Summary
Presentert her er en protokoll for isolering av regionalt decellularisert lungevev. Denne protokollen gir et kraftig verktøy for å studere kompleksiteter i ekstracellulær matrise og cellematriseinteraksjoner.
Abstract
Lungetransplantasjon er ofte eneste mulighet for pasienter i senere stadier av alvorlig lungesykdom, men dette begrenses både på grunn av tilgang på egnede donorlunger og både akutt og kronisk avstøtning etter transplantasjon. Å fastslå nye bioteknologiske tilnærminger for erstatning av syke lunger er avgjørende for å forbedre pasientens overlevelse og unngå komplikasjoner forbundet med dagens transplantasjonsmetoder. En alternativ tilnærming innebærer bruk av decellulariserte hele lunger som mangler cellulære bestanddeler som vanligvis er årsaken til akutt og kronisk avvisning. Siden lungen er et så komplekst organ, er det av interesse å undersøke de ekstracellulære matrikskomponentene i bestemte regioner, inkludert vaskulatur, luftveier og alveolært vev. Formålet med denne tilnærmingen er å etablere enkle og reproduserbare metoder som forskere kan dissekere og isolere regionspesifikt vev fra fullt decellulariserte lunger. Den nåværende protokollen er utarbeidet for gris og menneskelige lunger, men kan også brukes på andre arter. For denne protokollen ble fire regioner av vevet spesifisert: luftveier, vaskulatur, alveoler og bulk lungevev. Denne prosedyren tillater anskaffelse av prøver av vev som mer nøyaktig representerer innholdet i det decellulariserte lungevevvet i motsetning til tradisjonelle bulkanalysemetoder.
Introduction
Lungesykdommer, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), idiopatisk lungefibrose (IPF) og cystisk fibrose (CF), forblir for tiden uten kur 1,2,3,4. Lungetransplantasjon er ofte eneste mulighet for pasienter i senere stadier, men dette er fortsatt et begrenset alternativ både på grunn av tilgang på egnede donorlunger og både akutt og kronisk avstøtning etter transplantasjon 3,5,6. Som sådan er det et kritisk behov for nye behandlingsstrategier. En lovende tilnærming i respiratorisk bioteknologi er anvendelsen av vevsavledede stillaser fremstilt fra decellularisert innfødt lungevev. Som acellulære hele lungestillas beholder mye av kompleksiteten til den opprinnelige ekstracellulære matrisen (ECM) sammensetning og bioaktivitet, har de blitt intensivt studert for helorganteknikk og som forbedrede modeller for å studere lungesykdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallelt er det økende interesse for å utnytte decellulariserte vev fra forskjellige organer, inkludert lunger, som hydrogeler og andre substrater for å studere cellecelle- og celle-ECM-interaksjoner i organoide og andre vevskulturmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Disse gir mer relevante modeller enn kommersielt tilgjengelige substrater, som Matrigel, avledet fra tumorkilder. Imidlertid er informasjon om humane lungeavledede hydrogeler relativt begrenset for tiden. Vi har tidligere beskrevet hydrogeler avledet fra decellulariserte grislunger og har karakterisert både deres mekaniske og materielle egenskaper, samt demonstrert deres nytte som cellekulturmodeller18,19. En nylig rapport detaljerte den første mekaniske og viskoelastiske karakteriseringen av hydrogeler avledet fra decellulariserte normale og syke (KOL, IPF) menneskelige lunger20. Vi har også presentert innledende data som karakteriserer glykosaminoglykaninnholdet i decellulariserte normale og KOLS humane lunger, samt deres anvendelighet for å studere cellecelle- og celle-ECM-interaksjoner11.
Disse eksemplene illustrerer kraften i å utnytte decellulariserte humane lunge-ECM for undersøkelsesformål. Lungen er imidlertid et komplekst organ, og både struktur og funksjon varierer i forskjellige områder av lungen, inkludert ECM-sammensetning og andre egenskaper som stivhet21,22. Som sådan er det av interesse å studere ECM i individuelle regioner i lungen, inkludert luftrøret og store luftveier, mellomstore og små luftveier og alveoler, samt store, mellomstore og små blodkar. For dette formål har vi utviklet en pålitelig og reproduserbar metode for å dissekere decellulariserte menneskelige og gris lunger og deretter isolere hver av disse anatomiske områdene. Dette har muliggjort detaljerte differensialanalyser av regionalt proteininnhold i både normale og syke lunger21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk er utført i samsvar med IACUC ved University of Vermont (UVM). Alle menneskelige lunger ble anskaffet fra UVM Autopsy Services og relaterte studier ble utført i henhold til retningslinjene for IRB av UVM.
MERK: Decellularisering av gris og menneskelige lunger har tidligere blitt beskrevet av vår gruppe 7,8,9,10,21. Kort fortalt decellulariseres hele lungelapper gjennom sekvensiell perfusjon av luftveiene og vaskulaturen med en serie 2 L vaskemiddel og enzymløsninger ved bruk av en peristaltisk pumpe: 0,1% Triton-X 100, 2% natriumdeoksykolat, 1 M natriumklorid, 30 μg / ml DNase / 1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% pereddiksyre /4% etanol, og en avionisert vannvask. Standard metoder for å bekrefte effektiv decellularisering inkluderer bestemmelse av <50 ng / mg gjenværende dobbeltstrenget DNA i decellulariserte lunger og fravær av DNA-fragmenter ved gelelektroforese, og kjernefysisk farging ved hematoksylin og eosin (H &E) farging 9,21.
1. Oppsett
- Samle alt nødvendig utstyr som kreves for disseksjonsprosedyren, inkludert en glassgryterett, to par kirurgisk pinsett, ett par tang og ett par kirurgisk saks og autoklav før bruk.
- Få en del av lungen, legg den i glassgrytefatet, og orienter den slik at den øvre enden av luftveien kan ses tydelig.
- Identifiser den proksimale enden av vaskulaturen og hold den intakt til senere trinn. Enden av vaskulaturen skal være tydelig synlig og helt ugjennomsiktig hvit i fargen.
- Ved hjelp av en pinsett og kirurgisk saks, fjerne eventuelle pleura som kan fôre utsiden av lungene og kaste.
2. Utsette luftveiene
- Bruk en spredningsteknikk med kirurgisk saks, arbeid forsiktig for å eksponere de ekstra luftveiene.
- Finn de største luftveiene, som typisk vil ha en diameter på ca. 2-4 cm. En annen måte å identifisere en luftvei på er gjennom observasjon av bruskringer, som kan detekteres visuelt eller via palpasjon av vevet.
- Bruk et par tang, palpere ned lengden av luftveiene for å bestemme plasseringen av den usynlige luftveien til en dybde på ca. 1 tommer.
MERK: Å være foret med bruskringer, er luftveiene karakteristisk hardere enn de andre lungevevene. Som sådan bør det være relativt enkelt å finne og palpere de usynlige luftveiene. - Hold kirurgisk saks parallelt med luftveien, sett de lukkede spissene inn i vevet som omgir den usynlige luftveien.
- Åpne sakte kirurgisk saks for å forsiktig trekke fra hverandre den omkringliggende membranen. Fjern deretter den kirurgiske saksen og unngå å kutte noe vev overhodet.
- Gjenta denne prosessen periodisk gjennom hele disseksjonsprosedyren for å fortsette å eksponere luftveiene.
- Bruk kirurgisk saks, kutt luftveiene ved forgreningspunktene og dissekere langs hver gren uavhengig.
MERK: Et forgreningspunkt er et sted hvor en luftvei deler seg i to separate luftveier. - Sever regioner av luftveiene en gang trygg på at de intakte endene vil forbli identifiserbare og lett plassert for videre disseksjon.
- Plasser avskårne områder av luftveien inn i det tilsvarende røret. Størrelsen på de avskårne områdene vil variere avhengig av prøven, men vil generelt variere mellom 1-5 cm i lengde. Bredden varierer basert på den relative plasseringen langs luftveistreet, med de distale områdene som opprettholder mindre bredder enn de mer proksimale områdene.
3. Eksponerende og ekskluderende regioner i vaskulaturen
- Påfør forsiktig trykk på vaskulaturen og trekk sakte bort fra luftveien. La vaskulaturen strekke seg litt og bruk kirurgisk saks for å skille vaskulaturen ytterligere fra luftveien.
MERK: For mye press vil rive vaskulaturen. Hvis vaskulaturen riper, plasserer du bare den delen av vaskulaturen i det tilsvarende merkede røret og identifiserer den intakte enden. - Når et forgreningspunkt i det vaskulære treet har blitt eksponert, bruk kirurgisk saks og pinsett for å eksponere flere dårligere områder av vaskulaturen.
- Begynn med å sette inn de lukkede spissene på kirurgisk saks like under et forgreningspunkt og mellom de to tilsvarende vaskulaturområdene.
- Åpne sakte saksen for å spre fra hverandre det underliggende vevet.
- Periodisk, bruk en pinsett for å fjerne vevet som ble spredt fra hverandre ved hjelp av kirurgisk saks, samt annet vev som omgir vaskulaturen.
- Når vaskulaturen dekker områder av luftveiene eller blir tungvint til et hvilket som helst trinn i disseksjonsprosedyren, kutt vaskulaturen ved et forgreningspunkt og videre dissekere langs hver gren uavhengig.
- Sever regioner av vaskulaturen en gang trygg på at de intakte endene vil forbli identifiserbare og lett plassert for videre disseksjon.
4. Identifisering og excising alveolar vev
- Bruk en tang eller pinsett, klem og riv deretter forsiktig bort små områder av alveolært vev.
- Finn et område av vev som ikke er i direkte nærhet av luftveiene eller vaskulaturen.
- Ved hjelp av pinsett, klemme en liten region av vevet som ser ut til å være blottet for vaskulatur eller luftveier.
- Riv det klemte området av vevet fra lungen.
- Observer regionen av vev fjernet og bekreft om det er alveolært vev eller ikke.
MERK: Alveolær vev er tilstede i hele lungen, så det kan og bør fjernes gjennom hele disseksjonsprosedyren. Ethvert vev som ikke lett kan identifiseres som primært alveoler, vaskulatur eller luftveier, bør kategoriseres som bulkvev og plasseres i det tilsvarende merkede røret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et overordnet skjema over protokollen er vist i figur 1. Når mestret, er den regionale disseksjonen av decellularisert lungevev lett reproduserbar. Bestemmelse av kategoriseringen av hver avskåret vevsprøve er avgjørende for suksessen til disseksjonsprosedyren. Vaskulært vev er vesentlig mer elastisk enn luftveier, så bruk av tang for å strekke vevet er ofte en sterk indikator på om en bestemt prøve er vaskulatur eller luftveier. Vanligvis går vaskulært vev parallelt med luftveiene (figur 2A). Vaskulært vev har også en tendens til å virke hvitere og ugjennomsiktig i fargen (figur 2B) enn luftveisvev (figur 2C). Den kirurgiske saksspredningsteknikken beskrevet i protokollen er vist i figur 3. Større prøver av luftveiene er omfattet av bruskringer som virker litt hvitere enn selve luftveiene. Observasjon av bruskringer er således en umiddelbar indikator på at den aktuelle prøven er luftveiene (figur 4). Å avgjøre om en prøve primært er alveoler er noe mer komplisert på grunn av at alveoler er tilstede i hele lungen og for små til å observere med bare øyne. Når det er fjernet, har alveolær vev en tendens til å trekke seg tilbake til en pærelignende form og virker relativt homogent (figur 5). Noen ganger kan alveolært vev virke flekkete, men det bør aldri inneholde synlige striper av hvitt, da dette kan tyde på tilstedeværelse av mellomstore til store luftveier eller vaskulatur. I tilfeller der hvite striper eller andre uidentifiserbare strukturer observeres, skal vevsprøven kategoriseres som bulklunge og plasseres i det tilsvarende merkede røret. Denne disseksjonsprosessen er unøyaktig, og som sådan klassifiserer vi alveolarvevskategorien som alveolær-anriket. Ved hjelp av denne protokollen er det umulig å oppnå en 100% ren alveolær vevsprøve. Ved hjelp av massespektrometri har vi imidlertid tidligere vist at ECM-sammensetningen varierer mellom enkeltregioner i decellulariserte lunger, inkludert hele lunge-ECM (wECM), alveolarberiket ECM (aECM), luftveis-ECM (airECM) og vaskulatur-ECM (vECM) (figur 6A-F)21. Spesielt i decellulariserte lunger oppnådd fra pasienter uten lungesykdom i anamnesen, har vi karakterisert en anrikning av basalmembranassosierte proteiner (dvs. lamininer) i aECM, mens airECM er anriket i bruskassosierte ECM-proteiner, som aggrecan (ACAN), og vECM er beriket med fibronektin (FN1) og andre løselige ECM-proteiner assosiert med blodkar (figur 6G, H)21. Videre har vi tidligere vist at ECM-sammensetningen er endret hos pasienter med IPF eller KOLS på en regionspesifikk måte, noe som understreker nødvendigheten av metoder for å undersøke de enkelte lungeregionene som beskrevet her21.
Figur 1 Skjematisk fremstilling av hele lungedecellulariserings- og disseksjonsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel som viser forskjellen mellom decellulariserte luftveier og vaskulært vev under disseksjon . (A) Initial anatomi med luftveiene og vaskulaturen sidestilt. (B) Luftveier og (C) vaskulatur som hver holdes med tang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Prosedyre for identifisering og høsting av vaskulatur. (A) Stort område av lungevaskulaturen holdes oppreist med tang. Det er ingen bruskringer og vevet har en viss grad av elastisitet, noe som bekrefter at prøven er vaskulatur. (B) Kirurgisk saks brukes til å forsiktig kutte den øvre delen av vaskulaturen. (C) Mer enn nok vaskulatur beholdes under kuttet slik at det lett kan flyttes og dissekeres ytterligere. (D) En del av mer distale vaskulaturer som kan seksjoneres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prosedyre for identifisering og høsting av luftveier. (A) Stor del av luftveiene holdes oppreist med tang. Bildet viser klare bruskringer, noe som bekrefter at prøven er luftveier. (B) Kirurgisk saks brukes til å forsiktig kutte den øvre delen av luftveien. (C) Mer enn nok luftveier beholdes under kuttet slik at det lett kan flyttes og dissekeres ytterligere. (D) De avskårne luftveiene er plassert i det tilsvarende merkede røret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempel som viser representativt utvalg av alveolær vev. Isolert alveolær vev blir holdt opp for undersøkelse med et par tang. Den alveolære vevsprøven er sfærisk etter ekstraksjon fra lungen og har jevn farge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Decellularisert lungematrisom varierer avhengig av anatomisk region. Representativt bilde av en decellularisert human lunge på ventral (A) og dorsal (B) side og påfølgende disseksjon til isolerte luftveier (C) og vaskulære (D) trær. € Frest ECM-pulver med flytende nitrogen av hele decellularisert lunge-ECM (wECM), samt ECM fra alveolarberikede (aECM), luftveisberikede (airECM) og vaskulaturberikede (vECM) regioner. (F) Plott for hovedkomponentanalyse (PCA) som demonstrerer likheten av den totale matrisomsammensetningen blant regionspesifikke prøver. (G) Forholdet mellom gjennomsnittlig kjellermembransammensetning fra decellulariserte lungespesifikke regioner. (H) Varmekart over topp 25 matrisomproteiner over alle decellulariserte lungeregioner. Denne figuren er gjengitt fra Hoffman et al.21. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Decellularisert vev fra mennesker og andre arter brukes ofte som biomaterialer for å studere ECM-sammensetning samt celle-ECM-interaksjoner i ex vivo kulturmodeller, inkludert 3D-hydrogeler12,13. I likhet med andre organer har decellulariserte lunger tidligere blitt brukt til å bestemme ECM-sammensetningsforskjeller i friske versus syke (dvs. emfysematøse og IPF) lunger og blir i økende grad brukt som hydrogeler for å studere ECM-dynamikk og celle-ECM-interaksjoner 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Imidlertid har proteomiske og hydrogelstudier i decellulariserte lunger bare vurdert lungen som helhet, og er dermed ikke i stand til å bestemme rollen som individuelle anatomiske regioner på samlede studieresultater. Siden lungen er et komplekst organ som drastisk varierer i fysiologisk rolle, sammensetning og struktur mellom anatomiske regioner, er det avgjørende å utvikle metoder for å studere disse individuelle regionene separat21,22. Her beskriver vi en innovativ metode for å utlede individuelle anatomiske regioner (alveolar-berikede, luftveis- og vaskulaturregioner) fra decellulariserte lunger for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert både proteomisk karakterisering og ex vivo hydrogelstudier21
Etter hel lungedecellularisering beskriver vår metode en trinnvis disseksjonsprotokoll for å berike luftveis- og vaskulaturtrær. Å fortsette med forsiktighet er det viktigste aspektet ved disseksjonsprosedyren for ikke å feilidentifisere en bestemt prøve eller å tilfeldig kutte et område av vev. En potensiell konsekvens av sistnevnte er å miste oversikten over hvor luftveiene eller vaskulaturen føres i lungen. For tiden er det best å holde luftveiene eller vaskulaturen med tang til vevet blir utsatt for det punktet hvor det kan samles inn. I fremtiden kan modifikasjoner av denne protokollen omfatte påføring av en klemme på den eksponerte enden av luftveiene eller vaskulaturen, noe som vil muliggjøre konstant identifisering av vevet som aktivt dissekeres. Tidligere modifikasjoner inkluderte innføring av en spredningsteknikk med kirurgisk saks, som er beskrevet i protokollen. Før bruk av spredningsteknikk ble det utført en manuell metode for å eksponere luftveiene eller vaskulaturen som innebar å rive vekk omkringliggende vev. Denne modifikasjonen er mer effektiv i å eksponere luftveiene eller vaskulaturen og begrenser mengden skade på omgivende vev, som deretter kan dissekeres videre i regionspesifikke prøver.
En begrensning av denne prosedyren er at det kan være vanskelig å unngå utilsiktet avgang av små vaskulaturer og luftveier, da når disse når mindre diametre, blir de stadig mer delikate. Som sådan blir det mer fordelaktig å avstå fra anskaffelse av ekstremt små luftveier og vaskulatur og å kategorisere regionen som bulk i stedet. Dette er helt akseptabelt, da bulk lungevev er ment å inneholde en blanding av alle lungevevstyper. En annen begrensning er vanskeligheten med å isolere rent alveolær vev uten at prøven inneholder spormengder av vaskulatur eller luftveier. En enkel måte å unngå dette på er å samle små prøver av alveolær vev (ca. 5 mm3), slik at midten av vevsprøven er mindre sannsynlig å inneholde uønskede vevstyper.
De beskrevne metodene er nye, og vi kjenner foreløpig ikke til andre regionspesifikke lungedisseksjonsmetoder. Denne protokollen gir mulighet til å skille mellom ulike regioner i lungen, noe som etablerer en mer robust vitenskapelig forståelse av sammensetningen.
Denne disseksjonsprotokollen kan ha applikasjoner i generering av hydrogeler for 2D- og 3D-cellekulturapplikasjoner, samt utvikling av bioblekk for 3D-utskriftsapplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker UVM-obduksjonstjenestene for menneskelige lungeanskaffelser og Robert Pouliot PhD for bidrag til de generelle disseksjonsteknikkene. Disse studiene ble støttet av R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B.
- Raherison, C., Girodet, P. -O.
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M.
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F.
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
