Summary
Præsenteret her er en protokol til isolering af regionalt decellulariseret lungevæv. Denne protokol giver et kraftfuldt værktøj til at studere kompleksiteter i de ekstracellulære matrix- og cellematrixinteraktioner.
Abstract
Lungetransplantation er ofte den eneste mulighed for patienter i de senere stadier af svær lungesygdom, men dette er begrænset både på grund af udbuddet af egnede donorlunger og både akut og kronisk afstødning efter transplantation. Konstatering af nye bioteknologiske tilgange til udskiftning af syge lunger er afgørende for at forbedre patientens overlevelse og undgå komplikationer forbundet med nuværende transplantationsmetoder. En alternativ tilgang indebærer anvendelse af decellulariserede hele lunger, der mangler cellulære bestanddele, der typisk er årsagen til akut og kronisk afstødning. Da lungen er et så komplekst organ, er det af interesse at undersøge de ekstracellulære matrixkomponenter i specifikke regioner, herunder vaskulatur, luftveje og alveolært væv. Formålet med denne tilgang er at etablere enkle og reproducerbare metoder, hvormed forskere kan dissekere og isolere regionsspecifikt væv fra fuldt decellulariserede lunger. Den nuværende protokol er udarbejdet for griselunger og menneskelige lunger, men kan også anvendes på andre arter. For denne protokol blev fire regioner af vævet specificeret: luftveje, vaskulatur, alveoler og bulk lungevæv. Denne procedure giver mulighed for udtagning af prøver af væv, der mere præcist repræsenterer indholdet af det decellulariserede lungevæv i modsætning til traditionelle bulkanalysemetoder.
Introduction
Lungesygdomme, herunder kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), idiopatisk lungefibrose (IPF) og cystisk fibrose (CF), forbliver i øjeblikket uden kur 1,2,3,4. Lungetransplantation er ofte den eneste mulighed for patienter i senere stadier, men dette er fortsat en begrænset mulighed både på grund af udbuddet af egnede donorlunger og både akut og kronisk afstødning efter transplantation 3,5,6. Som sådan er der et kritisk behov for nye behandlingsstrategier. En lovende tilgang inden for respiratorisk bioteknologi er anvendelsen af vævsafledte stilladser fremstillet af decellulariseret indfødt lungevæv. Da acellulære hele lungestilladser bevarer meget af kompleksiteten af den oprindelige ekstracellulære matrix (ECM) sammensætning og bioaktivitet, er de blevet intensivt undersøgt for helorganteknik og som forbedrede modeller til undersøgelse af lungesygdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallelt er der stigende interesse for at udnytte decellulariserede væv fra forskellige organer, herunder lunger, som hydrogeler og andre substrater til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner i organoid- og andre vævskulturmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Disse giver mere relevante modeller end kommercielt tilgængelige substrater, såsom Matrigel, afledt af tumorkilder. Imidlertid er oplysninger om humane lungeafledte hydrogeler relativt begrænsede på nuværende tidspunkt. Vi har tidligere beskrevet hydrogeler afledt af decellulariserede svinelunger og har karakteriseret både deres mekaniske og materielle egenskaber, samt demonstreret deres anvendelighed som cellekulturmodeller18,19. En nylig rapport detaljerede den indledende mekaniske og viskoelastiske karakterisering af hydrogeler afledt af decellulariserede normale og syge (KOL, IPF) menneskelige lunger20. Vi har også præsenteret indledende data, der karakteriserer glycosaminoglycanindholdet i decellulariserede normale og KOL menneskelige lunger, samt deres anvendelighed til undersøgelse af celle-celle og celle-ECM-interaktioner11.
Disse eksempler illustrerer kraften i at bruge decellulariserede humane lunge-ECM'er til undersøgelsesformål. Lungen er imidlertid et komplekst organ, og både struktur og funktion varierer i forskellige områder af lungen, herunder ECM-sammensætning og andre egenskaber såsom stivhed21,22. Som sådan er det af interesse at studere ECM i individuelle lungeområder, herunder luftrøret og store luftveje, mellemstore og små luftveje og alveoler samt store, mellemstore og små blodkar. Til dette formål har vi udviklet en pålidelig og reproducerbar metode til at dissekere decellulariserede menneske- og svinelunger og efterfølgende isolere hver af disse anatomiske regioner. Dette har muliggjort detaljeret differentiel analyse af regionalt proteinindhold i både normale og syge lunger21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er udført i overensstemmelse med IACUC fra University of Vermont (UVM). Alle menneskelige lunger blev erhvervet fra UVM Autopsy Services, og relaterede undersøgelser blev udført i henhold til retningslinjerne for IRB af UVM.
BEMÆRK: Decellularisering af grise- og humane lunger er tidligere beskrevet af vores gruppe 7,8,9,10,21. Kort fortalt decellulariseres hele lungelapper gennem sekventiel perfusion af luftvejene og vaskulaturen med en række 2 L vaskemiddel- og enzymopløsninger under anvendelse af en peristaltisk pumpe: 0,1% Triton-X 100, 2% natriumdeoxycholat, 1 M natriumchlorid, 30 μg / ml DNase/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% pereddikesyre /4% ethanol, og en deioniseret vandvask. Standardmetoder til bekræftelse af effektiv decellularisering inkluderer bestemmelse af <50 ng / mg resterende dobbeltstrenget DNA i decellulariserede lunger og fraværet af DNA-fragmenter ved gelelektroforese og nuklear farvning ved hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning 9,21.
1. Opsætning
- Saml alt nødvendigt udstyr, der kræves til dissektionsproceduren, herunder en glasgryderet, to par kirurgiske pincet, et par tang og et par kirurgiske sakse og autoklave før brug.
- Få en del af lungen, læg den i glasgrydeskålen, og orienter den, så den overlegne ende af luftvejene kan ses tydeligt.
- Identificer den proksimale ende af vaskulaturen og hold den intakt indtil senere trin. Enden af vaskulaturen skal være tydeligt synlig og helt uigennemsigtig hvid i farve.
- Brug en pincet og kirurgisk saks til at fjerne enhver pleura, der kan være foring ydersiden af lungen og kassere.
2. Eksponering af luftvejene
- Brug en spredningsteknik med den kirurgiske saks til forsigtigt at udsætte de ekstra luftveje.
- Find de største luftveje, som typisk vil have en diameter på ca. 2-4 cm. En anden måde at identificere en luftvej på er gennem observation af bruskringe, som kan detekteres visuelt eller via palpation af vævet.
- Brug et par tang til at palpere ned langs luftvejene for at bestemme placeringen af den usete luftvej til en dybde på ca. 1 in.
BEMÆRK: At være foret med bruskringe, luftvejene er karakteristisk hårdere end de andre lungevæv. Som sådan bør det være relativt enkelt at finde og palpere de usete luftveje. - Hold den kirurgiske saks parallelt med luftvejene, indsæt de lukkede spidser i vævet direkte omkring den usete luftvej.
- Åbn langsomt den kirurgiske saks for forsigtigt at trække den omgivende membran fra hinanden. Fjern derefter den kirurgiske saks og undgå at skære noget væv overhovedet.
- Gentag denne proces med mellemrum under hele dissektionsproceduren for at fortsætte med at udsætte luftvejene.
- Brug den kirurgiske saks til at skære luftvejen ved forgreningspunkterne og dissekere langs hver gren uafhængigt.
BEMÆRK: Et forgreningspunkt er et sted, hvor en luftvej opdeles i to separate luftveje. - Afbryd områder af luftvejene, når de er sikre på, at de intakte ender forbliver identificerbare og let lokaliseres til yderligere dissektion.
- Placer afskårne områder af luftvejene i det tilsvarende rør. Størrelsen af de afskårne områder varierer afhængigt af prøven, men vil generelt variere mellem 1-5 cm i længden. Bredden varierer afhængigt af den relative placering langs luftvejstræet, hvor de distale regioner opretholder mindre bredder end de mere proksimale regioner.
3. Eksponering og udskæring af områder af vaskulaturen
- Påfør let tryk på vaskulaturen og træk langsomt væk fra luftvejene. Lad vaskulaturen strække sig lidt og brug kirurgisk saks til yderligere at adskille vaskulaturen fra luftvejene.
BEMÆRK: For meget pres vil rive vaskulaturen. Hvis vaskulaturen rives, skal du blot placere den del af vaskulaturen i det tilsvarende mærkede rør og identificere dets intakte ende. - Når et forgreningspunkt i vaskulærtræet er blevet udsat, skal du bruge kirurgisk saks og pincet til at udsætte mere ringere områder af vaskulaturen.
- Begynd med at indsætte de lukkede spidser af den kirurgiske saks lige under et forgreningspunkt og mellem de to tilsvarende vaskulaturområder.
- Åbn langsomt saksen for at sprede det underliggende væv fra hinanden.
- Brug periodisk en pincet til at fjerne vævet, der blev spredt fra hinanden ved hjælp af den kirurgiske saks, samt ethvert andet væv, der direkte omgiver vaskulaturen.
- Når vaskulaturen dækker områder af luftvejene eller bliver besværlig for ethvert trin i dissektionsproceduren, skal du skære vaskulaturen på et forgreningspunkt og yderligere dissekere langs hver gren uafhængigt.
- Afbryd områder af vaskulaturen, når de er sikre på, at de intakte ender forbliver identificerbare og let lokaliseres til yderligere dissektion.
4. Identifikation og udskæring af alveolært væv
- Brug et par tang eller pincet, klemme og derefter forsigtigt rive væk små områder af alveolært væv.
- Find et område af væv, der ikke er i umiddelbar nærhed af luftvejene eller vaskulaturen.
- Brug pincetten til at klemme et lille område af vævet, der ser ud til at være blottet for vaskulatur eller luftveje.
- Riv det klemte område af vævet fra lungen.
- Overhold det fjernede område af væv, og bekræft, om det er alveolært væv eller ej.
BEMÆRK: Alveolært væv er til stede i hele lungen, så det kan og bør fjernes under dissektionsproceduren. Ethvert væv, der ikke let kan identificeres som primært alveoler, vaskulatur eller luftveje, skal kategoriseres som bulkvæv og placeres i det tilsvarende mærkede rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et overordnet skema over protokollen er afbildet i figur 1. Når den er mestret, er den regionale dissektion af decellulariseret lungevæv let reproducerbar. Bestemmelse af kategoriseringen af hver afskåret vævsprøve er afgørende for dissektionsprocedurens succes. Vaskulært væv er væsentligt mere elastisk end luftvejene, så brug af tang til at strække vævet er ofte en stærk indikator for, om en bestemt prøve er vaskulatur eller luftvej. Typisk løber vaskulært væv parallelt med luftvejene (figur 2A). Vaskulært væv har også tendens til at virke hvidere og uigennemsigtig i farve (figur 2B) end luftvejsvæv (figur 2C). Den kirurgiske saksespredningsteknik, der er beskrevet i protokollen, er afbildet i figur 3. Større prøver af luftvejene er omfattet af ringe af brusk, der synes lidt hvidere end selve luftvejene. Observation af bruskringe er således en umiddelbar indikator for, at den pågældende prøve er luftvejene (figur 4). At afgøre, om en prøve primært er alveoler, er noget mere kompliceret på grund af alveoler, der er til stede i hele lungen og for lille til at observere med bare øjne. Når det er fjernet, har alveolært væv tendens til at trække sig tilbage i en pærelignende form og fremstår relativt homogent (figur 5). Nogle gange kan alveolært væv forekomme plettet, men det bør aldrig indeholde synlige striber af hvidt, da dette kan antyde tilstedeværelsen af mellemstore til store luftveje eller vaskulatur. I tilfælde, hvor hvide striber eller andre uidentificerbare strukturer observeres, skal vævsprøven kategoriseres som bulklunge og placeres i det tilsvarende mærkede rør. Denne dissektionsproces er unøjagtig, og som sådan klassificerer vi den alveolære vævskategori som alveolær-beriget. Ved hjælp af denne protokol er det umuligt at opnå en 100% ren alveolær vævsprøve. Vi har dog tidligere vist ved hjælp af massespektrometri, at ECM-sammensætningen varierer mellem individuelle regioner af decellulariserede lunger, herunder hellunge-ECM (wECM), alveolært beriget ECM (aECM), luftvejs-ECM (airECM) og vaskulatur ECM (vECM) (figur 6A-F)21. Især i decellulariserede lunger opnået fra patienter uden historie med lungesygdom har vi karakteriseret en berigelse af kældermembranassocierede proteiner (dvs. lamininer) i aECM, mens airECM er beriget med bruskassocierede ECM-proteiner, såsom aggrecan (ACAN), og vECM er beriget med fibronectin (FN1) og andre opløselige ECM-proteiner forbundet med blodkar (figur 6G, H)21. Desuden har vi tidligere påvist, at ECM-sammensætningen ændres hos patienter med IPF eller KOL på en regionsspecifik måde, hvilket understreger nødvendigheden af metoder til at undersøge individuelle lungeregioner som beskrevet her21.
Figur 1: Skematisk repræsentation af hele lungedecellulariserings- og dissektionsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel, der viser forskellen mellem decellulariseret luftvej og vaskulært væv under dissektion . (A) Indledende anatomi med luftveje og vaskulatur sidestillet. (B) Airway og (C) vaskulatur hver holdes med tang. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procedure til identifikation og høstning af vaskulatur . (A) Stor region af lungevaskulatur, der holdes oprejst med tang. Der er ingen bruskringe, og vævet har en vis grad af elasticitet, hvilket bekræfter, at prøven er vaskulatur. (B) Kirurgisk saks bruges til omhyggeligt at adskille den øverste del af vaskulaturen. (C) Mere end nok vaskulatur bevares under snittet, så det let kan flyttes og dissekeres yderligere. (D) En sektion af mere distal vaskulatur, der kan sektioneres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Procedure til identifikation og høst af luftveje . (A) Et stort område af luftvejene holdes oprejst med pincet. Billedet viser klare bruskringe, der bekræfter, at prøven er luftvejs. (B) Kirurgisk saks bruges til omhyggeligt at adskille den øverste del af luftvejene. (C) Der tilbageholdes mere end nok luftveje under snittet, så det let kan flyttes og dissekeres yderligere. (D) Den afskårne luftvej anbringes i det tilsvarende mærkede rør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempel, der viser en repræsentativ prøve af alveolært væv. Isoleret alveolært væv holdes op til undersøgelse med et par tang. Den alveolære vævsprøve er sfærisk efter ekstraktion fra lungen og har ensartet farve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Decellulariseret lungematrisom varierer afhængigt af anatomisk region. Repræsentativt billede af en decellulariseret menneskelig lunge på den ventrale (A) og dorsale (B) side og efterfølgende dissektion til isolerede luftveje (C) og vaskulære (D) træer. € Flydende nitrogen formalet ECM pulver af hele decellulariseret lunge ECM (wECM), samt ECM fra alveolær-beriget (aECM), luftvejsberiget (airECM), og vaskulatur-beriget (vECM) regioner. F) Plot med analyse af hovedkomponenter (PCA), der viser ligheden mellem den samlede matrosomsammensætning blandt regionsspecifikke prøver. (G) Forholdet mellem gennemsnitlig kældermembransammensætning fra decellulariserede lungespecifikke regioner. (H) Heatmap over top 25 matrisom proteiner på tværs af alle decellulariserede lungeområder. Denne figur er genoptrykt fra Hoffman et al.21. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Decellulariseret væv fra mennesker og andre arter anvendes ofte som biomaterialer til undersøgelse af ECM-sammensætning samt celle-ECM-interaktioner i ex vivo-kulturmodeller, herunder 3D-hydrogeler12,13. I lighed med andre organer er decellulariserede lunger tidligere blevet brugt til at bestemme ECM-sammensætningsforskelle i raske versus syge (dvs. emfysematøse og IPF) lunger og bruges i stigende grad som hydrogeler til undersøgelse af ECM-dynamik og celle-ECM-interaktioner 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Imidlertid har proteomiske og hydrogelundersøgelser i decellulariserede lunger kun betragtet lungen som helhed og er således ikke i stand til at bestemme de enkelte anatomiske regioners rolle på de samlede undersøgelsesresultater. Da lungen er et komplekst organ, der drastisk varierer i fysiologisk rolle, sammensætning og struktur mellem anatomiske regioner, er det afgørende at udvikle metoder til at studere disse individuelle regioner separat21,22. Heri beskriver vi en innovativ metode til at udlede individuelle anatomiske regioner (alveolære, luftvejs- og vaskulaturregioner) fra decellulariserede lunger til en række downstream-applikationer, herunder både proteomisk karakterisering og ex vivo-hydrogelundersøgelser21
Efter hel lungedecellularisering beskriver vores metode en trinvis dissektionsprotokol for at berige luftvejs- og vaskulaturtræer. At fortsætte med omhu er det vigtigste aspekt af dissektionsproceduren for ikke at fejlidentificere en bestemt prøve eller tilfældigt adskille en region af væv. En potentiel konsekvens af sidstnævnte er at miste overblikket over, hvor luftvejene eller vaskulaturen føres ind i lungen. I øjeblikket er det bedste praksis at holde luftvejene eller vaskulaturen med tang, indtil vævet udsættes for det punkt, hvor det kan opsamles. I fremtiden kan ændringer af denne protokol omfatte påføring af en klemme på den udsatte ende af luftvejene eller vaskulaturen, hvilket vil muliggøre konstant identifikation af vævet, der aktivt dissekeres. Tidligere ændringer omfattede indførelsen af en spredningsteknik med kirurgisk saks, som er beskrevet i protokollen. Før brugen af en spredningsteknik blev der udført en manuel metode til eksponering af luftvejene eller vaskulaturen, som involverede at rive omgivende væv væk. Denne ændring er mere effektiv til at udsætte luftvejene eller vaskulaturen og begrænser mængden af skade på omgivende væv, som derefter kan dissekeres yderligere i regionsspecifikke prøver.
En begrænsning ved denne procedure er, at det kan være vanskeligt at undgå utilsigtet afbrydelse af små vaskulatur og luftveje, da når disse når mindre diametre, bliver de mere og mere sarte. Som sådan bliver det mere fordelagtigt at give afkald på indkøb af ekstremt små luftveje og vaskulatur og kategorisere regionen som bulk i stedet. Dette er helt acceptabelt, da bulk lungevæv er beregnet til at indeholde en blanding af alle lungevævstyper. En anden begrænsning er vanskeligheden ved at isolere rent alveolært væv uden prøven, der indeholder spormængder af vaskulatur eller luftveje. En nem måde at undgå dette på er at indsamle små prøver af alveolært væv (ca. 5 mm3), således at midten af vævsprøven er mindre tilbøjelig til at indeholde uønskede vævstyper.
De beskrevne metoder er nye, og vi kender på nuværende tidspunkt ikke til andre regionsspecifikke lungedissektionsmetoder. Denne protokol giver mulighed for at skelne mellem forskellige regioner i lungen, hvilket skaber en mere robust videnskabelig forståelse af sammensætningen.
Denne dissektionsprotokol kan have anvendelser i generering af hydrogeler til 2D- og 3D-cellekulturapplikationer samt udvikling af bioblæk til 3D-printapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker UVM-obduktionstjenesterne for human lungeindkøb og Robert Pouliot PhD for bidrag til de overordnede dissektionsteknikker. Disse undersøgelser blev støttet af R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B.
- Raherison, C., Girodet, P. -O.
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M.
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F.
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
