Summary
Il metanolo può essere utilizzato come mezzo fisso ausiliario per preparazioni retiniche a montaggio intero e conservazione a lungo termine, utile per lo studio delle cellule gangliari retiniche.
Abstract
Le cellule gangliari retiniche (RGC), che sono i neuroni di proiezione della retina, propagano le informazioni visive esterne al cervello. I cambiamenti patologici nelle RGC hanno una stretta relazione con numerose malattie degenerative della retina. L'immunocolorazione retinica a montaggio intero è frequentemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni di sviluppo e patologiche della retina. In alcune circostanze, alcuni preziosi campioni di retina, come quelli di topi transgenici, potrebbero dover essere conservati per un lungo periodo senza influenzare la morfologia o il numero di RGC. Per risultati sperimentali credibili e riproducibili, l'utilizzo di un mezzo di conservazione efficace è essenziale. Qui, descriviamo l'effetto del metanolo come mezzo fisso ausiliario per i preparati retinici a montaggio intero e la conservazione a lungo termine. In breve, durante il processo di isolamento, il metanolo freddo (-20 °C) viene pipettato sulla superficie della retina per aiutare a fissare i tessuti e facilitarne la permeabilità, quindi le retine possono essere conservate in metanolo freddo (-20 °C) prima di essere immunocolorate. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di isolamento della retina e il protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, che è utile e pratico per lo studio delle RGC.
Introduction
Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello1. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC 2,3. L'analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano 4,5.
Il saggio di immunofluorescenza indiretta è un metodo ampiamente accettato per monitorare la distribuzione delle proteine e il conteggio delle cellule. In laboratorio, l'immunocolorazione retinica a montaggio intero è comunemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni fisiologiche e patologiche della retina6. I marcatori più comuni utilizzati per la quantificazione RGC nell'intera retina includono Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e così via 7,8. La caratterizzazione della quantità e della distribuzione delle RGC richiede un'immunocolorazione retinica a montaggio intero di alta qualità. Generalmente, nei protocolli di immunocolorazione, la retina viene immersa in fissativi chimici prima di essere incubata in anticorpi. I fissativi ideali non dovrebbero cambiare la forma delle cellule, l'accessibilità o l'affinità degli epitopi per gli anticorpi o le dimensioni lineari del tessuto 9,10.
A causa della complessa struttura della retina, problemi come la fragilità e il ripiegamento della retina, così come alcune difficoltà comuni tra cui il restringimento delle cellule e nuclei poco chiari, sono inclini a verificarsi quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero, che ha un impatto negativo sulla ricerca sperimentale. Inoltre, non tutte le retine sono immunocolorate immediatamente, specialmente quando si tratta di retine di topi transgenici con prezzi costosi che sono di origine preziosa, rendendo necessaria la conservazione dei campioni retinici extra per un ulteriore utilizzo.
La soluzione fissativa appropriata può fissare rapidamente il tessuto, evitare l'autolisi tissutale, preservare la normale morfologia e struttura delle cellule tissutali e mantenere l'antigenicità delle proteine e di altre sostanze10. Allo stato attuale, la fissazione a base di formaldeide è stata ampiamente utilizzata in vari tessuti, tra cui retine separate, conchiglie oculari emisecate e bulbi oculari interi10. Il restringimento tissutale e l'alterazione morfologica delle cellule sono le due sfide critiche incontrate dopo l'immersione in formaldeide11. Inoltre, stanno emergendo sempre più formulazioni di fissazione modificate per massimizzare la conservazione delle proprietà originali della retina e delle cellule bersaglio 9,10. Diversi trattamenti di fissazione retinica possono influenzare la struttura retinica, l'immunogenicità delle proteine, l'eccitazione della fluorescenza e il ciclo di tempra dell'attenuazione in modo diverso12,13. Le retine fissate con la soluzione di Davidson sono morfologicamente più intatte rispetto a quelle fissate con formalina, ma la soluzione di Davidson è meno compatibile con alcuni anticorpi, come la molecola 112 dell'adattatore legante il calcio ionizzato con marcatore microgliale. Considerando la natura fragile delle retine, i ricercatori si chiederanno naturalmente se l'integrità della retina, così come le proprietà e la morfologia delle cellule bersaglio, cambieranno dopo la conservazione a lungo termine. Tuttavia, i possibili effetti della soluzione di fissazione sulla morfologia delle cellule retiniche e RGC dopo la conservazione per diversi mesi sono stati raramente riportati. L'ottimizzazione della fissazione retinica è fondamentale per la valutazione e la conservazione delle RGC.
Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per la colorazione retinica murina a montaggio intero. Il nostro metodo enfatizza la corretta preparazione e conservazione delle retine per l'indagine RGC, tenendo conto della necessità di conservazione a lungo termine del tessuto retinico e degli aspetti specifici della formazione o della degradazione dei fluorofori.
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Protocol
Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. Tutti i topi C57BL / 6J utilizzati sono stati ottenuti dal Laboratory Animal Center dell'Università di Wuhan e tutti gli esperimenti correlati sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Wuhan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza dei topi.
1. Enucleazione e fissazione degli occhi
- Eutanasia dei topi con asfissia di anidride carbonica ed enucleare delicatamente il bulbo oculare usando una pinzetta senza denti.
- Risciacquare il bulbo oculare una volta in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
- Forare il bulbo oculare con un ago da siringa sulla cornea al microscopio (oculare WF: 10x/22; obiettivo di ingrandimento continuo: 0,67x-4,5x) per accelerare la fissazione nel bulbo oculare e migliorare l'efficienza di fissaggio.
- Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente il 4% di paraformaldeide (PFA).
- Fissare il bulbo oculare in PFA al 4% per 45 minuti, quindi trasferirlo a 1x PBS per rimuovere immediatamente il PFA in eccesso (lavare tre volte, 5 minuti / tempo).
2. Isolamento e appiattimento della retina
- Trasferire il bulbo oculare su un vetrino e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione (oculare WF: 10x/22; obiettivo di ingrandimento continuo: 0,67x-4,5x).
- Tenere la pinza in una mano e usarla per bloccare il margine della cornea per impedire il movimento del bulbo oculare. Utilizzare l'altra mano per tenere le forbici da dissezione e tagliare intorno alla cornea a circa 1 mm di profondità attraverso il limbus corneosclerale. Rimuovere la lente e il corpo vitreo.
- Tenere il disco ottico al centro e, usando le forbici da dissezione, tagliare la retina radialmente lungo i quattro quadranti, raggiungendo circa i 2/3 del raggio della retina.
- Morseggiare uno dei bordi sclerali usando una pinza dentata. Con l'altra mano, tenere il bordo della sclera con una pinza non dentata e spostarsi da dove la sclera è fissata dalla pinza dentata verso la base della sclera. Sbucciare con cura la retina.
- Estrarre il PBS utilizzando una pipetta (200 μL) per lavare e bagnare la retina, quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente. Se necessario, appiattire delicatamente la retina con una piccola spazzola a setole.
- Pipettare lentamente il metanolo freddo (preraffreddato in un congelatore a -20°C) goccia a goccia sulla superficie interna della retina (il volume di metanolo non è fisso, purché la retina possa essere completamente coperta dal metanolo). La retina diventa bianca e sviluppa una maggiore tenacità.
- Appiattire delicatamente la retina e rimuovere le impurità come le membrane pigmentarie residue e il corpo vitreo con piccole spazzole di setole. Capovolgere la retina usando piccoli pennelli a setole e ripetere il processo sopra menzionato.
- Trasferire la retina trattata con metanolo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e tenerla imbevuta di metanolo.
- Conservarlo a -20°C per 1-2 ore per un'immunocolorazione immediata, oppure lasciare la retina in metanolo e conservarlo a -20°C per la conservazione a lungo termine.
- Rimuovere il metanolo dalla piastra a 24 pozzetti e sciacquare la retina con 1x PBS.
3. Colorazione immunofluorescente delle RGC
- Trasferire con cautela la retina su una piastra di emoagglutinazione a 24 pozzetti con una pipetta Pasteur di plastica e bloccare il 5% di PBS-TX-BSA (5 g di polvere di albumina sierica bovina sciolta in 100 ml di soluzione 1x PBST; il PBST si forma aggiungendo 10 ml di Triton X-100 a 2.000 ml di 1 x PBS) a temperatura ambiente per 4 ore o durante la notte a 4 °C. Tenere il ganglio rivolto verso l'alto.
- Rimuovere il PBS-TX-BSA, e incubare la retina a 4 °C per 48-96 ore, aggiungendo 100 μL dell'anticorpo primario selezionato (anticorpo anti-RBPMS cavia) utilizzando una diluizione 1:400.
- Rimuovere l'anticorpo primario e sciacquare la retina tre volte (20 minuti ciascuna) con 1x PBS, agitando a temperatura ambiente.
- Incubare la retina agitando delicatamente per una notte a 4 °C con 100 μL del corrispondente anticorpo secondario (vedere tabella dei materiali), cianina Cy3 affiniPuro porcellino d'asino anti-cavia IgG (H + L), utilizzando una diluizione 1:400.
- Risciacquare la retina con 1x PBS tre volte (20 minuti ciascuna).
- Appoggiare la retina piatta sul vetrino con lo strato di cellule gangliari rivolto verso l'alto, far cadere una quantità appropriata di agente di estinzione anti-fluorescenza intorno alla retina con una pipetta e coprire il vetrino con un coprivetrino (fare attenzione a non avere bolle).
NOTA: Per determinare la quantità appropriata di quencher anti fluorescenza, assicurarsi che copra l'intera retina. Successivamente, coprire il vetrino senza consentire alla retina di galleggiare e muoversi facilmente. - Sigillare il vetrino tutt'intorno con un sigillante per evitare che si muova. Conservare i campioni a -20°C e proteggerli dalla luce.
- Immagine della retina utilizzando un microscopio a fluorescenza / confocale.
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Representative Results
Dopo la dissezione, la retina dovrebbe apparire come un trifoglio piatto a quattro foglie. In questo studio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la retina è diventata bianca dopo l'aggiunta di metanolo (Figura 1). Nel frattempo, la retina è cambiata da morbida a flessibile e piatta. Successivamente, gli RGC sono stati etichettati con anti-RBPMS8. Quattro campi di immagini sono stati presi nella retina a montatura intera (n = 3) utilizzando un microscopio confocale (oculare: 10x; obiettivo: 40x). Le viste rappresentative delle RGC visualizzate delle retine prima del trattamento del metanolo e dopo 12 mesi di conservazione a lungo termine nel metanolo sono dimostrate nella Figura 2. L'intensità della fluorescenza non ha mostrato cambiamenti significativi. La conservazione del metanolo non ha influenzato l'immunocolorazione RGC.
Figura 1: Alterazioni retiniche dopo il trattamento con metanolo. (A) Prima del trattamento con metanolo. (B) Dopo il trattamento con metanolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetto del metanolo sull'immunocolorazione delle cellule gangliari retiniche (RGC). (A) Retina senza trattamento con metanolo. (B) Retina con 12 mesi di conservazione in metanolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La fissazione è un passaggio essenziale per preservare la retina, che può influire su eventuali successive indagini RGC basate sulla morfologia. Una fissazione di successo cattura rapidamente la struttura e lo stato delle retine al momento di esporle al mezzo di fissaggio, che è fondamentale per ulteriori analisi. Sebbene la formaldeide sia stata considerata uno degli agenti fissanti più comuni per la fissazione e la conservazione di tessuti e cellule, la formaldeide da sola non sempre funziona bene come fissativo chimico ottimale per alcune indagini10,14. Diversi tipi di fissativi hanno diverse capacità di precipitare amminoacidi e nucleotidi, stabilizzare le proteine e mantenere la morfologia cellulare15. Utilizzando miscele di entrambi i tipi di agenti fissativi, i punti di forza di ciascuno possono essere pienamente utilizzati16,17. Il metanolo è spesso utilizzato in molte procedure di fissazione prima che il tessuto sia appena congelato o incorporato in materiali da taglio ideali16,18. Per gli esperimenti a montaggio intero, viene utilizzato metanolo freddo al 100% (-20 °C) per ottenere la fissazione del campione retinico, che aiuta la permeabilizzazione del campione per la successiva imaging basata sulla fluorescenza19.
Un vantaggio chiave della fissazione del metanolo è che consente una facile conservazione. In questo protocollo, il metanolo viene aggiunto progressivamente alla parte anteriore e posteriore della retina a -20 °C dopo che la retina è stata appiattita. Si può facilmente osservare che il colore della retina cambia rapidamente da traslucido a bianco latte e le impurità diventano più chiare. Va notato che la retina deve essere delicatamente appiattita con un pennello per evitare di arricciarsi intorno ad essa durante il processo di gocciolamento del metanolo. Dopo il trattamento con metanolo, aumenta la tenacità complessiva della retina, riducendo la difficoltà di rimuovere le impurità e trasferire la retina. La post-fissazione con metanolo è più conveniente per preservare le retine che sono state leggermente prefissate con PFA. Tuttavia, quando la tenacità della retina è migliorata, è probabile che anche la tenacità del vitreo e di altre impurità aumenti di conseguenza. Si può provare a rimuovere delicatamente alcune impurità che sono facili da rimuovere prima di usare il metanolo, e quindi rimuovere le impurità rimanenti dopo l'aggiunta a goccia di metanolo, che è più facile da eseguire. La rimozione precoce delle impurità richiede sufficiente pratica ed esperienza. Si consiglia di spazzolare delicatamente il corpo vitreo rimanente sulla retina radialmente verso l'esterno dal disco ottico.
In questo protocollo, dopo il trattamento, la retina viene imbevuta di metanolo e posta in un congelatore a -20°C per qualche tempo prima della successiva sigillatura, e altri trattamenti potrebbero aumentare ulteriormente la tenacità della retina. Tuttavia, è difficile stabilire un periodo di tempo preciso che sarebbe universalmente ottimale per la fissazione per immersione. Se necessario, la retina potrebbe essere conservata in metanolo freddo per lunghi periodi.
In questo lavoro, con la metodologia presentata, è stato esaminato l'impatto della conservazione in metanolo sulla colorazione RGC - una tecnica cruciale nelle valutazioni qualitative e quantitative della retina. con l'uso del metanolo, l'intensità di fluorescenza degli RGC, che influenzerebbe i risultati dei test qualitativi e quantitativi, non è stata alterata durante l'immunocolorazione. Le retine potrebbero essere conservate indefinitamente in una soluzione conservante, metanolo freddo (-20°C), per almeno 12 mesi prima della colorazione. Inoltre, il nostro studio precedente non ha rivelato alcuna differenza significativa nel tasso di sopravvivenza RGC nel modello murino di schiacciamento del nervo ottico dopo la conservazione a lungo termine in metanolo, e la conservazione del metanolo ha anche avuto un impatto minimo sull'analisi quantitativa della vascolarizzazione retinica e dell'ipossia retinica nel modello di retinopatia indotta da ossigeno20. Si consiglia di utilizzare il 4% di PFA e metanolo freddo (-20 ° C) sequenzialmente per la preparazione del campione, nonché di adottare la fissazione del metanolo per le strategie di conservazione in laboratorio. Una limitazione è che le analisi non dimostrano pienamente sottili cambiamenti morfologici a livello di dendriti o assoni, sebbene la densità delle RGC e la morfologia del soma non sembrino cambiare21,22. Va notato che, in questo protocollo, abbiamo testato RBPMS solo per RGC. Un'ulteriore verifica di diverse proteine RGC (ad esempio, Brn3a, nuclei neuronali, neurofilamento-L) fornirebbe un risultato più robusto. Inoltre, il protocollo ha anche il potenziale per essere applicato a qualsiasi altro tipo di cellula nella retina che necessita di ulteriori ricerche. Tuttavia, l'inalazione a lungo termine o l'esposizione cutanea diretta al metanolo possono causare effetti tossici sul corpo umano. Pertanto, è necessario prendere buone precauzioni nel processo di utilizzo del metanolo.
Il nostro metodo pone una forte enfasi sull'uso della fissazione del metanolo per la conservazione delle retine per le indagini RGC e mette in evidenza importanti considerazioni riguardanti la quantificazione RGC e l'intensità della fluorescenza. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e pratico per soddisfare la necessità di conservare campioni retinici per un ulteriore utilizzo.
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Disclosures
Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, appartenenze, finanziamenti o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dall'Hubei Key Laboratories Opening Project (sovvenzione n. 2021KFY055), dalla Natural Science Foundation of Hubei Province (grant n. 2020CFB240) e dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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