Retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için metanol bazlı tam montajlı preparat
Summary
Metanol, retinal ganglion hücrelerinin araştırılması için yararlı olan retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak kullanılabilir.
Abstract
Retinanın projeksiyon nöronları olan retinal ganglion hücreleri (RGC’ler), dış görsel bilgiyi beyne yayar. RGC’lerdeki patolojik değişiklikler çok sayıda retinal dejeneratif hastalık ile yakın ilişki içindedir. Tam montajlı retinal immün boyama, retinanın gelişimsel ve patolojik durumlarını değerlendirmek için RGC’ler üzerine yapılan deneysel çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Bazı koşullar altında, transgenik farelerden alınanlar gibi bazı değerli retina örneklerinin, RGC’lerin morfolojisini veya sayısını etkilemeden uzun süre tutulması gerekebilir. Güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel sonuçlar için, etkili bir koruma ortamı kullanmak esastır. Burada, metanolün retinal tüm montaj preparatları ve uzun süreli depolama için yardımcı bir sabit ortam olarak etkisini açıklıyoruz. Kısacası, izolasyon işlemi sırasında, dokuların sabitlenmesine ve geçirgenliklerinin kolaylaştırılmasına yardımcı olmak için retina yüzeyine soğuk metanol (-20 ° C) pipetlenir ve daha sonra retinalar immün boyanmadan önce soğuk metanol (-20 ° C) içinde saklanabilir. Bu protokol, RGC’lerin araştırılması için yararlı ve pratik olan retina izolasyon iş akışını ve doku örneği depolama protokolünü açıklar.
Introduction
Retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) retinadaki tek projeksiyon nöronlarıdır ve dış görsel bilgileri beyne entegre eder ve iletirler1. Glokom ve travmatik optik nöropati gibi birçok nörodejeneratif hastalık, geri dönüşümsüz hasar ve RGC 2,3 kaybı ile karakterizedir. RGC’lerin morfolojik ve kantitatif değişikliklerinin analiz edilmesi, nörodejeneratif hastalıkların nasıl geliştiğini ve ilerlediğini belirlemede çok önemli bir adımdır 4,5.
Dolaylı immünofloresan testi, proteinlerin dağılımını ve hücre sayımını izlemek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntemdir. Laboratuvarda, retina6’nın fizyolojik ve patolojik koşullarını değerlendirmek için RGC’ler üzerinde yapılan deneysel çalışmalarda tam montajlı retinal immünoboyama yaygın olarak kullanılmaktadır. Tüm retinada RGC nicelleştirmesi için kullanılan en yaygın belirteçler arasında Brn3a, çoklu ekleme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve benzeri 7,8 bulunur. RGC’lerin miktarını ve dağılımını karakterize etmek, yüksek kaliteli tam montajlı retinal immün boyama gerektirir. Genel olarak, immün boyama protokollerinde, retina antikorlarda inkübe edilmeden önce kimyasal fiksatiflere daldırılır. İdeal fiksatifler, hücrelerin şeklini, antikorlar için epitopların erişilebilirliğini veya afinitesini veya 9,10 dokusunun doğrusal boyutlarını değiştirmemelidir.
Retinanın karmaşık yapısı nedeniyle, retina kırılganlığı ve katlanması gibi sorunların yanı sıra hücre büzülmesi ve belirsiz çekirdekler gibi bazı yaygın zorluklar, deneysel araştırmalar üzerinde olumsuz bir etkisi olan tam montajlı retina yaması yaparken ortaya çıkmaya eğilimlidir. Ek olarak, tüm retinalar hemen immün boyanmaz, özellikle de değerli kökenli pahalı fiyatlara sahip transgenik farelerin retinaları söz konusu olduğunda, ekstra retinal örneklerin daha fazla kullanım için korunmasını gerektirir.
Uygun fiksatif çözelti dokuyu hızlı bir şekilde düzeltebilir, doku otolizini önleyebilir, doku hücrelerinin normal morfolojisini ve yapısını koruyabilir ve proteinlerin ve diğer maddelerin antijenitesini koruyabilir10. Günümüzde, formaldehit bazlı fiksasyon, ayrılmış retinalar, hemiseke edilmiş göz kapakları ve tüm göz küreleri dahil olmak üzere çeşitli dokularda yaygın olarak kullanılmaktadır10. Doku büzülmesi ve hücrelerin morfolojik değişimi, formaldehit11’e daldırıldıktan sonra karşılaşılan iki kritik zorluktur. Ek olarak, modifiye fiksasyon formülasyonları, retinanın ve hedef hücrelerin orijinal özelliklerinin korunmasını en üst düzeye çıkarmak için giderek daha fazla ortaya çıkmaktadır 9,10. Farklı retina fiksasyon tedavileri retina yapısını, protein immünojenitesini, floresan uyarımını ve zayıflama söndürme döngüsünü farklı şekilde etkileyebilir12,13. Davidson’un çözeltisi ile sabitlenmiş retinalar, formalin ile sabitlenenlere kıyasla morfolojik olarak daha sağlamdır, ancak Davidson’un çözeltisi, mikroglial marker-iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 112 gibi bazı antikorlarla daha az uyumludur. Retinaların kırılgan doğası göz önüne alındığında, araştırmacılar doğal olarak retina bütünlüğünün yanı sıra hedef hücrelerin özelliklerinin ve morfolojisinin uzun süreli depolamadan sonra değişip değişmeyeceğini merak edeceklerdir. Bununla birlikte, fiksasyon solüsyonunun birkaç ay bekletildikten sonra retina ve RGC hücre morfolojisi üzerindeki olası etkileri nadiren bildirilmiştir. Retina fiksasyonunun optimizasyonu, RGC’lerin değerlendirilmesi ve korunması için kritik öneme sahiptir.
Tüm montajlı murin retinal boyama için kullandığımız güvenilir ve teknik olarak basit bir yöntemin ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz. Yöntemimiz, retina dokusunun uzun süreli depolanması ihtiyacının yanı sıra florofor oluşumu veya bozulmasının spesifik yönlerini göz önünde bulundurarak, RGC araştırması için retinaların uygun şekilde hazırlanmasını ve depolanmasını vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiksasyon, retinayı korumak için önemli bir adımdır ve morfolojiye dayalı sonraki RGC araştırmalarını etkileyebilir. Başarılı fiksasyon, retinaların yapısını ve durumunu, daha fazla analiz için kritik olan sabitleme ortamına maruz bıraktıkları anda hızla yakalar. Formaldehit, doku ve hücre fiksasyonu ve korunması için en yaygın sabitleme ajanlarından biri olarak kabul edilmesine rağmen, formaldehit tek başına bazı araştırmalar için en uygun kimyasal fiksatif olarak her zaman iyi çalı?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hubei Anahtar Laboratuvarları Açılış Projesi (hibe no. 2021KFY055), Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (hibe no. 2020CFB240) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (hibe no. 2042020kf0065) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
