit zien als een platte klavertje vier. In deze studie werd het netvlies wit nadat methanol was toegevoegd (figuur 1). Ondertussen veranderde het netvlies van zacht naar buigzaam en plat. Vervolgens werden de RGC's gelabeld met anti-RBPMS8. Vier beeldvelden werden genomen in het netvlies van de hele berg (n = 3) met behulp van een confocale microscoop (oculair: 10x; objectief: 40x). Representatieve beelden van gevisualiseerde RGC's van netvliezen vóór methanolverwerking en na 12 maanden langdurige conservering in methanol, worden getoond in figuur 2. De fluorescentie-intensiteit vertoonde geen significante veranderingen. Methanolconservering had geen invloed op de RGC-immunokleuring.
Figuur 1: Retinale veranderingen na methanolbehandeling. (A) Vóór methanolbehandeling. B) Na behandeling met methanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effect van methanol op retinale ganglioncel (RGC) immunostaining. (A) Netvlies zonder methanolbehandeling. B) Netvlies met 12 maanden opslag in methanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fixatie is een essentiële stap om het netvlies te behouden, wat van invloed kan zijn op eventuele latere RGC-onderzoeken op basis van morfologie. Succesvolle fixatie legt snel de structuur en toestand van de netvliezen vast op het moment dat ze worden blootgesteld aan het bevestigingsmedium, wat van cruciaal belang is voor verdere analyse. Hoewel formaldehyde wordt beschouwd als een van de meest voorkomende fixatiemiddelen voor weefsel- en celfixatie en -conservering, werkt formaldehyde alleen niet altijd goed als het optimale chemische fixatiemiddel voor sommige onderzoeken10,14. Verschillende soorten fixatieven hebben verschillende capaciteiten om aminozuren en nucleotiden neer te slaan, eiwitten te stabiliseren en celmorfologie te behouden15. Door mengsels van beide soorten fixatiemiddelen te gebruiken, kunnen de sterke punten van elk volledig worden benut16,17. Methanol wordt vaak gebruikt in veel fixatieprocedures voordat het weefsel vers wordt ingevroren of ingebed in ideale snijmaterialen16,18. Voor experimenten met gehele montage wordt 100% koude (−20 °C) methanol gebruikt om retinale monsterfixatie te bereiken, wat de monsterpermeabilisatie helpt voor de daaropvolgende op fluorescentie gebaseerde beeldvorming19.
Een belangrijk voordeel van methanolfixatie is dat het gemakkelijk te bewaren is. In dit protocol wordt methanol geleidelijk aan de voor- en achterkant van het netvlies toegevoegd bij −20 °C nadat het netvlies is afgeplat. Het kan gemakkelijk worden waargenomen dat de kleur van het netvlies snel verandert van doorschijnend naar melkachtig wit en de onzuiverheden worden duidelijker. Opgemerkt moet worden dat het netvlies voorzichtig moet worden afgevlakt met een borstel om te voorkomen dat het eromheen krult tijdens het methanol-druppelproces. Na de methanolbehandeling neemt de algehele taaiheid van het netvlies toe, waardoor het minder moeilijk wordt om de onzuiverheden te verwijderen en het netvlies over te brengen. Postfixatie met methanol is handiger voor het bewaren van netvliezen die enigszins vooraf zijn gefixeerd met PFA. Wanneer de vasthoudendheid van het netvlies echter wordt verbeterd, zal de vasthoudendheid van het glasvocht en andere onzuiverheden waarschijnlijk ook dienovereenkomstig toenemen. Men kan proberen om voorzichtig enkele onzuiverheden te verwijderen die gemakkelijk te verwijderen zijn voordat methanol wordt gebruikt, en vervolgens de resterende onzuiverheden te verwijderen na het druppelen van methanol, wat gemakkelijker uit te voeren is. Het vroegtijdig verwijderen van onzuiverheden vereist voldoende oefening en ervaring. Het wordt aanbevolen om het resterende glasachtig lichaam op het netvlies voorzichtig radiaal naar buiten van de optische schijf te borstelen.
In dit protocol wordt het netvlies na de behandeling gedrenkt in methanol en enige tijd in een vriezer van −20 °C geplaatst voordat het vervolgens wordt afgesloten, en andere behandelingen kunnen de taaiheid van het netvlies verder verhogen. Het is echter moeilijk om een precieze tijdsduur te geven die universeel optimaal zou zijn voor onderdompelingsfixatie. Indien nodig kan het netvlies gedurende lange perioden worden opgeslagen in koude methanol.
In dit werk, met de gepresenteerde methodologie, werd de impact van opslag in methanol op RGC-kleuring - een cruciale techniek in retinale kwalitatieve en kwantitatieve evaluaties - onderzocht. met het gebruik van methanol werd de fluorescentie-intensiteit van de RGC's, die de uitkomsten van kwalitatieve en kwantitatieve tests zou beïnvloeden, niet gewijzigd tijdens immunostaining. De netvliezen kunnen voor onbepaalde tijd worden bewaard in een conserveringsoplossing, koude (−20°C) methanol, gedurende ten minste 12 maanden voordat ze worden gekleurd. Bovendien onthulde onze eerdere studie geen significant verschil in RGC-overlevingskans in het oogzenuwverpletteringsmuismodel na langdurige opslag in methanol, en methanolbehoud had ook weinig invloed op de kwantitatieve analyse van de retinale vasculatuur en retinale hypoxie in het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel20. We raden aan om achtereenvolgens 4% PFA en koude (−20 °C) methanol te gebruiken voor de monstervoorbereiding, evenals methanolfixatie voor opslagstrategieën in het laboratorium. Een beperking is dat de analyses subtiele morfologische veranderingen op dendriet- of axonaal niveau niet volledig aantonen, hoewel de dichtheid van de RGC's en de morfologie van de soma niet lijken te veranderen21,22. Opgemerkt moet worden dat we in dit protocol alleen RBPMS voor RGC's hebben getest. Het verder verifiëren van verschillende RGC-eiwitten (bijv. Brn3a, neuronale kernen, neurofilament-L) zou een robuuster resultaat opleveren. Bovendien heeft het protocol ook het potentieel om te worden toegepast op elk ander celtype in het netvlies dat verder onderzoek nodig heeft. Langdurige inademing of directe blootstelling van de huid aan methanol kan echter toxische effecten op het menselijk lichaam veroorzaken. Daarom is het noodzakelijk om goede voorzorgsmaatregelen te nemen tijdens het gebruik van methanol.
Onze methode legt een sterke nadruk op het gebruik van methanolfixatie voor de opslag van netvliezen voor RGC-onderzoeken en benadrukt belangrijke overwegingen met betrekking tot de RGC-kwantificering en fluorescentie-intensiteit. Dit protocol biedt een eenvoudige en praktische methode om te voldoen aan de noodzaak om retinale monsters te bewaren voor verder gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn niet op de hoogte van eventuele affiliaties, lidmaatschappen, financiering of financiële holdings die de objectiviteit van deze studie kunnen beïnvloeden.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Hubei Key Laboratories Opening Project (subsidie nr. 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (grant no. 2020CFB240) en Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
