Summary
Här presenteras ett protokoll för isolering av regional decellulariserad lungvävnad. Detta protokoll ger ett kraftfullt verktyg för att studera komplexiteter i extracellulär matris och cell-matrisinteraktioner.
Abstract
Lungtransplantation är ofta det enda alternativet för patienter i de senare stadierna av svår lungsjukdom, men detta är begränsat både på grund av tillgången på lämpliga donatorlungor och både akut och kronisk avstötning efter transplantation. Att fastställa nya biotekniska metoder för ersättning av sjuka lungor är absolut nödvändigt för att förbättra patienternas överlevnad och undvika komplikationer i samband med nuvarande transplantationsmetoder. Ett alternativt tillvägagångssätt innebär användning av decellulariserade hela lungor som saknar cellulära beståndsdelar som vanligtvis är orsaken till akut och kronisk avstötning. Eftersom lungan är ett så komplext organ är det av intresse att undersöka de extracellulära matriskomponenterna i specifika regioner, inklusive vaskulatur, luftvägar och alveolär vävnad. Syftet med detta tillvägagångssätt är att etablera enkla och reproducerbara metoder genom vilka forskare kan dissekera och isolera regionspecifik vävnad från helt decellulariserade lungor. Det nuvarande protokollet har utformats för gris och mänskliga lungor, men kan också tillämpas på andra arter. För detta protokoll specificerades fyra regioner av vävnaden: luftväg, vaskulatur, alveoler och bulklungvävnad. Denna procedur möjliggör upphandling av vävnadsprover som mer exakt representerar innehållet i den decellulariserade lungvävnaden i motsats till traditionella bulkanalysmetoder.
Introduction
Lungsjukdomar, inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), idiopatisk lungfibros (IPF) och cystisk fibros (CF), förblir för närvarande utan botemedel 1,2,3,4. Lungtransplantation är ofta det enda alternativet för patienter i senare skeden, men detta är fortfarande ett begränsat alternativ både på grund av tillgången på lämpliga donatorlungor och både akut och kronisk avstötning efter transplantation 3,5,6. Som sådan finns det ett kritiskt behov av nya behandlingsstrategier. Ett lovande tillvägagångssätt inom respiratorisk bioteknik är tillämpningen av vävnadshärledda byggnadsställningar framställda av decellulariserad inhemsk lungvävnad. Eftersom acellulära hela lungställningar behåller mycket av komplexiteten hos den ursprungliga extracellulära matrissammansättningen (ECM) och bioaktiviteten, har de studerats intensivt för helorganteknik och som förbättrade modeller för att studera lungsjukdomsmekanismer 7,8,9,10. Parallellt finns det ett ökande intresse för att använda decellulariserade vävnader från olika organ, inklusive lungor, som hydrogeler och andra substrat för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner i organoid- och andra vävnadsodlingsmodeller 11,12,13,14,15,16,17 . Dessa ger mer relevanta modeller än kommersiellt tillgängliga substrat, såsom Matrigel, härrörande från tumörkällor. Informationen om humana lung-härledda hydrogeler är dock relativt begränsad för närvarande. Vi har tidigare beskrivit hydrogeler härrörande från decellulariserade grislungor och har karakteriserat både deras mekaniska och materialegenskaper, samt demonstrerat deras användbarhet som cellodlingsmodeller18,19. En ny rapport detaljerade den initiala mekaniska och viskoelastiska karakteriseringen av hydrogeler härrörande från decellulariserade normala och sjuka (KOL, IPF) mänskliga lungor20. Vi har också presenterat initiala data som karakteriserar glykosaminoglykaninnehållet i decellulariserade normala och KOL-humana lungor, samt deras tillämplighet för att studera cell-cell och cell-ECM-interaktioner11.
Dessa exempel illustrerar kraften i att använda decellulariserade humana lung-ECM för utredningsändamål. Lungan är dock ett komplext organ, och både struktur och funktion varierar i olika regioner i lungan, inklusive ECM-sammansättning och andra egenskaper som styvhet21,22. Som sådan är det av intresse att studera ECM i enskilda regioner i lungan, inklusive luftstrupen och stora luftvägar, medelstora och små luftvägar och alveoler, liksom stora, medelstora och små blodkärl. För detta ändamål har vi utvecklat en pålitlig och reproducerbar metod för dissekering av decellulariserade humana lungor och grislungor och därefter isolera var och en av dessa anatomiska regioner. Detta har möjliggjort detaljerad differentialanalys av regionalt proteininnehåll i både normala och sjuka lungor21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier har utförts i enlighet med IACUC vid University of Vermont (UVM). Alla mänskliga lungor förvärvades från UVM Autopsy Services och relaterade studier utfördes enligt riktlinjerna för IRB av UVM.
OBS: Decellularisering av gris och mänskliga lungor har tidigare beskrivits av vår grupp 7,8,9,10,21. I korthet decelluleras hela lunglober genom sekventiell perfusion av luftvägarna och kärlen med en serie 2 L tvättmedel och enzymlösningar med användning av en peristaltisk pump: 0,1% Triton-X 100, 2% natriumdeoxikolat, 1 M natriumklorid, 30 μg / ml DNas / 1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% perättiksyra /4% etanol, och en avjoniserad vattentvätt. Standardmetoder för att bekräfta effektiv decellularisering innefattar bestämning av <50 ng / mg kvarvarande dubbelsträngat DNA i decellulariserade lungor och frånvaro av DNA-fragment genom gelelektrofores och kärnfärgning genom hematoxylin och eosin (H &E)färgning 9,21.
1. Inställning
- Samla all nödvändig utrustning som krävs för dissektionsproceduren, inklusive en gryta i glas, två par kirurgiska pincett, ett par pincett och ett par kirurgiska saxar och autoklav före användning.
- Skaffa en del av lungan, placera den i glasgrytan och orientera den så att den överlägsna änden av luftvägarna kan ses tydligt.
- Identifiera den proximala änden av vaskulaturen och håll den intakt tills senare steg. Slutet på vaskulaturen ska vara tydligt synligt och helt ogenomskinligt vitt i färg.
- Använd en pincett och kirurgisk sax, ta bort eventuell pleura som kan fodra utsidan av lungan och kassera.
2. Exponera luftvägarna
- Använd en spridningsteknik med den kirurgiska saxen, arbeta försiktigt för att exponera den extra luftvägen.
- Leta reda på den största luftvägen, som vanligtvis har en diameter på cirka 2-4 cm. Ett annat sätt att identifiera en luftväg är genom observation av broskringar, som kan detekteras visuellt eller via palpation av vävnaden.
- Använd ett par pincett, palpera ner luftvägarnas längd för att bestämma placeringen av den osynliga luftvägen till ett djup av ungefär 1 tum.
OBS: Att vara fodrad med broskringar är luftvägarna karakteristiskt hårdare än de andra lungvävnaderna. Som sådan bör det vara relativt enkelt att hitta och palpera de osynliga luftvägarna. - Håll den kirurgiska saxen parallellt med luftvägarna, sätt in de stängda spetsarna i vävnaden som direkt omger den osynliga luftvägen.
- Öppna långsamt den kirurgiska saxen för att försiktigt dra isär det omgivande membranet. Ta sedan bort den kirurgiska saxen och undvik att skära någon vävnad alls.
- Upprepa denna process intermittent under hela dissektionsproceduren för att fortsätta exponera luftvägarna.
- Använd den kirurgiska saxen, skär luftvägarna vid förgreningspunkterna och dissekera längs endera grenen oberoende.
OBS: En förgreningspunkt är en plats där en luftväg delar sig i två separata luftvägar. - Skär av områden i luftvägarna när du är säker på att de intakta ändarna kommer att förbli identifierbara och lätt lokaliserade för ytterligare dissektion.
- Placera avskurna områden i luftvägen i motsvarande rör. Storleken på de avskurna regionerna varierar beroende på provet, men kommer i allmänhet att sträcka sig mellan 1-5 cm i längd. Bredden varierar beroende på den relativa platsen längs luftvägsträdet, med de distala regionerna som bibehåller mindre bredder än de mer proximala regionerna.
3. Exponera och excisera regioner i vaskulaturen
- Applicera försiktigt tryck på vaskulaturen och dra långsamt bort från luftvägarna. Låt kärlen sträcka sig något och använd kirurgisk sax för att ytterligare separera vaskulaturen från luftvägarna.
OBS: För mycket tryck kommer att riva vaskulaturen. Om vaskulaturen rivs, placera helt enkelt den delen av vaskulaturen i motsvarande märkta rör och identifiera dess intakta ände. - När en förgreningspunkt i kärlträdet har exponerats, använd kirurgisk sax och pincett för att exponera mer underlägsna områden i vaskulaturen.
- Börja med att sätta in de stängda spetsarna på den kirurgiska saxen strax under en förgreningspunkt och mellan de två motsvarande vaskulaturregionerna.
- Öppna långsamt saxen för att sprida isär de underliggande vävnaderna.
- Använd intermittent en pincett för att ta bort vävnaden som spreds isär med hjälp av den kirurgiska saxen, liksom all annan vävnad som direkt omger vaskulaturen.
- När vaskulaturen täcker områden i luftvägarna eller blir besvärlig för något steg i dissektionsproceduren, skär vaskulaturen vid en förgreningspunkt och dissekera vidare längs endera grenen oberoende.
- Skär av områden i vaskulaturen en gång säker på att de intakta ändarna kommer att förbli identifierbara och lätt lokaliserade för ytterligare dissektion.
4. Identifiera och excisera alveolär vävnad
- Använd en pincett eller pincett, nyp och riv sedan försiktigt bort små områden av alveolär vävnad.
- Lokalisera en region av vävnad som inte ligger i direkt närhet av luftvägarna eller vaskulaturen.
- Använd pincetten och nyp en liten region av vävnaden som verkar sakna vaskulatur eller luftvägar.
- Riv det klämda området av vävnaden från lungan.
- Observera det borttagna vävnadsområdet och bekräfta om det är alveolär vävnad eller inte.
OBS: Alveolär vävnad finns i hela lungan, så den kan och bör avlägsnas under hela dissektionsproceduren. Varje vävnad som inte lätt kan identifieras som primärt alveoler, vaskulatur eller luftvägar bör kategoriseras som bulkvävnad och placeras i motsvarande märkta rör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En övergripande schematisk bild av protokollet visas i figur 1. När den väl behärskats är den regionala dissektionen av decellulariserad lungvävnad lätt reproducerbar. Att bestämma kategoriseringen av varje avskuret vävnadsprov är absolut nödvändigt för att dissektionsproceduren ska lyckas. Vaskulär vävnad är väsentligt mer elastisk än luftvägarna, så att använda pincett för att sträcka vävnaden är ofta en stark indikator på om ett visst prov är vaskulatur eller luftväg. Vanligtvis löper kärlvävnad parallellt med luftvägarna (figur 2A). Vaskulär vävnad tenderar också att se vitare och ogenomskinlig ut i färg (figur 2B) än luftvägsvävnad (figur 2C). Den kirurgiska saxspridningstekniken som beskrivs i protokollet visas i figur 3. Större prover av luftvägarna omfattas av ringar av brosk som verkar något vitare än själva luftvägarna. Således är observation av broskringar en omedelbar indikator på att provet i fråga är luftvägarna (figur 4). Att bestämma om ett prov huvudsakligen är alveoler är något mer komplicerat på grund av att alveoler är närvarande i hela lungan och för små för att observera med bara ögon. När alveolär vävnad väl har avlägsnats tenderar den att dra sig tillbaka till en lökliknande form och verkar relativt homogen (figur 5). Ibland kan alveolär vävnad verka fläckig, men den bör aldrig innehålla synliga vita streck eftersom detta kan föreslå närvaron av medelstora till stora luftvägar eller vaskulatur. I de fall där vita streck eller andra oidentifierbara strukturer observeras bör vävnadsprovet kategoriseras som bulklunga och placeras i motsvarande märkta rör. Denna dissektionsprocess är inexakt och som sådan klassificerar vi den alveolära vävnadskategorin som alveolär anrikad. Med hjälp av detta protokoll är det omöjligt att erhålla ett 100% rent alveolärt vävnadsprov. Vi har dock tidigare visat med hjälp av masspektrometri att ECM-sammansättningen varierar mellan enskilda regioner av decellulariserade lungor, inklusive hela lung-ECM (wECM), alveolär anrikad ECM (aECM), luftvägs-ECM (airECM) och vaskulatur-ECM (vECM) (figur 6A-F)21. I synnerhet i decellulariserade lungor erhållna från patienter utan historia av lungsjukdom har vi karakteriserat en anrikning av basalmembranassocierade proteiner (dvs lamininer) i aECM, medan airECM anrikas i broskassocierade ECM-proteiner, såsom aggrecan (ACAN), och vECM anrikas med fibronektin (FN1) och andra lösliga ECM-proteiner associerade med blodkärl (figur 6G, H)21. Dessutom har vi tidigare visat att ECM-sammansättningen förändras hos patienter med IPF eller KOL på ett regionspecifikt sätt, vilket belyser behovet av metoder för att förhöra enskilda lungregioner som beskrivs här21.
Figur 1: Schematisk representation av hela lungdecellulariserings- och dissektionsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel som visar skillnaden mellan decellulariserad luftväg och kärlvävnad under dissektion . (A) Initial anatomi med luftvägarna och kärlen intill varandra. (B) luftvägar och (C) vaskulatur som var och en hålls med pincett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förfarande för identifiering och skörd av kärl . (A) Stora området av lungkärl hålls upprätt med pincett. Det finns inga broskringar och vävnaden har en viss grad av elasticitet, vilket bekräftar att provet är vaskulatur. (B) Kirurgisk sax används för att försiktigt skära av den övre delen av kärlen. (C) Mer än tillräckligt med kärl behålls under snittet så att det lätt kan flyttas och dissekeras ytterligare. (D) Ett avsnitt av mer distal vaskulatur som kan sektioneras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förfarande för identifiering och upptagning av luftvägar . (A) Stora delar av luftvägarna hålls upprätt med pincett. Bilden visar tydliga broskringar, vilket bekräftar att provet är luftvägs. (B) Kirurgiska saxar används för att försiktigt skära av den övre delen av luftvägarna. (C) Mer än tillräckligt med luftvägar hålls kvar under snittet så att det lätt kan flyttas och dissekeras ytterligare. (D) Den avskurna luftvägen placeras i motsvarande märkta rör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Exempel som visar ett representativt prov av alveolär vävnad. Isolerad alveolär vävnad hålls upp för undersökning med ett par pincett. Det alveolära vävnadsprovet är sfäriskt efter extraktion från lungan och har enhetlig färgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Decellulariserad lungmatrisom varierar beroende på anatomisk region. Representativ bild av en decellulariserad human lunga på ventral (A) och dorsal (B) sida och efterföljande dissektion till isolerade luftvägs- (C) och vaskulära (D) träd. € Flytande kväve malda ECM-pulver av hela decellulariserade lung-ECM (wECM), samt ECM från alveolära anrikade (aECM), luftvägsanrikade (airECM) och vaskulaturberikade (vECM) regioner. F) Diagram över huvudkomponentanalys (PCA) som visar likheten mellan den totala matrisomsammansättningen och regionspecifika prover. (G) Förhållandet mellan genomsnittlig basalmembransammansättning från decellulariserade lungspecifika regioner. (H) Värmekarta över topp 25 matrisomproteiner över alla decellulariserade lungregioner. Denna siffra är omtryckt från Hoffman et al.21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Decellulariserade vävnader från människor och andra arter används ofta som biomaterial för att studera ECM-sammansättning såväl som cell-ECM-interaktioner i ex vivo-odlingsmodeller, inklusive 3D-hydrogeler12,13. I likhet med andra organ har decellulariserade lungor tidigare använts för att bestämma ECM-sammansättningsskillnader i friska kontra sjuka (dvs. emfysematösa och IPF) lungor och används alltmer som hydrogeler för att studera ECM-dynamik och cell-ECM-interaktioner 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Proteomik- och hydrogelstudier i decellulariserade lungor har emellertid endast beaktat lungan som helhet och kan därför inte bestämma enskilda anatomiska regioners roll på övergripande studieresultat. Eftersom lungan är ett komplext organ som drastiskt varierar i fysiologisk roll, sammansättning och struktur mellan anatomiska regioner är det viktigt att utveckla metoder för att studera dessa enskilda regioner separat21,22. Här beskriver vi en innovativ metod för att härleda individuella anatomiska regioner (alveolära anrikade, luftvägs- och vaskulaturregioner) från decellulariserade lungor för en mängd olika nedströmsapplikationer, inklusive både proteomisk karakterisering och ex vivo-hydrogelstudier21
Efter hellungdecellularisering beskriver vår metod ett stegvis dissektionsprotokoll för att berika luftvägs- och kärlträd. Att fortsätta med försiktighet är den viktigaste aspekten av dissektionsproceduren för att inte felidentifiera ett visst prov eller slumpmässigt skära av ett vävnadsområde. En potentiell konsekvens av det senare är att förlora koll på var luftvägarna eller vaskulaturen dirigeras i lungan. För närvarande är det bästa praxis att hålla luftvägarna eller vaskulaturen med pincett tills vävnaden utsätts för den punkt där den kan samlas in. I framtiden kan ändringar av detta protokoll innefatta applicering av en klämma på den exponerade änden av luftvägarna eller vaskulaturen, vilket skulle möjliggöra konstant identifiering av vävnaden som aktivt dissekeras. Tidigare modifieringar inkluderade införandet av en spridningsteknik med kirurgisk sax, som beskrivs i protokollet. Före användningen av en spridningsteknik utfördes en manuell metod för att exponera luftvägarna eller kärlen som involverade att riva bort omgivande vävnad. Denna modifiering är effektivare vid exponering av luftvägarna eller vaskulaturen och begränsar mängden skador på omgivande vävnader, som sedan kan dissekeras ytterligare i regionspecifika prover.
En begränsning av detta förfarande är att det kan vara svårt att undvika oavsiktlig avskiljning av små kärl och luftvägar, eftersom när dessa når mindre diametrar blir de alltmer känsliga. Som sådan blir det mer fördelaktigt att avstå från upphandling av extremt små luftvägar och vaskulatur och att kategorisera regionen som bulk istället. Detta är helt acceptabelt, eftersom bulklungvävnad är tänkt att innehålla en blandning av alla lungvävnadstyper. En annan begränsning är svårigheten att isolera ren alveolär vävnad utan att provet innehåller spårmängder av kärl eller luftvägar. Ett enkelt sätt att undvika detta är att samla små prover av alveolär vävnad (ca 5 mm3), så att mitten av vävnadsprovet är mindre benägna att innehålla oönskade vävnadstyper.
De beskrivna metoderna är nya och vi känner för närvarande inte till några andra regionspecifika lungdissektionsmetoder. Detta protokoll ger möjlighet att skilja mellan olika regioner i lungan, vilket skapar en mer robust vetenskaplig förståelse av kompositionen.
Detta dissektionsprotokoll kan ha tillämpningar vid generering av hydrogeler för 2D- och 3D-cellodlingsapplikationer, liksom utveckling av biobläck för 3D-utskriftsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar UVM-obduktionstjänsterna för mänsklig lungupphandling och Robert Pouliot PhD för bidrag till de övergripande dissektionsteknikerna. Dessa studier stöddes av R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B.
- Raherison, C., Girodet, P. -O.
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M.
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F.
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
