حبات معدلة بالبورفيرين لاستخدامها كضوابط تعويض في قياس التدفق الخلوي
Summary
يصف البروتوكول كيفية تحضير حبات التعويض القائمة على البورفيرين لقياس التدفق الخلوي عن طريق تفاعل حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع البورفيرين TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC. يتم استخدام إجراء الترشيح لتقليل المنتجات الثانوية للجسيمات.
Abstract
يمكن لقياس التدفق الخلوي توصيف وقياس مجموعات الخلايا المتنوعة بسرعة بناء على قياسات مضان. يتم تلطيخ الخلايا أولا بواحد أو أكثر من الكواشف الفلورية ، كل منها يعمل بجزيء فلوري مختلف (فلوروفور) يرتبط بالخلايا بشكل انتقائي بناء على خصائصها المظهرية ، مثل تعبير مستضد سطح الخلية. يمكن قياس شدة التألق من كل كاشف مرتبط بالخلايا على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التي تكتشف نطاقا محددا من الأطوال الموجية. عند استخدام العديد من الفلوروفورات ، غالبا ما يمتد الضوء من الفلوروفورات الفردية إلى قنوات الكشف غير المرغوب فيها ، الأمر الذي يتطلب تصحيحا لبيانات شدة التألق في عملية تسمى التعويض.
هناك حاجة إلى جزيئات التحكم في التعويض ، وعادة ما تكون حبات البوليمر المرتبطة بفلوروفور واحد ، لكل فلوروفور يستخدم في تجربة وضع العلامات على الخلايا. تستخدم البيانات من جزيئات التعويض من مقياس التدفق الخلوي لتطبيق تصحيح لقياسات شدة التألق. يصف هذا البروتوكول تحضير وتنقية حبات تعويض البوليسترين التي تعمل تساهميا مع الكاشف الفلوري meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) وتطبيقها في تعويض قياس التدفق الخلوي. في هذا العمل ، تمت معالجة حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين باستخدام TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) –N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) عند الرقم الهيدروجيني 6 وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة مع التقليب. تم عزل حبات TCPP عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت pH 7 للتخزين. لوحظت الجسيمات المرتبطة ب TCPP كمنتج ثانوي. يمكن تقليل عدد هذه الجسيمات باستخدام بروتوكول ترشيح اختياري. تم استخدام حبات TCPP الناتجة بنجاح على مقياس التدفق الخلوي للتعويض في التجارب مع خلايا البلغم البشرية الموسومة بفلوروفورات متعددة. أثبتت حبات TCPP أنها مستقرة بعد تخزينها في الثلاجة لمدة 300 يوم.
Introduction
كانت البورفيرينات ذات أهمية لسنوات عديدة في المجال الطبي الحيوي بسبب مضانها وخصائصها التي تستهدف الورم1،2،3. تستلزم التطبيقات العلاجية مثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) والعلاج بالموجات فوق الصوتية (SDT) الإدارة الجهازية للبورفيرين لمريض السرطان ، وتراكم الدواء في الورم ، والتعرض الموضعي للورم لضوء ليزر بطول موجي محدد أو الموجات فوق الصوتية. يؤدي التعرض لضوء الليزر أو الموجات فوق الصوتية إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة البورفيرين وموت الخلايا اللاحق 4,5. في التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) ، يستخدم مضان البورفيرين لتمييز الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية6. في هذا السياق ، يستخدم البروتوبورفيرين التاسع ، وهو بورفيرين فلوري طبيعي يتراكم في الأورام عند الحقن الجهازي أو المحلي لسلائفه ، حمض 5-aminolevulinic (5-ALA) ، لتحديد أورام انسجة الجهاز الهضمي وسرطان المثانة وسرطان الدماغ 7,8. في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف علاج 5-ALA كنهج للكشف عن الحد الأدنى من المرض المتبقي في المايلوماالمتعددة 9. يستخدم مختبرنا رباعي البورفيرين TCPP (5،10،15،20-tetrakis- (4-carboxyphenyl) -21،23 H-porphine) لقدرته على تلطيخ خلايا سرطان الرئة والخلايا المرتبطة بالسرطان بشكل انتقائي في عينات البلغم البشري ، وهي خاصية تم استغلالها في المقايسات التشخيصية الخلوية القائمة على الشرائحوالتدفق 10.
بعض البورفيرينات ثنائية الوظيفة حيث يمكن استخدامها كعوامل علاجية وتشخيصية 2,11. في البحوث الطبية الحيوية ، تستخدم هذه البورفيرينات ثنائية الوظيفة لتقييم كيف أن قدرتها على استهداف الخلايا السرطانية وقتلها بشكل انتقائي هي دالة على هيكلها وكذلك كيفية تأثرها بوجود مركبات أخرى12،13،14،15،16. يمكن قياس كل من الامتصاص الخلوي للبورفيرينات وسميتها الخلوية على منصة قياس التدفق الخلوي بطريقة عالية الإنتاجية. أطياف الامتصاص والانبعاث للبورفيرينات الفلورية معقدة ، ولكن معظم منصات قياس التدفق الخلوي مجهزة لتحديدها بشكل صحيح. يتميز طيف امتصاص البورفيرينات الفلورية بنطاق امتصاص قوي في نطاق 380-500 نانومتر ، والمعروف باسم نطاق سوريت. يتم ملاحظة نطاقين إلى أربعة نطاقات امتصاص أضعف بشكل عام في نطاق 500-750 نانومتر (نطاقات Q)17. يمكن لليزر الأزرق 488 نانومتر ، الموجود في معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي ، أو الليزر البنفسجي (405 نانومتر) أن يولد ضوءا بالطول الموجي المناسب لإثارة البورفيرينات. عادة ما تعرض أطياف انبعاث البورفيرينات قمم في نطاق 600-800 نانومتر18 ، مما يؤدي إلى تداخل طيفي ضئيل للغاية مع فلوريسئين إيزوثيوسيانات أو فيكوريثرين (PE) ولكن تداخل كبير مع الفلوروفورات الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان ، مثل allophycocyanin (APC) ، وكذلك الفلوروفورات الترادفية ، مثل PE-Cy5 وغيرها. لذلك ، عند استخدام البورفيرينات في مقايسات قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، فإن ضوابط الفلوروفور المفردة ضرورية لتصحيح انتشار التألق بشكل كاف في قنوات أخرى غير تلك المخصصة لقياس مضان البورفيرين.
من الناحية المثالية ، يجب أن تتكون أدوات التحكم أحادية الفلوروفور المستخدمة لحساب مصفوفة الامتداد للوحة من الفلوروفورات (وتسمى أيضا “ضوابط التعويض”) من نفس نوع (أنواع) الخلايا مثل العينة. ومع ذلك ، فإن استخدام العينة لهذا الغرض ليس هو الأمثل إذا كان هناك القليل جدا من العينة للبدء بها أو إذا كان السكان المستهدفون داخل العينة صغيرا جدا (على سبيل المثال ، إذا أراد المرء أن ينظر إلى الحد الأدنى المتبقي من المرض أو الخلايا السرطانية في المراحل المبكرة من المرض). بديل مفيد للخلايا هو الخرز المقترن بنفس الفلوروفور المستخدم لتحليل العينة. العديد من هذه الخرز متاحة تجاريا. هذه الحبيبات إما موسومة مسبقا بالفلوروفور المطلوب (حبات خاصة بالفلوروفور المسمى مسبقا)19,20 ، أو يمكن إرفاق جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت بها (حبات التقاط الأجسام المضادة)20,21. في حين أن حبات التعويض التجارية متاحة للعديد من الفلوروفورات ، فإن هذه الخرزات غير متوفرة للبورفيرينات ، على الرغم من استخدامها المتزايد في البحوث الأساسية والسريرية.
بالإضافة إلى الحفاظ على العينة والمجموعات السكانية الإيجابية مقابل السلبية ذات الحجم المناسب ، فإن المزايا الأخرى لاستخدام الخرز كضوابط تعويض هي سهولة التحضير ، ومضان الخلفية المنخفض ، والاستقرار الممتاز بمرور الوقت22. العيب المحتمل لاستخدام الخرز كعنصر تحكم في التعويض هو أن طيف انبعاث الجسم المضاد الفلوري الذي تم التقاطه على الخرز قد يختلف عن نفس الجسم المضاد المستخدم لتسمية الخلايا. قد يكون هذا ذا أهمية خاصة عند استخدام مقياس التدفق الخلويالطيفي 20. لذلك ، يجب إجراء تطوير الخرز كعنصر تحكم في التعويض على مقياس التدفق الخلوي الذي سيتم استخدامه للفحص الذي تم تطوير الخرز من أجله. علاوة على ذلك ، يجب أن يتضمن تطوير الخرز مقارنة مع الخلايا الموسومة بنفس كاشف تلطيخ الفلورسنت.
هنا ، نصف تحضير حبات تعويض البوليسترين التي تعمل بالأمين TCPP ، والتي كان متوسط شدة مضانها في قناة الكشف مشابها لتلك الموجودة في الخلايا التي تحمل علامة TCPP في البلغم ، واستخدامها كضوابط تعويض لقياس التدفق الخلوي. كان التألق الذاتي للخرز المكافئ غير الوظيفي منخفضا بما يكفي لاستخدامها كضوابط تعويض مضان سلبية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت هذه الخرز الاستقرار في التخزين لما يقرب من 1 سنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من التطبيقات العديدة للبورفيرينات في تشخيص السرطان وعلاجاته2 ، إلا أن هناك أدبيات محدودة حول استخدامها المحتمل ككاشف لقياس التدفق الخلوي لتحديد مجموعات الخلايا السرطانية مقابل غير السرطانية في الأنسجة البشرية الأولية24،25،<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ديفيد رودريغيز على المساعدة في إعداد الشكل وخدمات علم الأمراض الدقيقة (سان أنطونيو ، تكساس) لاستخدام مقياس التدفق الخلوي Navios EX.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
