Summary
O metanol pode ser usado como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo, o que é útil para a investigação de células ganglionares da retina.
Abstract
As células ganglionares da retina (RGCs), que são os neurônios de projeção da retina, propagam informações visuais externas para o cérebro. As alterações patológicas nos CGRs têm estreita relação com inúmeras doenças degenerativas da retina. A imunomarcação retiniana de montagem total é frequentemente usada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições de desenvolvimento e patologias da retina. Em algumas circunstâncias, algumas amostras valiosas de retina, como as de camundongos transgênicos, podem precisar ser retidas por um longo período sem afetar a morfologia ou o número de RGCs. Para resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis, o uso de um meio de preservação eficaz é essencial. Aqui, descrevemos o efeito do metanol como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo. Em resumo, durante o processo de isolamento, o metanol frio (-20 °C) é pipetado na superfície da retina para ajudar a fixar os tecidos e facilitar sua permeabilidade, e então as retinas podem ser armazenadas em metanol frio (-20 °C) antes de serem imunomarcadas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de isolamento da retina e o protocolo de armazenamento de amostras de tecido, que é útil e prático para a investigação de CGRs.
Introduction
As células ganglionares da retina (CGRs) são os únicos neurônios de projeção na retina, integrando-se e transmitindo informações visuais externas ao cérebro1. Muitas doenças neurodegenerativas, como o glaucoma e a neuropatia óptica traumática, são caracterizadas por danos irreversíveis e perda deCGRs 2,3. Analisar as alterações morfológicas e quantitativas dos CGRs é um passo crucial para determinar como as doenças neurodegenerativas se desenvolvem e avançam 4,5.
O ensaio de imunofluorescência indireta é um método amplamente aceito para monitorar a distribuição de proteínas e contagem celular. Em laboratório, a imunomarcação retiniana de montagem total é comumente utilizada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições fisiológicas e patológicas daretina6. Os marcadores mais comuns utilizados para quantificação de RGC em toda a retina incluem Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e assim por diante 7,8. A caracterização da quantidade e distribuição dos RGCs requer imunomarcação retiniana de alta qualidade em toda a montagem. Geralmente, nos protocolos de imunomarcação, a retina é imersa em fixadores químicos antes de ser incubada em anticorpos. Os fixadores ideais não devem alterar a forma das células, a acessibilidade ou afinidade dos epítopos por anticorpos ou as dimensões lineares do tecido 9,10.
Devido à estrutura complexa da retina, problemas como fragilidade e dobramento da retina, bem como algumas dificuldades comuns, incluindo encolhimento celular e núcleos obscuros, são propensos a ocorrer ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira, o que tem um impacto negativo na pesquisa experimental. Além disso, nem todas as retinas são imunomarcadas imediatamente, especialmente quando se trata de retinas de camundongos transgênicos com preços caros e de origem preciosa, exigindo a preservação das amostras extras de retina para uso posterior.
A solução fixadora apropriada pode fixar o tecido rapidamente, evitar a autólise tecidual, preservar a morfologia e a estrutura normais das células teciduais e manter a antigenicidade de proteínas e outras substâncias10. Atualmente, a fixação à base de formaldeído tem sido amplamente utilizada em vários tecidos, incluindo retinas separadas, copos hemisseccionados e globos oculares inteiros10. A retração tecidual e a alteração morfológica das células são os dois desafios críticos encontrados após a imersão em formaldeído11. Além disso, formulações de fixação modificadas estão surgindo cada vez mais para maximizar a retenção das propriedades originais da retina e das células-alvo 9,10. Diferentes tratamentos de fixação retiniana podem afetar a estrutura retiniana, a imunogenicidade de proteínas, a excitação da fluorescência e o ciclo de têmpera da atenuação de forma diferente12,13. As retinas fixadas com solução de Davidson são morfologicamente mais intactas quando comparadas àquelas fixadas com formalina, mas a solução de Davidson é menos compatível com alguns anticorpos, como a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada a marcadores microgliais 112. Considerando a natureza frágil das retinas, os pesquisadores naturalmente se perguntariam se a integridade da retina, bem como as propriedades e a morfologia das células-alvo, mudarão após o armazenamento de longo prazo. No entanto, os possíveis efeitos da solução de fixação na morfologia das células retinianas e RGC após o armazenamento por vários meses foram raramente relatados. A otimização da fixação retiniana é fundamental para a avaliação e preservação dos CGRs.
Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para coloração de retina murina de montagem total. Nosso método enfatiza o preparo e armazenamento adequado de retinas para investigação de CGR, levando em consideração a necessidade de armazenamento em longo prazo do tecido retiniano, bem como aspectos específicos da formação ou degradação de fluoróforos.
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Protocol
Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todos os camundongos C57BL/6J utilizados foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan, e todos os experimentos relacionados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Wuhan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos camundongos.
1. Enucleação e fixação dos olhos
- Eutanasiar os camundongos com asfixia por dióxido de carbono e enuclear o globo ocular suavemente usando pinças desdentadas.
- Enxaguar o globo ocular uma vez em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Puncionar o globo ocular com uma agulha de seringa na córnea sob um microscópio (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x) para acelerar a fixação no globo ocular e melhorar a eficiência de fixação.
- Transfira para uma placa de 24 poços contendo paraformaldeído (PFA) a 4%.
- Fixe o globo ocular em PFA a 4% por 45 min e, em seguida, transfira-o para 1x PBS para remover o excesso de PFA (lave três vezes, 5 min/tempo) imediatamente.
2. Isolamento e achatamento da retina
- Transferir o globo ocular para uma lâmina de vidro e colocá-lo sob um microscópio dissecante (ocular WF: 10x/22; objetiva de aumento contínuo: 0,67x-4,5x).
- Segure a pinça em uma das mãos e use-a para prender a margem da córnea para evitar o movimento do globo ocular. Use a outra mão para segurar a tesoura dissecante e corte ao redor da córnea a aproximadamente 1 mm de profundidade através do limbo corneoescleral. Remova a lente e o corpo vítreo.
- Segure o disco óptico no centro e, com uma tesoura dissecante, corte a retina radialmente ao longo dos quatro quadrantes, atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina.
- Aperte uma das bordas esclerais usando pinça dentada. Com a outra mão, segure a borda da esclera com pinças não dentadas e mova-se de onde a esclera é fixada pela pinça dentada em direção à base da esclera. Descasque cuidadosamente a retina.
- Retire o PBS usando uma pipeta (200 μL) para lavar e molhar a retina e, em seguida, remova qualquer excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente. Se necessário, achate suavemente a retina com uma pequena escova de cerdas.
- Pipetar lentamente metanol frio (pré-resfriado em um freezer de -20°C) gota a gota na superfície interna da retina (o volume de metanol não é fixo, desde que a retina possa ser completamente coberta pelo metanol). A retina fica branca e desenvolve maior tenacidade.
- Achate suavemente a retina e remova impurezas, como membranas pigmentares residuais e o corpo vítreo, com pequenas escovas de cerdas. Inverta a retina usando pequenas escovas de cerdas e repita o processo mencionado acima.
- Transfira a retina tratada com metanol para um poço de uma placa de 24 poços e mantenha-a embebida em metanol.
- Armazene-o a -20°C por 1-2 h para imunomarcação imediata, ou deixe a retina em metanol e armazene-o a -20°C para armazenamento a longo prazo.
- Retire o metanol da placa de 24 poços e lave a retina com 1x PBS.
3. Coloração por imunofluorescência dos CGRs
- Transfira cuidadosamente a retina para uma placa de hemaglutinação de 24 poços com uma pipeta plástica de Pasteur e bloqueie em 5% PBS-TX-BSA (5 g de pó de albumina de soro bovino dissolvido em 100 mL de solução de 1x PBST; o PBST é formado pela adição de 10 mL de Triton X-100 a 2.000 mL de 1 x PBS) à temperatura ambiente por 4 h ou durante a noite a 4 °C. Mantenha o gânglio para cima.
- Remover o PBS-TX-BSA e incubar a retina a 4 °C por 48-96 h, adicionando 100 μL do anticorpo primário selecionado (anticorpo anti-RBPMS da cobaia) usando uma diluição de 1:400.
- Remova o anticorpo primário e lave a retina três vezes (20 min cada) com 1x PBS, agitando à temperatura ambiente.
- Incubar a retina com agitação suave durante a noite a 4 °C com 100 μL do anticorpo secundário correspondente (ver Tabela de Materiais), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaia IgG (H+L), utilizando uma diluição de 1:400.
- Enxaguar a retina com 1x PBS três vezes (20 min cada).
- Coloque a retina plana na lâmina com a camada de células ganglionares voltada para cima, solte uma quantidade apropriada de agente de têmpera antifluorescência ao redor da retina com uma pipeta e cubra a lâmina com uma lamínula (cuidado para não ter bolhas).
NOTA: Para determinar a quantidade apropriada de quencher antifluorescência, certifique-se de que ele cobre toda a retina. Depois disso, cubra a lâmina sem deixar a retina flutuar e se mover facilmente. - Sele a corrediça toda ao redor com um agente de vedação para evitar que ela se mova. Conservar as amostras a -20°C e protegê-las da luz.
- Imagem da retina usando um microscópio de fluorescência/confocal.
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Representative Results
Após a dissecção, a retina deve parecer um trevo plano de quatro folhas. Neste estudo, utilizando o protocolo descrito acima, a retina ficou branca após a adição de metanol (Figura 1). Enquanto isso, a retina mudou de macia para maleável e plana. Em seguida, os CGRs foram marcados com anti-RBPMS8. Quatro campos de imagem foram obtidos na retina de montagem total (n = 3) usando um microscópio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). Visões representativas dos CGRs visualizados das retinas antes do processamento do metanol e após 12 meses de preservação a longo prazo no metanol são demonstradas na Figura 2. A intensidade da fluorescência não apresentou alterações significativas. A preservação do metanol não afetou a imunomarcação RGC.
Figura 1: Alterações retinianas após tratamento com metanol . (A) Antes do tratamento com metanol. (B) Após tratamento com metanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito do metanol na imunomarcação de células ganglionares da retina (RGC). (A) Retina sem tratamento com metanol. (B) Retina com 12 meses de armazenamento em metanol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fixação é um passo essencial para preservar a retina, o que pode interferir em investigações subsequentes do CGR com base na morfologia. A fixação bem-sucedida captura rapidamente a estrutura e o estado das retinas no momento de expô-las ao meio de fixação, o que é fundamental para uma análise mais aprofundada. Embora o formaldeído tenha sido considerado um dos agentes fixadores mais comuns para fixação e preservação de tecidos e células, o formaldeído isoladamente nem sempre funciona bem como o fixador químico ideal para algumas investigações10,14. Diferentes tipos de fixadores têm capacidades variáveis para precipitar aminoácidos e nucleotídeos, estabilizar proteínas e manter a morfologia celular15. Utilizando-se misturas dos dois tipos de fixadores, as forças de cada um podem ser plenamente utilizadas16,17. O metanol é frequentemente usado em muitos procedimentos de fixação antes que o tecido seja congelado na hora ou incluído em materiais de corte ideais16,18. Para experimentos de montagem inteira, o metanol 100% frio (−20 °C) é usado para obter a fixação da amostra retiniana, que auxilia a permeabilização da amostra para a imagem subsequente baseada em fluorescência19.
Uma das principais vantagens da fixação com metanol é que ela permite fácil preservação. Neste protocolo, o metanol é adicionado à frente e ao dorso da retina progressivamente a -20 °C após a retina ter sido achatada. Pode-se facilmente observar que a cor da retina muda rapidamente de branco translúcido para branco leitoso, e as impurezas tornam-se mais claras. Deve-se notar que a retina deve ser suavemente achatada com uma escova para evitar enrolações ao redor dela durante o processo de gotejamento de metanol. Após o tratamento com metanol, a tenacidade geral da retina aumenta, reduzindo a dificuldade de remover as impurezas e transferir a retina. A pós-fixação com metanol é mais conveniente para preservar retinas que foram ligeiramente pré-fixadas com PFA. No entanto, quando a tenacidade da retina é melhorada, a tenacidade do vítreo e outras impurezas também é susceptível de aumentar em conformidade. Pode-se tentar remover suavemente algumas impurezas que são fáceis de remover antes de usar metanol e, em seguida, remover as impurezas restantes após a adição de metanol por gotejamento, o que é mais fácil de executar. A remoção precoce de impurezas requer prática e experiência suficientes. Recomenda-se escovar suavemente o corpo vítreo restante na retina radialmente para fora do disco óptico.
Neste protocolo, após o tratamento, a retina é embebida em metanol e colocada em um freezer de -20°C por algum tempo antes da vedação subsequente, e outros tratamentos podem aumentar ainda mais a resistência da retina. No entanto, é difícil afirmar um período de tempo preciso que seja universalmente ideal para a fixação por imersão. Se necessário, a retina pode ser armazenada em metanol frio por longos períodos.
Neste trabalho, com a metodologia apresentada, foi examinado o impacto do armazenamento em metanol na coloração do CGR - uma técnica crucial na avaliação qualitativa e quantitativa da retina. com o uso de metanol, a intensidade de fluorescência dos CGRs, que afetaria os resultados dos testes qualitativos e quantitativos, não foi alterada durante a imunomarcação. As retinas puderam ser mantidas indefinidamente em solução conservante, metanol frio (-20°C), por pelo menos 12 meses antes da coloração. Além disso, nosso estudo anterior não revelou diferença significativa na taxa de sobrevivência do CGR no modelo de camundongo esmagado do nervo óptico após armazenamento de longo prazo em metanol, e a preservação do metanol também teve pouco impacto na análise quantitativa da vasculatura retiniana e hipóxia retiniana no modelo de retinopatia induzida por oxigênio20. Recomendamos o uso sequencial de PFA a 4% e metanol frio (−20°C) para a preparação das amostras, bem como a adoção da fixação de metanol para estratégias de armazenamento em laboratório. Uma limitação é que as análises não demonstram completamente alterações morfológicas sutis em nível dendrítico ou axonal, embora a densidade dos CGRs e a morfologia do soma não pareçam sealterar21,22. Ressalta-se que, nesse protocolo, testamos apenas a RBPMS para os RGCs. A verificação adicional de diferentes proteínas RGC (por exemplo, Brn3a, núcleos neuronais, neurofilamento-L) forneceria um resultado mais robusto. Além disso, o protocolo também tem potencial para ser aplicado a qualquer outro tipo de célula na retina que necessite de mais pesquisas. No entanto, a inalação a longo prazo ou a exposição cutânea direta ao metanol podem causar efeitos tóxicos no corpo humano. Portanto, é necessário tomar boas precauções no processo de uso do metanol.
Nosso método coloca uma forte ênfase no uso da fixação de metanol para o armazenamento de retinas para investigações de RGC e destaca considerações importantes sobre a quantificação de RGC e intensidade de fluorescência. Este protocolo fornece um método simples e prático para satisfazer a necessidade de preservar amostras de retina para uso posterior.
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Disclosures
Os autores não estão cientes de quaisquer afiliações, associações, financiamentos ou participações financeiras que possam afetar a objetividade deste estudo.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Abertura dos Laboratórios Chave de Hubei (bolsa nº 2021KFY055), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (bolsa nº 2020CFB240) e Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (bolsa nº 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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