Summary
Le méthanol peut être utilisé comme milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme, ce qui est utile pour l’investigation des cellules ganglionnaires de la rétine.
Abstract
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui sont les neurones de projection de la rétine, propagent des informations visuelles externes au cerveau. Les changements pathologiques dans les RGC ont une relation étroite avec de nombreuses maladies dégénératives de la rétine. L’immunomarquage rétinien à montage entier est fréquemment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions développementales et pathologiques de la rétine. Dans certaines circonstances, certains échantillons précieux de rétine, tels que ceux provenant de souris transgéniques, peuvent devoir être conservés pendant une longue période sans affecter la morphologie ou le nombre de CGR. Pour des résultats expérimentaux crédibles et reproductibles, l’utilisation d’un milieu de conservation efficace est essentielle. Ici, nous décrivons l’effet du méthanol en tant que milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme. En bref, pendant le processus d’isolement, du méthanol froid (-20 °C) est pipeté à la surface de la rétine pour aider à fixer les tissus et faciliter leur perméabilité, puis les rétines peuvent être stockées dans du méthanol froid (-20 °C) avant d’être immunocolorées. Ce protocole décrit le flux de travail d’isolement de la rétine et le protocole de stockage des échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour l’étude des CGR.
Introduction
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont les seuls neurones de projection dans la rétine, et elles intègrent et transmettent des informations visuelles extérieures au cerveau1. De nombreuses maladies neurodégénératives telles que le glaucome et la neuropathie optique traumatique sont caractérisées par des dommages irréversibles et la perte deCGR2,3. L’analyse des changements morphologiques et quantitatifs des CGR est une étape cruciale pour déterminer comment les maladies neurodégénératives se développent et progressent 4,5.
Le test d’immunofluorescence indirecte est une méthode largement acceptée pour surveiller la distribution des protéines et le comptage cellulaire. En laboratoire, l’immunomarquage rétinien à montage entier est couramment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions physiologiques et pathologiques de la rétine6. Les marqueurs les plus couramment utilisés pour la quantification du RGC dans l’ensemble de la rétine comprennent Brn3a, protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), et ainsi de suite 7,8. La caractérisation de la quantité et de la distribution des CGR nécessite une immunocoloration rétinienne de haute qualité à montage entier. Généralement, dans les protocoles d’immunomarquage, la rétine est immergée dans des fixateurs chimiques avant d’être incubée dans des anticorps. Les fixateurs idéaux ne doivent pas modifier la forme des cellules, l’accessibilité ou l’affinité des épitopes pour les anticorps, ni les dimensions linéaires du tissu 9,10.
En raison de la structure complexe de la rétine, des problèmes tels que la fragilité et le repliement de la rétine, ainsi que certaines difficultés courantes, notamment le rétrécissement des cellules et des noyaux peu clairs, sont susceptibles de se produire lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier, ce qui a un impact négatif sur la recherche expérimentale. En outre, toutes les rétines ne sont pas immunocolorées immédiatement, en particulier lorsqu’il s’agit des rétines de souris transgéniques à des prix élevés et d’origine précieuse, ce qui nécessite la préservation des échantillons rétiniens supplémentaires pour une utilisation ultérieure.
La solution fixatrice appropriée peut fixer rapidement le tissu, éviter l’autolyse tissulaire, préserver la morphologie et la structure normales des cellules tissulaires et conserver l’antigénicité des protéines et autres substances10. À l’heure actuelle, la fixation à base de formaldéhyde a été largement utilisée dans divers tissus, y compris les rétines séparées, les œillets hémisectés et les globes oculaires entiers10. Le rétrécissement tissulaire et l’altération morphologique des cellules sont les deux défis critiques rencontrés après l’immersion dans le formaldéhyde11. De plus, des formulations de fixation modifiées voient de plus en plus le jour pour maximiser la rétention des propriétés originales de la rétine et des cellules cibles 9,10. Différents traitements de fixation rétinienne peuvent affecter différemment la structure rétinienne, l’immunogénicité des protéines, l’excitation par fluorescence et le cycle de tremped’atténuation 12,13. Les rétines fixées avec la solution de Davidson sont plus morphologiquement intactes que celles fixées avec du formol, mais la solution de Davidson est moins compatible avec certains anticorps, tels que la molécule d’adaptateur de liaison au calcium ionisée par marqueur microglial 112. Compte tenu de la nature fragile des rétines, les chercheurs se demanderaient naturellement si l’intégrité rétinienne, ainsi que les propriétés et la morphologie des cellules cibles, changeront après un stockage à long terme. Cependant, les effets possibles de la solution de fixation sur la morphologie des cellules rétiniennes et RGC après stockage pendant plusieurs mois ont rarement été rapportés. L’optimisation de la fixation rétinienne est essentielle pour l’évaluation et la préservation des CGR.
Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour la coloration rétinienne murine à montage entier. Notre méthode met l’accent sur la préparation et le stockage appropriés des rétines pour l’investigation du CGR, en tenant compte de la nécessité de stockage à long terme du tissu rétinien ainsi que des aspects spécifiques de la formation ou de la dégradation des fluorophores.
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Protocol
Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les souris C57BL / 6J utilisées ont été obtenues auprès du Centre des animaux de laboratoire de l’Université de Wuhan, et toutes les expériences connexes ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Wuhan. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance des souris.
1. Énucléation et fixation des yeux
- Euthanasier les souris avec une asphyxie au dioxyde de carbone et énucléer doucement le globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler édentée.
- Rincer le globe oculaire une fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Percer le globe oculaire avec une aiguille de seringue au niveau de la cornée au microscope (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x) pour accélérer la fixation dans le globe oculaire et améliorer l’efficacité de fixation.
- Transférer dans une plaque de 24 puits contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA).
- Fixez le globe oculaire dans 4% PFA pendant 45 min, puis transférez-le sur 1x PBS pour éliminer l’excès de PFA (laver trois fois, 5 min / temps) immédiatement.
2. Isolement et aplatissement de la rétine
- Transférez le globe oculaire sur une lame de verre et placez-le sous un microscope à dissection (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x).
- Tenez la pince dans une main et utilisez-la pour serrer la marge de la cornée afin d’empêcher le mouvement du globe oculaire. Utilisez l’autre main pour tenir les ciseaux à dissection et couper autour de la cornée à environ 1 mm de profondeur à travers le limbe cornéoscléral. Retirez la lentille et le corps vitreux.
- Tenez le disque optique au centre et, à l’aide de ciseaux disséquants, coupez la rétine radialement le long des quatre quadrants, atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine.
- Serrez l’un des bords scléraux à l’aide d’une pince dentée. De l’autre main, tenez le bord de la sclérotique avec une pince non dentée et déplacez-vous de l’endroit où la sclérotique est fixée par la pince dentée vers la base de la sclérotique. Pelez soigneusement la rétine.
- Aspirez le PBS à l’aide d’une pipette (200 μL) pour rincer et mouiller la rétine, puis retirez tout excès de PBS avec un petit morceau de papier absorbant. Si nécessaire, aplatissez doucement la rétine avec une petite brosse à poils.
- Pipeter lentement le méthanol froid (prérefroidi dans un congélateur à −20°C) goutte à goutte sur la surface interne de la rétine (le volume de méthanol n’est pas fixé, tant que la rétine peut être complètement recouverte par le méthanol). La rétine devient blanche et développe une ténacité accrue.
- Aplatir doucement la rétine et éliminer les impuretés telles que les membranes pigmentaires résiduelles et le corps vitré avec de petites brosses à poils. Inverser la rétine à l’aide de petites brosses à poils et répéter le processus mentionné ci-dessus.
- Transférez la rétine traitée au méthanol dans un puits d’une plaque de 24 puits et maintenez-la trempée dans du méthanol.
- Conservez-le à -20 °C pendant 1 à 2 h pour une immunocoloration immédiate, ou laissez la rétine dans le méthanol et conservez-le à -20 °C pour un stockage à long terme.
- Retirez le méthanol de la plaque à 24 puits et rincez la rétine avec 1x PBS.
3. Coloration immunofluorescente des CGR
- Transférer délicatement la rétine dans une plaque d’hémagglutination de 24 puits à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et bloquer dans 5 % de PBS-TX-BSA (5 g de poudre d’albumine sérique bovine dissoute dans 100 mL de 1x solution PBST; le PBST est formé en ajoutant 10 mL de Triton X-100 à 2 000 mL de 1 x PBS) à température ambiante pendant 4 h ou pendant une nuit à 4 °C. Gardez le côté ganglion vers le haut.
- Retirer le PBS-TX-BSA et incuber la rétine à 4 °C pendant 48-96 h, en ajoutant 100 μL de l’anticorps primaire sélectionné (anticorps anti-RBPMS du cobaye) en utilisant une dilution de 1:400.
- Retirez l’anticorps primaire et rincez la rétine trois fois (20 min chacune) avec 1x PBS, en agitant à température ambiante.
- Incuber la rétine en agitant doucement pendant une nuit à 4 °C avec 100 μL de l’anticorps secondaire correspondant (voir le tableau des matériaux), cyanine Cy3 affiniPure âne anti-cobaye IgG (H+L), en utilisant une dilution de 1:400.
- Rincer la rétine avec 1x PBS trois fois (20 min chacune).
- Posez la rétine à plat sur la lame avec la couche de cellules ganglionnaires tournée vers le haut, déposez une quantité appropriée d’agent de trempe antifluorescence autour de la rétine avec une pipette et couvrez la lame avec une lamelle de couverture (veillez à ne pas avoir de bulles).
REMARQUE: Pour déterminer la quantité appropriée d’anti-fluorescence, assurez-vous qu’il couvre toute la rétine. Après cela, couvrez la lame sans permettre à la rétine de flotter et de bouger facilement. - Scellez la lame tout autour avec un agent d’étanchéité pour l’empêcher de bouger. Conservez les échantillons à −20°C et à l’abri de la lumière.
- Imagez la rétine à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence.
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Representative Results
Après la dissection, la rétine devrait ressembler à un trèfle plat à quatre feuilles. Dans cette étude, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, la rétine est devenue blanche après l’ajout de méthanol (Figure 1). Pendant ce temps, la rétine est passée de molle à souple et plate. Ensuite, les RGC ont été étiquetés avec anti-RBPMS8. Quatre champs d’image ont été pris dans la rétine à monture entière (n = 3) à l’aide d’un microscope confocal (oculaire : 10x ; objectif : 40x). Des vues représentatives des CGR visualisés des rétines avant le traitement du méthanol et après 12 mois de conservation à long terme dans le méthanol sont démontrées à la figure 2. L’intensité de fluorescence n’a montré aucun changement significatif. La préservation du méthanol n’a pas affecté l’immunomarquage du CGR.
Figure 1 : Modifications rétiniennes après traitement au méthanol. (A) Avant traitement au méthanol. (B) Après traitement au méthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet du méthanol sur l’immunomarquage des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). (A) Rétine sans traitement au méthanol. (B) Rétine avec stockage de 12 mois dans du méthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La fixation est une étape essentielle pour préserver la rétine, ce qui peut avoir un impact sur les investigations ultérieures du RGC basées sur la morphologie. Une fixation réussie capture rapidement la structure et l’état des rétines au moment de les exposer au milieu de fixation, ce qui est essentiel pour une analyse plus approfondie. Bien que le formaldéhyde ait été considéré comme l’un des agents de fixation les plus courants pour la fixation et la conservation des tissus et des cellules, le formaldéhyde seul ne fonctionne pas toujours bien comme fixateur chimique optimal pour certaines études10,14. Différents types de fixateurs ont des capacités variables pour précipiter les acides aminés et les nucléotides, stabiliser les protéines et maintenir la morphologie cellulaire15. En utilisant des mélanges des deux types d’agents fixateurs, les forces de chacun peuvent être pleinement utilisées16,17. Le méthanol est fréquemment utilisé dans de nombreuses procédures de fixation avant que le tissu ne soit fraîchement congelé ou incorporé dans des matériaux de coupe idéaux16,18. Pour les expériences sur montage entier, du méthanol froid à 100 % (−20 °C) est utilisé pour obtenir une fixation de l’échantillon rétinien, ce qui facilite la perméabilisation de l’échantillon pour l’imagerie ultérieure basée sur la fluorescence19.
Un avantage clé de la fixation au méthanol est qu’elle permet une conservation facile. Dans ce protocole, le méthanol est ajouté à l’avant et à l’arrière de la rétine progressivement à -20 °C après l’aplatissement de la rétine. On peut facilement observer que la couleur de la rétine passe rapidement du blanc translucide au blanc laiteux et que les impuretés deviennent plus claires. Il convient de noter que la rétine doit être aplatie doucement avec une brosse pour éviter de s’enrouler autour d’elle pendant le processus d’égouttement de méthanol. Après le traitement au méthanol, la ténacité globale de la rétine augmente, ce qui réduit la difficulté d’éliminer les impuretés et de transférer la rétine. La post-fixation avec du méthanol est plus pratique pour préserver les rétines qui ont été légèrement préfixées avec PFA. Cependant, lorsque la ténacité de la rétine est améliorée, la ténacité du vitré et d’autres impuretés est également susceptible d’augmenter en conséquence. On peut essayer d’éliminer doucement certaines impuretés faciles à éliminer avant d’utiliser du méthanol, puis d’éliminer les impuretés restantes après l’ajout de méthanol goutte à goutte, ce qui est plus facile à réaliser. L’élimination précoce des impuretés nécessite suffisamment de pratique et d’expérience. Il est recommandé de brosser doucement le corps vitré restant sur la rétine radialement vers l’extérieur du disque optique.
Dans ce protocole, après le traitement, la rétine est trempée dans du méthanol et placée dans un congélateur à -20 ° C pendant un certain temps avant le scellement ultérieur, et d’autres traitements pourraient encore augmenter la ténacité de la rétine. Cependant, il est difficile d’indiquer une durée précise qui serait universellement optimale pour la fixation par immersion. Si nécessaire, la rétine pourrait être stockée dans du méthanol froid pendant de longues périodes.
Dans ce travail, avec la méthodologie présentée, l’impact du stockage dans le méthanol sur la coloration RGC - une technique cruciale dans les évaluations qualitatives et quantitatives de la rétine - a été examiné. avec l’utilisation du méthanol, l’intensité de fluorescence des CGR, qui affecterait les résultats des essais qualitatifs et quantitatifs, n’a pas été modifiée pendant l’immunomarquage. Les rétines pourraient être conservées indéfiniment dans une solution de conservation, du méthanol froid (-20 °C), pendant au moins 12 mois avant la coloration. De plus, notre étude précédente n’a révélé aucune différence significative dans le taux de survie au CGR dans le modèle murin d’écrasement du nerf optique après stockage à long terme dans du méthanol, et la préservation du méthanol a également eu peu d’impact sur l’analyse quantitative du système vasculaire rétinien et de l’hypoxie rétinienne dans le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène20. Nous recommandons d’utiliser séquentiellement du PFA à 4 % et du méthanol froid (−20 °C) pour la préparation des échantillons, ainsi que d’adopter la fixation du méthanol pour les stratégies de stockage en laboratoire. Une limite est que les analyses ne démontrent pas pleinement les changements morphologiques subtils au niveau de la dendrite ou de l’axon, bien que la densité des RGC et la morphologie du soma ne semblent pas changer21,22. Il convient de noter que, dans ce protocole, nous n’avons testé que les RBPMS pour les CGR. Une vérification plus poussée des différentes protéines RGC (p. ex. Brn3a, noyaux neuronaux, neurofilament-L) fournirait un résultat plus robuste. De plus, le protocole a également le potentiel d’être appliqué à tout autre type de cellule de la rétine qui nécessite des recherches supplémentaires. Cependant, l’inhalation à long terme ou l’exposition cutanée directe au méthanol peut avoir des effets toxiques sur le corps humain. Par conséquent, il est nécessaire de prendre de bonnes précautions lors de l’utilisation du méthanol.
Notre méthode met fortement l’accent sur l’utilisation de la fixation au méthanol pour le stockage des rétines pour les études de CGR et met en évidence des considérations importantes concernant la quantification du CGR et l’intensité de fluorescence. Ce protocole fournit une méthode simple et pratique pour satisfaire à la nécessité de préserver les échantillons rétiniens pour une utilisation ultérieure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont connaissance d’aucune affiliation, adhésion, financement ou participation financière qui pourrait affecter l’objectivité de cette étude.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le projet d’ouverture des laboratoires clés du Hubei (subvention n ° 2021KFY055), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (subvention n ° 2020CFB240) et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (subvention n ° 2042020kf0065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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