Summary
メタノールは、網膜ホールマウント製剤および長期保存のための補助固定培地として使用することができ、網膜神経節細胞の調査に有用である。
Abstract
網膜の投射ニューロンである網膜神経節細胞(RGC)は、外部の視覚情報を脳に伝播します。RGCの病理学的変化は、多くの網膜変性疾患と密接な関係があります。全マウント網膜免疫染色は、網膜の発生および病理学的状態を評価するためのRGCの実験的研究で頻繁に使用されます。状況によっては、トランスジェニックマウスからのものなど、いくつかの貴重な網膜サンプルを、RGCの形態や数に影響を与えずに長期間保持する必要がある場合があります。信頼できる再現性のある実験結果を得るには、効果的な保存培地の使用が不可欠です。ここでは、網膜ホールマウント製剤および長期保存のための補助固定培地としてのメタノールの効果について述べる。簡単に言うと、単離プロセス中に、冷たいメタノール(-20°C)を網膜の表面にピペットで移して組織を固定し、その透過性を促進し、免疫染色する前に網膜を冷メタノール(-20°C)に保存することができます。このプロトコルは、網膜分離ワークフローと組織サンプル保存プロトコルを記述しており、RGCの調査に有用で実用的です。
Introduction
網膜神経節細胞(RGC)は網膜内の唯一の投射ニューロンであり、外部の視覚情報を統合して脳に伝達します1。緑内障や外傷性視神経障害などの多くの神経変性疾患は、不可逆的な損傷とRGCの喪失を特徴としています2,3。RGCの形態学的および量的変化を分析することは、神経変性疾患がどのように発症し進行するかを決定する上で重要なステップです4,5。
間接免疫蛍光アッセイは、タンパク質の分布と細胞カウントをモニターするために広く受け入れられている方法です。実験室では、網膜の生理学的および病理学的状態を評価するために、RGCの実験的研究で全マウント網膜免疫染色が一般的に使用されています6。網膜全体でRGC定量に使用される最も一般的なマーカーには、Brn3a、多重スプライシングを伴うRNA結合タンパク質(RBPMS)などがあります7,8。RGCの量と分布を特徴付けるには、高品質の全マウント網膜免疫染色が必要です。一般に、免疫染色プロトコルでは、網膜は抗体でインキュベートされる前に化学固定液に浸されます。理想的な固定剤は、細胞の形状、抗体に対するエピトープの接近性または親和性、または組織の直線寸法を変えるべきではない9、10。
網膜の構造が複雑なため、網膜膜の損傷や折り畳みなどの問題や、細胞の収縮や核の不明瞭さなどの一般的な問題が発生しやすく、実験研究に悪影響を及ぼします。さらに、すべての網膜がすぐに免疫染色されるわけではなく、特に貴重な起源の高価な価格のトランスジェニックマウスの網膜に関しては、さらなる使用のために余分な網膜サンプルを保存する必要があります。
適切な固定液は、組織を迅速に固定し、組織の自己消化を回避し、組織細胞の正常な形態と構造を維持し、タンパク質やその他の物質の抗原性を維持することができます10。現在、ホルムアルデヒドベースの固定は、分離された網膜、半切除されたアイカップ、および眼球全体を含む様々な組織において広く使用されている10。組織の収縮と細胞の形態学的変化は、ホルムアルデヒド11に浸した後に直面する2つの重要な課題です。加えて、網膜および標的細胞の本来の特性の保持を最大化するために、修正された固定製剤がますます出現している9、10。異なる網膜固定治療は、網膜構造、タンパク質免疫原性、蛍光励起、および減弱消光サイクルに異なる影響を与える可能性があります12,13。デビッドソンの溶液で固定された網膜は、ホルマリンで固定されたものと比較して形態学的に無傷ですが、デビッドソンの溶液は、ミクログリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子112などの一部の抗体との適合性が低くなります。網膜の脆弱な性質を考えると、研究者は当然、網膜の完全性、ならびに標的細胞の特性と形態が長期保存後に変化するかどうか疑問に思うでしょう。しかし、数ヶ月保存後の網膜およびRGC細胞の形態に対する固定液の影響の可能性はほとんど報告されていません。網膜固定の最適化は、RGCの評価と保存に不可欠です。
全マウントマウス網膜染色に使用する信頼性が高く技術的に簡単な方法の詳細な説明を提供します。私たちの方法は、網膜組織の長期保存の必要性と蛍光色素の形成または分解の特定の側面を考慮して、RGC調査のための網膜の適切な調製と保存を強調しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
全ての工程は、特に断らない限り室温で実施される。使用したすべてのC57BL / 6Jマウスは武漢大学の実験動物センターから入手し、関連するすべての実験は武漢大学の動物実験倫理委員会によって承認されました。マウスの苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力がなされた。
1.目の核摘出と固定
- 二酸化炭素窒息でマウスを安楽死させ、歯のないピンセットを使用して眼球を穏やかに摘出します。
- 眼球をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度すすぎます。
- 顕微鏡下で角膜に注射針で眼球を穿刺し(接眼レンズWF:10倍/22、連続倍率対物レンズ:0.67x-4.5x)、眼球への固定を促進し、固定効率を向上させます。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む24ウェルプレートに移します。
- 眼球を4%PFAで45分間固定した後、1x PBSに移して、すぐに余分なPFAを除去します(3回洗浄、5分/回)。
2.網膜の分離と平坦化
- 眼球をスライドガラスに移し、解剖顕微鏡(接眼レンズWF:10x/22、連続倍率対物レンズ:0.67x-4.5x)の下に置きます。
- 鉗子を片手で持ち、角膜の縁を固定して眼球の動きを防ぎます。もう一方の手で解剖用ハサミを持ち、角膜強膜辺部を通して角膜の周りを約1mmの深さで切ります。レンズと硝子体を取り外します。
- 視神経乳頭を中央に持ち、解剖ハサミを使用して、網膜の半径の約2/3に達する4つの象限に沿って網膜を放射状に切断します。
- 歯付き鉗子を使用して強膜エッジの1つをクランプします。一方、歯のない鉗子で強膜の端を持ち、歯付き鉗子で強膜が固定されている場所から強膜の基部に向かって移動します。網膜を慎重に剥がします。
- ピペット(200 μL)を使用してPBSを吸引し、網膜を洗い流して濡らしてから、小さな吸収紙で余分なPBSを取り除きます。必要に応じて、小さな毛ブラシで網膜をそっと平らにします。
- 冷たいメタノール(-20°C冷凍庫で予冷)をゆっくりとピペットで網膜の内面に滴下します(網膜がメタノールで完全に覆われている限り、メタノールの量は固定されていません)。網膜は白くなり、粘り強さが増します。
- 網膜をやさしく平らにし、残った色素膜や硝子体などの不純物を小さな毛ブラシで取り除きます。小さな毛ブラシを使用して網膜を反転させ、上記のプロセスを繰り返します。
- メタノール処理した網膜を24ウェルプレートのウェルに移し、メタノールに浸したままにします。
- 即時免疫染色のために-20°Cで1〜2時間保存するか、網膜をメタノール中に放置し、-20°Cで長期保存します。
- 24ウェルプレートからメタノールを取り出し、1x PBSで網膜をすすぎます。
3. RGCの免疫蛍光染色
- プラスチックパスツールピペットで網膜を24ウェル赤血球凝集プレートに注意深く移し、5%PBS-TX-BSA(100 mLの1x PBST溶液に溶解した5 gのウシ血清アルブミン粉末;PBSTは、10 mLのTriton X-100を2,000 mLの1 x PBSに添加することによって形成されます)で室温で4時間または4°Cで一晩ブロッキングします。 神経節側を上に保ちます。
- PBS-TX-BSAを除去し、網膜を4°Cで48〜96時間インキュベートし、1:400希釈液を使用して選択した一次抗体(モルモット抗RBPMS抗体)100 μLを加えます。
- 一次抗体を除去し、室温で振とうしながら、1x PBSで網膜を3回(各20分)すすぎます。
- 1:400希釈液を使用して、対応する二次抗体100 μL( 材料表を参照)、シアニンCy3 affiniPureロバ抗モルモットIgG(H + L)を使用して、4°Cで一晩穏やかに振とうしながら網膜をインキュベートします。
- 網膜を1x PBSで3回(各20分)すすぎます。
- 神経節細胞層を上に向けてスライド上に網膜を平らに置き、適量の抗蛍光消光剤をピペットで網膜周囲に滴下し、スライドをカバーガラスで覆います(気泡が入らないように注意してください)。
注意: 抗蛍光消光剤の適切な量を決定するには、それが網膜全体を覆っていることを確認してください。その後、網膜が浮いて簡単に動かないようにスライドを覆います。 - スライドが動かないように、スライドをシール剤で全面的にシールします。サンプルは-20°Cで保存し、光から保護してください。
- 蛍光/共焦点顕微鏡を使用して網膜を画像化します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
解剖後、網膜は平らな四つ葉のクローバーのように見えるはずです。この研究では、上記のプロトコルを使用して、メタノールを添加した後に網膜が白くなりました(図1)。その間、網膜は柔らかいものから柔軟で平らに変わりました。次に、RGCを抗RBPMS8で標識した。共焦点顕微鏡(接眼レンズ:10倍、対物レンズ:40倍)を用いて、全マウント網膜(n=3)の4つの画像視野を撮影した。メタノール処理前およびメタノール中での12ヶ月間の長期保存後の網膜の可視化RGCの代表的なビューを 図2に示します。蛍光強度は有意な変化を示さなかった。メタノールの保存はRGC免疫染色に影響しなかった。
図1:メタノール処理後の網膜の変化 。 (a)メタノール処理前。(b)メタノール処理後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:網膜神経節細胞(RGC)免疫染色に対するメタノールの影響 。 (A)メタノール処理なしの網膜。(B)メタノール中で12ヶ月間保存した網膜。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
固定は網膜を保存するための重要なステップであり、形態に基づくその後のRGC調査に影響を与える可能性があります。固定が成功すると、網膜を固定媒体にさらした瞬間の網膜の構造と状態が迅速にキャプチャされ、これはさらなる分析にとって重要です。ホルムアルデヒドは、組織および細胞の固定および保存のための最も一般的な固定剤の1つと見なされてきましたが、ホルムアルデヒド単独では、一部の調査に最適な化学固定剤として常にうまく機能するとは限りません10,14。固定液の種類が異なれば、アミノ酸やヌクレオチドを沈殿させ、タンパク質を安定化させ、細胞形態を維持する能力も異なります15。両方のタイプの固定剤の混合物を使用することにより、それぞれの長所を十分に活用することができる16、17。メタノールは、組織が新たに凍結されるか、理想的な切断材料に埋め込まれる前に、多くの固定手順で頻繁に使用されます16,18。ホールマウント実験では、100%冷(-20°C)メタノールを使用して網膜サンプルの固定を実現し、その後の蛍光ベースのイメージングのためのサンプル透過処理を支援します19。
メタノール固定の主な利点は、保存が容易であることです。このプロトコルでは、網膜が平らになった後、-20°Cで網膜の前面と背面にメタノールが徐々に添加されます。網膜の色が半透明から乳白色に急速に変化し、不純物がより透明になることを容易に観察することができます。網膜は、メタノール滴下プロセス中に網膜の周りがカールするのを防ぐために、ブラシで穏やかに平らにする必要があることに注意してください。メタノール処理後、網膜の全体的な靭性が向上し、不純物の除去と網膜の移送が困難になります。メタノールによる後固定は、PFAでわずかに固定された網膜を保存するのにより便利です。しかし、網膜の靭性が向上すると、硝子体やその他の不純物の靭性もそれに応じて増加する可能性があります。メタノールを使用する前に簡単に除去できる不純物を穏やかに除去し、メタノールを滴下した後に残りの不純物を除去することを試みることができます。不純物を早期に除去するには、十分な練習と経験が必要です。網膜上の残りの硝子体を視神経乳頭から放射状に外側に優しく磨くことをお勧めします。
このプロトコルでは、治療後、網膜をメタノールに浸し、-20°Cの冷凍庫にしばらく入れてから、その後のシーリングを行い、他の治療により網膜の靭性をさらに高めることができます。しかしながら、浸漬固定に普遍的に最適な正確な時間の長さを述べることは困難である。必要に応じて、網膜を冷たいメタノールに長期間保存することができます。
この研究では、提示された方法論を用いて、網膜の定性的および定量的評価における重要な技術であるRGC染色に対するメタノール中の貯蔵の影響を調べた。メタノールの使用により、定性的および定量的検査の結果に影響を与えるRGCの蛍光強度は、免疫染色中に変化しませんでした。網膜は、染色前に少なくとも12ヶ月間、保存溶液である冷(-20°C)メタノール中で無期限に保持することができます。また,メタノール中長期保存後の視神経挫潰マウスモデルではRGC生存率に有意差は認められず,酸素誘発網膜症モデルにおける網膜血管系および網膜低酸素症の定量解析にもメタノール保存はほとんど影響しなかった20。サンプル調製には4%PFAと冷(-20°C)メタノールを順次使用し、実験室での保管戦略にはメタノール固定を採用することをお勧めします。1つの制限は、RGCの密度と体細胞の形態は変化しないように見えるが、分析が樹状突起または軸索レベルでの微妙な形態学的変化を完全に示していないことである21,22。このプロトコルでは、RGCのRBPMSのみをテストしたことに注意してください。さまざまなRGCタンパク質(Brn3a、神経核、ニューロフィラメント-Lなど)をさらに検証することで、より堅牢な結果が得られます。さらに、このプロトコルは、さらなる研究が必要な網膜の他の細胞タイプにも適用できる可能性があります。ただし、メタノールへの長期吸入または直接皮膚曝露は、人体に毒性作用を引き起こす可能性があります。したがって、メタノールを使用する過程で十分な注意を払う必要があります。
私たちの方法は、RGC調査のための網膜の保存にメタノール固定を使用することに重点を置いており、RGC定量と蛍光強度に関する重要な考慮事項を強調しています。このプロトコルは、さらなる使用のために網膜サンプルを保存する必要性を満たすための簡単で実用的な方法を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、この研究の客観性に影響を与える可能性のある所属、メンバーシップ、資金、または金銭的保有を認識していません。
Acknowledgments
本研究は、湖北省重点研究所開設プロジェクト(助成金番号2021KFY055)、湖北省自然科学財団(助成金番号2020CFB240)、および中央大学の基礎研究資金(助成金番号2042020kf0065)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
