Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

حبات معدلة بالبورفيرين لاستخدامها كضوابط تعويض في قياس التدفق الخلوي

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

يصف البروتوكول كيفية تحضير حبات التعويض القائمة على البورفيرين لقياس التدفق الخلوي عن طريق تفاعل حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع البورفيرين TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC. يتم استخدام إجراء الترشيح لتقليل المنتجات الثانوية للجسيمات.

Abstract

يمكن لقياس التدفق الخلوي توصيف وقياس مجموعات الخلايا المتنوعة بسرعة بناء على قياسات مضان. يتم تلطيخ الخلايا أولا بواحد أو أكثر من الكواشف الفلورية ، كل منها يعمل بجزيء فلوري مختلف (فلوروفور) يرتبط بالخلايا بشكل انتقائي بناء على خصائصها المظهرية ، مثل تعبير مستضد سطح الخلية. يمكن قياس شدة التألق من كل كاشف مرتبط بالخلايا على مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التي تكتشف نطاقا محددا من الأطوال الموجية. عند استخدام العديد من الفلوروفورات ، غالبا ما يمتد الضوء من الفلوروفورات الفردية إلى قنوات الكشف غير المرغوب فيها ، الأمر الذي يتطلب تصحيحا لبيانات شدة التألق في عملية تسمى التعويض.

هناك حاجة إلى جزيئات التحكم في التعويض ، وعادة ما تكون حبات البوليمر المرتبطة بفلوروفور واحد ، لكل فلوروفور يستخدم في تجربة وضع العلامات على الخلايا. تستخدم البيانات من جزيئات التعويض من مقياس التدفق الخلوي لتطبيق تصحيح لقياسات شدة التألق. يصف هذا البروتوكول تحضير وتنقية حبات تعويض البوليسترين التي تعمل تساهميا مع الكاشف الفلوري meso-tetra (4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) وتطبيقها في تعويض قياس التدفق الخلوي. في هذا العمل ، تمت معالجة حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين باستخدام TCPP وكاشف اقتران الأميد EDC (N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) عند الرقم الهيدروجيني 6 وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة مع التقليب. تم عزل حبات TCPP عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت pH 7 للتخزين. لوحظت الجسيمات المرتبطة ب TCPP كمنتج ثانوي. يمكن تقليل عدد هذه الجسيمات باستخدام بروتوكول ترشيح اختياري. تم استخدام حبات TCPP الناتجة بنجاح على مقياس التدفق الخلوي للتعويض في التجارب مع خلايا البلغم البشرية الموسومة بفلوروفورات متعددة. أثبتت حبات TCPP أنها مستقرة بعد تخزينها في الثلاجة لمدة 300 يوم.

Introduction

كانت البورفيرينات ذات أهمية لسنوات عديدة في المجال الطبي الحيوي بسبب مضانها وخصائصها التي تستهدف الورم1،2،3. تستلزم التطبيقات العلاجية مثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) والعلاج بالموجات فوق الصوتية (SDT) الإدارة الجهازية للبورفيرين لمريض السرطان ، وتراكم الدواء في الورم ، والتعرض الموضعي للورم لضوء ليزر بطول موجي محدد أو الموجات فوق الصوتية. يؤدي التعرض لضوء الليزر أو الموجات فوق الصوتية إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة البورفيرين وموت الخلايا اللاحق 4,5. في التشخيص الضوئي الديناميكي (PDD) ، يستخدم مضان البورفيرين لتمييز الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية6. في هذا السياق ، يستخدم البروتوبورفيرين التاسع ، وهو بورفيرين فلوري طبيعي يتراكم في الأورام عند الحقن الجهازي أو المحلي لسلائفه ، حمض 5-aminolevulinic (5-ALA) ، لتحديد أورام انسجة الجهاز الهضمي وسرطان المثانة وسرطان الدماغ 7,8. في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف علاج 5-ALA كنهج للكشف عن الحد الأدنى من المرض المتبقي في المايلوماالمتعددة 9. يستخدم مختبرنا رباعي البورفيرين TCPP (5،10،15،20-tetrakis- (4-carboxyphenyl) -21،23 H-porphine) لقدرته على تلطيخ خلايا سرطان الرئة والخلايا المرتبطة بالسرطان بشكل انتقائي في عينات البلغم البشري ، وهي خاصية تم استغلالها في المقايسات التشخيصية الخلوية القائمة على الشرائحوالتدفق 10.

بعض البورفيرينات ثنائية الوظيفة حيث يمكن استخدامها كعوامل علاجية وتشخيصية 2,11. في البحوث الطبية الحيوية ، تستخدم هذه البورفيرينات ثنائية الوظيفة لتقييم كيف أن قدرتها على استهداف الخلايا السرطانية وقتلها بشكل انتقائي هي دالة على هيكلها وكذلك كيفية تأثرها بوجود مركبات أخرى12،13،14،15،16. يمكن قياس كل من الامتصاص الخلوي للبورفيرينات وسميتها الخلوية على منصة قياس التدفق الخلوي بطريقة عالية الإنتاجية. أطياف الامتصاص والانبعاث للبورفيرينات الفلورية معقدة ، ولكن معظم منصات قياس التدفق الخلوي مجهزة لتحديدها بشكل صحيح. يتميز طيف امتصاص البورفيرينات الفلورية بنطاق امتصاص قوي في نطاق 380-500 نانومتر ، والمعروف باسم نطاق سوريت. يتم ملاحظة نطاقين إلى أربعة نطاقات امتصاص أضعف بشكل عام في نطاق 500-750 نانومتر (نطاقات Q)17. يمكن لليزر الأزرق 488 نانومتر ، الموجود في معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي ، أو الليزر البنفسجي (405 نانومتر) أن يولد ضوءا بالطول الموجي المناسب لإثارة البورفيرينات. عادة ما تعرض أطياف انبعاث البورفيرينات قمم في نطاق 600-800 نانومتر18 ، مما يؤدي إلى تداخل طيفي ضئيل للغاية مع فلوريسئين إيزوثيوسيانات أو فيكوريثرين (PE) ولكن تداخل كبير مع الفلوروفورات الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان ، مثل allophycocyanin (APC) ، وكذلك الفلوروفورات الترادفية ، مثل PE-Cy5 وغيرها. لذلك ، عند استخدام البورفيرينات في مقايسات قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان ، فإن ضوابط الفلوروفور المفردة ضرورية لتصحيح انتشار التألق بشكل كاف في قنوات أخرى غير تلك المخصصة لقياس مضان البورفيرين.

من الناحية المثالية ، يجب أن تتكون أدوات التحكم أحادية الفلوروفور المستخدمة لحساب مصفوفة الامتداد للوحة من الفلوروفورات (وتسمى أيضا "ضوابط التعويض") من نفس نوع (أنواع) الخلايا مثل العينة. ومع ذلك ، فإن استخدام العينة لهذا الغرض ليس هو الأمثل إذا كان هناك القليل جدا من العينة للبدء بها أو إذا كان السكان المستهدفون داخل العينة صغيرا جدا (على سبيل المثال ، إذا أراد المرء أن ينظر إلى الحد الأدنى المتبقي من المرض أو الخلايا السرطانية في المراحل المبكرة من المرض). بديل مفيد للخلايا هو الخرز المقترن بنفس الفلوروفور المستخدم لتحليل العينة. العديد من هذه الخرز متاحة تجاريا. هذه الحبيبات إما موسومة مسبقا بالفلوروفور المطلوب (حبات خاصة بالفلوروفور المسمى مسبقا)19,20 ، أو يمكن إرفاق جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت بها (حبات التقاط الأجسام المضادة)20,21. في حين أن حبات التعويض التجارية متاحة للعديد من الفلوروفورات ، فإن هذه الخرزات غير متوفرة للبورفيرينات ، على الرغم من استخدامها المتزايد في البحوث الأساسية والسريرية.

بالإضافة إلى الحفاظ على العينة والمجموعات السكانية الإيجابية مقابل السلبية ذات الحجم المناسب ، فإن المزايا الأخرى لاستخدام الخرز كضوابط تعويض هي سهولة التحضير ، ومضان الخلفية المنخفض ، والاستقرار الممتاز بمرور الوقت22. العيب المحتمل لاستخدام الخرز كعنصر تحكم في التعويض هو أن طيف انبعاث الجسم المضاد الفلوري الذي تم التقاطه على الخرز قد يختلف عن نفس الجسم المضاد المستخدم لتسمية الخلايا. قد يكون هذا ذا أهمية خاصة عند استخدام مقياس التدفق الخلويالطيفي 20. لذلك ، يجب إجراء تطوير الخرز كعنصر تحكم في التعويض على مقياس التدفق الخلوي الذي سيتم استخدامه للفحص الذي تم تطوير الخرز من أجله. علاوة على ذلك ، يجب أن يتضمن تطوير الخرز مقارنة مع الخلايا الموسومة بنفس كاشف تلطيخ الفلورسنت.

هنا ، نصف تحضير حبات تعويض البوليسترين التي تعمل بالأمين TCPP ، والتي كان متوسط شدة مضانها في قناة الكشف مشابها لتلك الموجودة في الخلايا التي تحمل علامة TCPP في البلغم ، واستخدامها كضوابط تعويض لقياس التدفق الخلوي. كان التألق الذاتي للخرز المكافئ غير الوظيفي منخفضا بما يكفي لاستخدامها كضوابط تعويض مضان سلبية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت هذه الخرز الاستقرار في التخزين لما يقرب من 1 سنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب القيام بجميع الإجراءات باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. تحضير محلول مخزون TCPP ، 1.0 مجم / مل

ملاحظة: يمكن إعداد هذا شهريا.

  1. باستخدام ميزان تحليلي وملعقة وورق وزن ، تزن 49.0-50.9 مجم من TCPP. تقريب الوزن إلى 1/10 ملليغرام. اضبط الكمية المقاسة من TCPP جانبا محمية من الضوء.
    ملاحظة: استخدم مسدسا ثابتا إذا كانت قراءة الوزن غير مستقرة.
  2. حدد الكميات المطلوبة من الماء النقي والأيزوبروبانول (IPA) من الجدول 1 بناء على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1. أضف الماء النقي والأيزوبروبانول إلى دورق زجاجي سعة 100 مل ، وقم بتغطيته ببارافيلم للحماية من التبخر.
  3. حدد الكمية المطلوبة من بيكربونات الصوديوم من الجدول 1 بناء على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1 .
  4. باستخدام الميزان التحليلي والملعقة وورق الوزن، قم بوزن الكمية المطلوبة من بيكربونات الصوديوم المحددة في الخطوة 1.3. تقريب الوزن إلى 1/10 ملليغرام.
    ملاحظة: استخدم مسدسا ثابتا إذا كانت قراءة الوزن غير مستقرة.
  5. أضف بيكربونات الصوديوم إلى الدورق سعة 100 مل الذي يحتوي على ماء نقي وأيزوبروبانول. قم بتغطية المحلول بالأغشية الرقيقة للحماية من التبخر.
  6. ضع المحلول من الخطوة 1.5 على طبق تقليب ، وحركه حتى يذوب (حوالي 10 دقائق)
  7. قم بقياس الأس الهيدروجيني للتأكد من أن المحلول المحتوي على بيكربونات الصوديوم من الخطوة 1.6 له أس هيدروجيني بين 9 و10.
  8. أضف وزن TCPP ببطء في الخطوة 1.1 إلى المحلول من الخطوة 1.7 ، واستمر في التقليب حتى يذوب (~ 30 دقيقة). يحفظ بعيدا عن الضوء أثناء هذه الخطوة.
  9. تخزينها في وعاء زجاجي أو البولي بروبلين في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء.

2. تحضير 2- (N -morpholino) - حمض إيثان سلفونيك (MES) ومحلول عازلة ملح الصوديوم ، 0.1 M ، درجة الحموضة 6.0-6.2 ("MES buffer")

ملاحظة: يجب تحضير هذا في يوم الاستخدام وحفظه في درجة حرارة الغرفة.

  1. قم بوزن 2.50 جم من ملح الصوديوم MES ، وأضفه إلى زجاجة بلاستيكية سعة 150 مل.
  2. أضف 121 مل من الماء النقي ، وقم بإذابته عن طريق الرج اليدوي حتى لا تظهر مادة صلبة.
  3. قم بقياس الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت MES للتأكد من أنه بين 6 و 6.2.
  4. يحفظ في درجة حرارة الغرفة للاستخدام في نفس اليوم.

3. N- (3-ديميثليامينوبروبيل) -N'-إيثيل كاربوديميد (EDC) مسحوق

  1. أخرج مسحوق EDC من الفريزر ، واتركه في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامه في الخطوة 5.

4. الجمع بين حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين مع محلول TCPP

  1. أضف 4.3 مل من محلول المخزن المؤقت 0.1 M MES المحضر في الخطوة 2 إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
  2. دوامة تعليق حبة البوليسترين الوظيفية بالأمين (10 ميكرومتر ، 2.5٪ وزن / حجم) لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  3. أضف 288 ميكرولتر من تعليق حبة الدوامة حديثا إلى المخزن المؤقت MES من الخطوة 4.1.
  4. دوامة حل MES / حبة لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة.
  5. دوامة محلول TCPP 1 مجم / مل محضر في الخطوة 1 لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة.
  6. أضف 1.20 مل من حل مخزون TCPP الدوامي حديثا إلى تعليق MES / حبة من الخطوة 4.4.
  7. دوامة تعليق MES / حبة / TCPP لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة.
  8. قم بتغطية الأنبوب بورق القصدير أثناء تحضير محلول EDC.

5. تحضير محلول مخزون هيدروكولوريد (HCl) N- (3-ديميثليامينوبروبيل) -N'-إيثيل كاربوديميد (EDC)

ملاحظة: محلول EDC قابل للتلف ويجب استخدامه مباشرة بعد التحضير.

  1. أضف 20.0 مل من الماء النقي إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  2. قم بوزن 200 مجم من EDC HCl من الخطوة 3 ، وأضفه إلى الماء (الخطوة 5.1).
  3. دوامة EDC HCL لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة لتوليد حل واضح.

6. إعداد حل عمل EDC HCl / MES

ملاحظة: محلول EDC HCl / MES قابل للتلف ويجب استخدامه مباشرة بعد التحضير.

  1. أضف 54.0 مل من محلول MES العازل (المحضر في الخطوة 2) إلى زجاجة بلاستيكية سعة 150 مل.
  2. أضف 6.0 مل من محلول مخزون EDC HCl (المحضر في الخطوة 5) إلى محلول المخزن المؤقت MES ، واخلطه بالرج لمدة 10 ثوان.

7. وضع العلامات على الخرز باستخدام TCPP

  1. أضف 4.5 مل من محلول عمل EDC (من الخطوة 6) إلى أنبوب البولي بروبلين سعة 15 مل الذي يحتوي على الخرزات و TCPP في المخزن المؤقت MES (الخطوة 4.7).
  2. ضع الأنبوب في دوار مقلوب عند 35 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة ومحمي من الضوء.
  3. جهاز طرد مركزي الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم.
  4. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخرزات في 0.8 مل من محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS).
  5. انقل محلول الخرزة إلى قارورة من مادة البولي بروبيلين الكهرمانية باستخدام ماصة سعة 1 مل ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    ملاحظة: الخرزات مستقرة لمدة 3 أشهر على الأقل في هذه المرحلة.

8. فحص الجودة (QC) لخرز TCPP عن طريق قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يجب أن تركز مراقبة الجودة على ما إذا كان متوسط شدة التألق (MFI) لخرز TCPP ساطعا بدرجة كافية للاستخدام المقصود وكمية الجسيمات الناتجة عن الإجراء. راجع قسم النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل.

  1. قم بتسمية أنبوب بوليسترين واحد سعة 5 مل باسم "حبات TCPP السالبة".
    ملاحظة: تختلف الخرزات السالبة عن الحبيبات الوظيفية للأمين المستخدمة في وضع العلامات. انظر جدول المواد.
  2. قم بتسمية أنبوب آخر باسم "حبات TCPP الإيجابية".
  3. قم بتسمية أنبوب آخر باسم "حبات قوس قزح".
  4. القسمة 300 ميكرولتر من HBSS المثلج البارد في الأنابيب الموسومة ب "حبات TCPP السالبة" و "حبات TCPP الإيجابية".
  5. أضف 500 ميكرولتر من HBSS المثلج البارد إلى الأنبوب المسمى "حبات قوس قزح".
  6. دوامة تعليق حبة البوليسترين غير الوظيفية (غير المصنفة) لفترة وجيزة بأقصى سرعة (2-3 ثوان) ، وأضف 10 ميكرولتر منه إلى الأنبوب المسمى "حبات TCPP السالبة".
  7. دوامة تعليق حبة TCPP المسمى (تم الانتهاء منه في الخطوة 7.5) لفترة وجيزة بأقصى سرعة ، وأضف 3 ميكرولتر منه إلى أنبوب "حبيبات TCPP الإيجابية".
  8. دوامة تعليق حبة قوس قزح لفترة وجيزة بأقصى سرعة ، وإضافة قطرتين منه في أنبوب "حبات قوس قزح".
  9. احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج ومغطاة ومحمية من الضوء.
  10. بدء إجراءات بدء التشغيل اليومية المناسبة لمقياس التدفق الخلوي ، وإجراء مراقبة الجودة للتحقق من السوائل المثلى ومحاذاة الليزر.
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الجزء من البروتوكول ، يفترض أن المشغل مدرب على استخدام مقياس التدفق الخلوي المتاح ، بما في ذلك إجراءات توحيد تشتت الضوء وشدة التألق ، وكذلك المبادئ الأساسية لحساب مصفوفة التعويض الصحيحة.
  11. قم بتشغيل حبات قوس قزح وخرز TCPP دون تغيير إعدادات الجهد بين عمليات التشغيل المختلفة.
    1. قم بتشغيل وجمع 10000 حدث من حبات قوس قزح.
    2. قم بإجراء شطف بالماء ، واجمع 10000 حدث من حبات TCPP السلبية.
    3. قم بإجراء شطف بالماء ، واجمع 10000 حدث من حبات TCPP الإيجابية.
    4. قم بإجراء شطف بالماء لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: من المهم إجراء شطف بالماء بعد تشغيل حبات TCPP. إذا لم يتم شطف TCPP من الخطوط الموجودة في مقياس الخلايا ، فهناك احتمال أن يتمكن TCPP المتبقي من تسمية الخلايا في الأنبوب التالي المراد الحصول عليه.
    5. قم بتنفيذ بروتوكولات التنظيف والإغلاق المناسبة الخاصة بتعليمات الشركة المصنعة لمقياس الخلايا.
      ملاحظة: للاطلاع على النتائج التمثيلية، انظر الشكل 1.

9. ترشيح حبة

ملاحظة: إذا أظهرت مراقبة الجودة للخرزات عن طريق قياس التدفق الخلوي (الخطوة 8) نسبة عالية من الجسيمات (70٪ أو أعلى) ، ففكر في ترشيح تعليق الخرزة باستخدام البروتوكول أدناه (الشكل 2).

  1. أضف 3.20 مل من HBSS المثلج البارد إلى 0.8 مل من تعليق حبة TCPP الذي تم الانتهاء منه في الخطوة 7.5 (إنشاء تخفيف خمسة أضعاف).
  2. دوامة تعليق حبة مخففة بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية.
  3. أخرج المكبس من حقنة سعة 5 مل يمكن التخلص منها.
  4. قم بتركيب المحقنة بفلتر طرف من الألياف الزجاجية (5 ميكرومتر ، قطر 13 مم).
  5. أضف 4 مل من HBSS إلى المحقنة.
  6. أضف 0.5 مل من معلق الخرزة المخففة الدوامة (الخطوة 9.2).
  7. استخدم المكبس لتصفية التعليق من خلال إعداد المحقنة / المرشح عند حوالي 2 قطرة / ثانية.
  8. اغسل الخرزات عن طريق سحب 5 مل من HBSS الطازج في المحقنة من خلال الفلتر عند حوالي 2 قطرة / ثانية.
  9. ادفع HBSS للخارج مرة أخرى في حاوية النفايات بمعدل 2 قطرة / ثانية تقريبا.
  10. لإزالة الخرزات من الفلتر ، ارسم 5 مل أخرى من HBSS الطازج في المحقنة من خلال الفلتر.
  11. قم بإزالة المرشح بعناية من المحقنة.
  12. أخرج تعليق الخرزة من المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.
  13. ضع الفلتر مرة أخرى على المحقنة ، وكرر الخطوات 9.10-9.12 أربع مرات أخرى. ثم تخلص من الفلتر والمحقنة.
  14. كرر الخطوات 9.2-9.13 حتى تتم تصفية جميع الخرزات من الخطوة 9.1. استخدم حقنة جديدة وقم بالتصفية في كل مرة.
  15. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخرزة المفلترة لمدة 10 دقائق عند 1000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  16. قم بنضح المادة الطافية لكل أنبوب سعة 50 مل ، وأعد تعليق الخرزات برفق ، وادمجها في 0.5 مل من HBSS الطازج.
  17. انقل الخرزات باستخدام ماصة دقيقة p1,000 إلى قنينة كهرمانية أو زجاجية أو بولي بروبيلين جديدة ، واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  18. كرر الخطوة 8 لتحديد ما إذا كانت نسبة الجسيمات المرتبطة ب TCPP في تعليق الخرزة المفلترة قد انخفضت. للاطلاع على النتائج التمثيلية، انظر الشكل 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول لوضع العلامات TCPP للخرز سريع وفعال نسبيا. يوضح الشكل 1 نتيجة تمثيلية لعملية وضع العلامات على حبيبات TCPP كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي. يوضح الشكل 1 أ المظهر الجانبي القياسي لخرز قوس قزح ، كما تم اكتشافه في القناة المناسبة للكشف عن TCPP. تعمل هذه الخرزات كضمان الجودة لتوحيد جهد الليزر للكشف عن TCPP بواسطة مقياس التدفق الخلوي. يوضح الشكل 1 ب ملف تعريف تشتت الضوء للبوليسترين الوظيفي بالأمين ، والخرز المسمى TCPP. يوضح الشكل 1C ملف تعريف تشتت الضوء للخرز غير الوظيفي (الخرز غير المصنف) ؛ نستخدم هذه كعنصر تحكم في حبة سالبة لحساب مصفوفة التعويض. يمثل السكان المشار إليهم بالمستطيل الأحمر ، والذي لا يوجد في تعليق الخرزة غير المسمى ، الجسيمات المرتبطة ب TCPP التي تشكلت عندما يتعرض TCPP لكاشف الاقتران EDC. يجب استبعاد هذه المجاميع عند تحديد شدة التألق (FI) للخرز. يوضح الشكل 1D FI للخرز المسمى ، الذي تم اختياره بواسطة البوابة السوداء في الشكل 1B ، والذي من الواضح أنه أعلى بعدة سجلات من FI للخرزات غير الموسومة (غير المؤرخة) (مقارنة الشكل 1D بالشكل 1E).

قد تختلف نسبة الجسيمات (أي الأحداث المشار إليها بواسطة البوابة الحمراء في الشكل 1 ب) لكل دفعة ملصق. بالنسبة لمعظم تطبيقات قياس التدفق الخلوي القياسية ، يسمح تعليق الخرزة الذي يحتوي على 50٪ من الجسيمات أو أقل بإعداد التعويض بشكل صحيح في تجربة قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان باستخدام TCPP. ومع ذلك ، هناك تطبيقات ، على سبيل المثال ، حيث يتم استخدام التحليل الآلي للبيانات ، والتي قد يتداخل فيها محتوى الجسيمات الأعلى بكثير مع إعدادات التعويض المناسبة. في مثل هذه الحالات ، يوصى بالترشيح (خطوة البروتوكول 9 والشكل 2). يوضح الشكل 3 تأثير الترشيح على تعليق الخرزة الذي يتكون من ~ 65٪ من الجسيمات (الألواح اليسرى من الشكل 3 أ ، ب). بعد الترشيح ، انخفض محتوى الجسيمات إلى ~ 12٪. الآثار الضارة للترشيح هي بعض فقدان الخرز (غير معروض) وفقدان طفيف في FI (الشكل 3C). يجب أن تؤخذ هذه التأثيرات في الاعتبار عند النظر في ترشيح تعليق الخرزة. بديل لترشيح الخرزة لخفض محتوى الجسيمات هو تغيير النسبة بين الخرز ، TCPP ، وكاشف اقتران EDC. ومع ذلك ، فإن التعديلات في هذه النسب تؤثر أيضا على FI للخرز.

العلاقة بين تكوين الجسيمات ، MFI ، ونسبة حبة / TCPP / EDC موضحة في الشكل 4 والشكل 5. يوضح الشكل 4A والشكل 5A MFI للخرزات الموسومة كدالة لنسبة EDC / TCPP ونسبة TCPP / حبة ، على التوالي. مع زيادة النسب ، يزداد مؤشر MFI حتى يستقر. توضح الأمثلة التمثيلية في الشكل 4B والشكل 5B أن محتوى الجسيمات يزداد مع زيادة النسبة المعنية. تم تحسين بروتوكول وضع العلامات TCPP هذا لأقصى قدر من MFI مع الحفاظ على محتوى الجسيمات منخفضا قدر الإمكان (الأسهم في الشكل 4A والشكل 5A). تظهر الجسيمات فقط عند استخدام EDC ككاشف اقتران أثناء إجراء وضع العلامات. باستخدام الخرز و TCPP فقط ، لا تتشكل الجسيمات (غير معروضة) ، ولكن وضع العلامات على الخرزات ينتج عنه خرز مع FI أقل بكثير (مقارنة الشكل 6A مع الشكل 6B). حاولنا استبدال طريقة الاقتران القائمة على EDC بطريقة تعتمد على إستر NHS المنشط (N-hydroxysuccinimide) ل TCPP23. ومع ذلك ، لم نجد فرقا كبيرا في FI باستخدام طريقة الاقتران البديلة هذه مقارنة باستخدام الخرز و TCPP معا ، مما يشير إلى وجود ارتباط تساهمي ضئيل ل TCPP بالخرز بهذه الطريقة (مقارنة الشكل 6B مع الشكل 6C).

تم جمع البيانات المقدمة في جميع الأشكال حتى الآن باستخدام حبات قطرها 10.6 ميكرومتر. افترضنا أن الخرزات الأكبر قد تحتوي على المزيد من مواقع ربط TCPP بسبب زيادة مساحة السطح وبالتالي يمكنها عرض FI أعلى. على العكس من ذلك ، افترضنا أن الخرزات الأصغر ذات مساحات السطح الأصغر وعدد أقل من مواقع ربط TCPP يجب أن تعرض FI أقل. باستخدام نفس بروتوكول وضع العلامات كما هو موضح هنا ولكن مع حبات 8.6 ميكرومتر أو حبات 20 ميكرومتر (بدلا من حبات 10.6 ميكرومتر) ، وجدنا الانخفاض المتوقع في FI في حبات 8.6 ميكرومتر مقارنة بخرز 10.6 ميكرومتر (مقارنة الشكل 6D مع الشكل 6A). عرضت حبات 20 ميكرومتر FI خارج مقياس مقياس التدفق الخلوي الذي استخدمناه (البيانات غير معروضة) ، لكن هذه الخرزات الأكبر استقرت خارج المحلول بسرعة بعد ذلك ولم تتم متابعتها أكثر.

تم تطوير هذا البروتوكول لوضع العلامات على الخرز باستخدام TCPP لغرض الحصول على أداة تعويض موثوقة في تجارب قياس التدفق الخلوي حيث يتم استخدام TCPP لتسمية الخلايا. في الماضي ، استخدمنا خلايا A549 لهذا الغرض24 ، لكن إجراء وضع العلامات لم ينتج عنه دائما FI مرتفع. علاوة على ذلك ، لا يمكن استخدام الخلايا ، حتى بعد التثبيت ، لأكثر من 1 شهر. أدى بروتوكول وضع العلامات (10.6 ميكرومتر) على الخرز مع TCPP الموصوف هنا باستمرار إلى حبات ملطخة بألوان زاهية ، كما هو موضح في الشكل 1. علاوة على ذلك ، عندما تم اختبار نفس الخرزات التي تحمل علامة TCPP بواسطة قياس التدفق الخلوي بعد 300 يوم ، لم نلاحظ تغييرا كبيرا في MFI ولا في محتوى الجسيمات (الشكل 7). كان لاقتران TCPP بالخرز تأثير ضئيل على طيف انبعاث التألق (الشكل 8 أ ؛ مقارنة الخط الأسود المتقطع بالخط الأسود الصلب ، والذي يمثل طيف انبعاث التألق ل TCPP في المحلول). اختلف طيف الانبعاث الفلوري للخرز المسمى TCPP أكثر عن طيف TCPP المقاس داخل خلايا سرطان الرئة A549 ، خاصة حول الأطوال الموجية 700-725 نانومتر (الشكل 8A ؛ الخط الأسود المتقطع مقارنة بالخط البرتقالي ، على التوالي). ومع ذلك ، مع القدرة على تعويض إشارة TCPP من الإشارات الأخرى في عينة البلغم متعددة الفلوروفور ، عملت الخرزات التي تحمل علامة TCPP بشكل جيد على قدم المساواة مع خلايا A549 الملطخة ب TCPP (مقارنة الشكل 8B مع الشكل 8C ، على التوالي).

ال. يمكن العثور على ملفات LMD في مستودع FlowRepository (https://flowrepository.org) ، تحت معرفات FR-FCM-Z6ZP (الشكل 1) ؛ FR-FCM-Z5UJ (الشكل 3ب، ج)؛ المتطلب FR-FCM-Z6ZR (الشكل 4ب)؛ المتطلب FR-FCM-Z6ZS (الشكل 5ب)؛ المتطلب FR-FCM-Z6ZB (الشكل 6)؛ المتطلب FR-FCM-Z6Y5 (الشكل 8ب)؛ وFR-FCM-Z6ZT (الشكل 8C).

Figure 1
الشكل 1: فحص جودة الخرزات الموسومة ب TCPP . (أ) حبات قوس قزح. يظهر الرسم البياني لخرز قوس قزح كما تم اكتشافه في القناة الخاصة بفلوروفور APC. يمكن أيضا استخدام هذه القناة للكشف عن مضان TCPP. تعمل حبات قوس قزح كمراقبة الجودة لليزر APC. يجب أن تقع القمتان الأولى والرابعة في المنطقة المشار إليها بين قوسين معانين. (ب، د) حبات تحمل علامة TCPP. (ج، ه) حبات غير مصنفة. تضمنت هذه العينة الخاصة من محلول الخرزة المسمى TCPP 51.9٪ من الخرز (بوابة مستطيلة سوداء في B). تمثل الأحداث في المستطيل الأحمر الجسيمات التي تشكلت أثناء تسمية TCPP. كانت هذه الجسيمات غائبة في محلول الخرزة غير المسمى (مقارنة المستطيلات الحمراء في B و C). يتم عرض شدة التألق للخرز المسمى TCPP وغير المسمى في D و E ، على التوالي. الاختصارات: SSC = مبعثر جانبي ؛ FSC = مبعثر أمامي ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ TCPP = بورفين ميزو تيترا (4-كربوكسي فينيل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمثيل تخطيطي لطريقة ترشيح الخرزة المستخدمة في خطوات البروتوكول 9.3-9.12. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تأثيرات الترشيح على الجسيمات وشدة التألق. (أ) صور مجهرية لخرز 10 ميكرومتر موسومة ب TCPP قبل (الصورة اليسرى) وبعد الترشيح (الصورة اليمنى). تم التقاط الصور بتضخيم 20x. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) تضمن تعليق حبة TCPP قبل الترشيح (المظهر الجانبي الأيسر) 25.6٪ خرز (مستطيل أسود) و 65.7٪ حطام أو جسيمات (مستطيل أحمر). ارتفعت نسبة الخرزات في التعليق إلى 74.7٪ بعد الترشيح (المظهر الجانبي الأيمن ؛ المستطيل الأسود) ، وانخفض الحطام إلى 11.9٪. (ج) الرسوم البيانية ل TCPP FI للخرزات كما هو محدد في B. يمثل الرسم البياني الموجود على اليسار الخرزات التي تحمل علامة TCPP قبل الترشيح ، مع FI أعلى قليلا من الخرز بعد الترشيح (الرسم البياني على اليمين). الخطوط الحمراء ، الموضوعة عند FI من 1 × 103 في كلا الشكلين ، هي لتسهيل المقارنة بين كلا البيانين. الاختصارات: SSC = مبعثر جانبي ؛ FSC = مبعثر أمامي ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ TCPP = بورفين ميزو تيترا (4-كربوكسي فينيل) ؛ FI = شدة مضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: العلاقة بين نسبة EDC / TCPP ، ومتوسط شدة التألق (MFI) ، وتكوين الجسيمات. (أ) يتم تقديم العلاقة بين نسبة EDC / TCPP المستخدمة في بروتوكول وضع العلامات على الخرزة و MFI للخرزات التي تحمل علامة TCPP اللاحقة. يوضح المنحنى متوسط MFI لثلاث تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري (SD). يشير السهم الأحمر (3.75) إلى النسبة الحجمية لحلول EDC و TCPP المستخدمة في هذا البروتوكول. (ب) ملامح تشتت الضوء التمثيلية لمعلقات الخرز المحضرة بنسب EDC / TCPP كما هو موضح أعلاه كل ملف تعريف. جميع الملفات الشخصية مشتقة من نفس التجربة. يشار إلى الخرز بالمستطيل الأسود. يزداد تكوين الجسيمات ، المشار إليها بالمستطيلات الحمراء ، مع زيادة نسب EDC / TCPP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. العلاقة بين نسبة TCPP / الخرز ، MFI ، وتشكيل الجسيمات. (أ) يتم تقديم العلاقة بين النسبة الحجمية TCPP / الخرز المستخدمة في بروتوكول وضع العلامات على الخرزة و MFI للخرزات التي تحمل علامة TCPP اللاحقة. يزداد مؤشر MFI بسرعة ، ليصل إلى مرحلة الاستقرار بعد نسبة TCPP / الخرز 2. يوضح المنحنى متوسط MFI لثلاث تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري (SD). يشير السهم الأحمر (4.17) إلى النسبة المستخدمة في هذا البروتوكول. (ب) ملامح تشتت الضوء التمثيلية لمعلقات الخرز المحضرة بنسب TCCP/الخرز كما هو موضح أعلاه كل ملف. جميع الملفات الشخصية مشتقة من نفس التجربة. يشار إلى الخرز بالمستطيلات السوداء. يزداد تكوين الجسيمات ، المشار إليها بالمستطيلات الحمراء ، مع زيادة نسب TCPP / bead. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين طرق الاقتران وأحجام الخرز المستخدمة. تظهر الرسوم البيانية لشدة مضان الخرز المسمى TCPP. (أ) تم تمييز حبات 10.6 ميكرومتر وفقا للبروتوكول المقدم ، بما في ذلك استخدام كاشف التوصيل EDC. (ب) نفس (أ) ، ولكن تم حذف EDC أثناء بروتوكول وضع العلامات. (ج) تم تمييز حبات 10.6 ميكرومتر باستخدام إستر NHS ، وفقا للطريقة التي وصفها Kabe et al.23. (د) مثل (أ)، ولكن بدلا من حبات 10.6 ميكرومتر، استخدمت حبات 8.6 ميكرومتر. يتم تعيين الخطوط الحمراء الرأسية في كل ملف تعريف بشكل تعسفي عند 1 × 103 لتسهيل المقارنات بين الرسوم البيانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استقرار حبات TCPP بمرور الوقت. تم تصنيف الخرز المسمى TCPP (10 ميكرومتر) وفقا للبروتوكول ، وتخزينها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية ، وحفظها في الظلام. اليوم 0 هو يوم وضع العلامات. في نقاط زمنية مختلفة بعد ذلك ، تم إعادة تحليل حصص الخرز المخزن عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تقديم قياسات (A) MFI و (B) النسبة المئوية للجسيمات بالنسبة لقيمة اليوم 0 ، والتي تم تعيينها بشكل تعسفي عند 100٪. تمثل الخطوط البرتقالية الأفقية القيم 10٪ أعلى و 10٪ أقل من تلك الموجودة في اليوم 0. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: حبات TCPP مقارنة بالخلايا الملطخة ب TCPP كأدوات تعويض . (أ) تم قياس أطياف الانبعاث الفلوري ل TCCP في المحلول ، TCPP المقترن بالخرز ، و TCPP بعد تلطيخ خلايا سرطان الرئة A549 على قارئ الصفائح الدقيقة. أطياف انبعاث TCPP القابلة للذوبان والمرتبطة بالخرز متشابهة جدا. كلاهما يختلف عن خلايا A549 المسماة حول الطول الموجي 700 نانومتر. (ب ، ج). تمت معالجة عينة البلغم في خلايا مفردة وتم تمييزها بفلوروفورات متعددة: AF488 (FL1) و BV510 (FL10) و PE (FL2) و PE-CF594 (FL3) و TCPP (FL6). لكل فلوروفور ، قمنا بإعداد أنابيب تحكم أحادية اللون تحتوي على خرز مقترن بالفلوروفور ذي الصلة. بالنسبة ل TCPP ، تم إعداد أنبوبي تحكم: أحدهما بخرز يحمل علامة TCPP والآخر بخلايا A549 ثابتة تحمل علامة TCPP. سمح لنا ذلك بإنشاء مصفوفتين للتعويض: (B) واحدة تم فيها استخدام الخرزات التي تحمل علامة TCPP كعنصر تحكم في التعويض ل TCPP (FL-6) و (C) واحدة تم فيها استخدام خلايا A549 التي تحمل علامة TCPP. هذان المصفوفتان للتعويض متشابهتان للغاية ، مع وجود أكبر فرق في التعويض المرتبط ب TCPP بين TCPP (FL6) و FL-3. تظهر المخططات النقطية المصاحبة التي تعرض هذه المعلمات المعينة ملفات تعريف شبه متطابقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الكواشف المطلوبة لحل مخزون TCPP. تعتمد كميات NaHCO3 والمياه النقية والأيزوبروبانول (IPA) على كمية TCPP التي تم وزنها في الخطوة 1.1 (بين 49.0 مجم و 50.9 مجم). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من التطبيقات العديدة للبورفيرينات في تشخيص السرطان وعلاجاته2 ، إلا أن هناك أدبيات محدودة حول استخدامها المحتمل ككاشف لقياس التدفق الخلوي لتحديد مجموعات الخلايا السرطانية مقابل غير السرطانية في الأنسجة البشرية الأولية24،25،26. يتطلب بحثنا حول تحليل التدفق الخلوي للبلغم البشري24,27 تلطيخ خلايا البلغم المنفصلة باستخدام TCPP والعديد من الفلوروفورات الأخرى. ومع ذلك ، فإن انتشار التألق ل TCPP في قنوات الكشف المخصصة للفلوروفورات الأخرى يعني أن هناك حاجة إلى حبة تحمل علامة TCPP كعنصر تحكم في التعويض. ومع ذلك ، لم تكن هذه الخرزة متاحة تجاريا وكان لا بد من تطويرها. تم الإبلاغ عن ارتباط البورفيرينات رباعي الأريل بالمناخل الجزيئية القائمة على ثاني أكسيد السيليكون28,29. ومع ذلك ، أثبتت الجسيمات القائمة على ثاني أكسيد السيليكون أنها غير مناسبة لغرض إعداد معايير قياس التدفق الخلوي (البيانات غير معروضة). لذلك ، ركزت دراساتنا على حبات البوليسترين.

وصف محلول TCPP في ماء الأيزوبروبانول (1: 1 فولت / ت)30 حبات البوليسترين عند الرقم الهيدروجيني 6 ، لكن MFI كان منخفضا جدا بالنسبة للخلايا الملطخة في فحصنا. استكشفنا تعديل الخرزة التساهمية كطريقة لزيادة MFI. تم وصف التعديل التساهمي لخرز اللاتكس الوظيفي بالأمين مع إستر NHS ل TCPP من خلال التوسط بواسطة Kabe et al.23 باستخدام حبات غير تجارية قطرها 2 ميكرومتر31. في الدراسة التي أجراها Kabe et al.23 ، تم تحضين TCPP في DMF مع N-hydroxysuccinimide (NHS) 32 لمدة 5 ساعات لإعداد إستر أحادي NHS منشط من TCPP. تفاعل محلول الإستر المنشط هذا بعد ذلك مع حبات تحتوي على رابط أمين طرفي. ومع ذلك ، عندما طبقنا هذا البروتوكول على حبات البوليسترين التجارية التي تعمل بالأمين ، أدى وضع العلامات إلى حبات ذات MFI غير ساطعة بما يكفي للتعويض. لذلك ، استكشفنا التوسط المباشر لخرز البوليسترين الأمين دون استخدام وسيط إستر NHS.

في هذا العمل ، تمت معالجة حبات البوليسترين الوظيفية بالأمين باستخدام TCPP في وجود كاشف اقتران الأميد EDC لتوليد روابط أميد بين المجموعات الأمينية على الخرز ومجموعات الكربوكسي على TCPP. تم اختيار EDC بسبب قابليته للذوبان المائي ، وفائدته المثبتة في تفاعلات التوسط المائية على نطاق واسع من الأس الهيدروجيني ، والتكلفة المنخفضة ، والقابلة للذوبان في الماء بواسطة المنتجات33,34. تفاعلنا مع حبات البوليسترين الأمين بأقطار 8.6 ميكرومتر و 10.6 ميكرومتر و 20 ميكرومتر مع TCPP و EDC في الماء عند الرقم الهيدروجيني 6. أشارت الدراسات السابقة إلى أن TCPP لا يزال قابلا للذوبان عند هذا الرقم الهيدروجيني ، وهذا الرقم الهيدروجيني متوافق أيضا مع EDC33. أدت حبات 8.6 ميكرومتر الموسومة إلى MFI الذي كان منخفضا جدا بالنسبة لفحصنا. كانت حبات 20 ميكرومتر تحتوي على MFI عالية بما فيه الكفاية ولكنها كانت عرضة للاستقرار من التعليق وانسداد مقياس التدفق الخلوي (غير معروض). تحتوي حبات 10.6 ميكرومتر على MFI مناسب ، وظلت معلقة لفترة كافية لتحليل قياس التدفق الخلوي ، وبالتالي تم تحسينها كمعايير تعويض. والجدير بالذكر أن الخرزات المكافئة غير المسماة كانت ذات مضان منخفض في الخلفية ويمكن استخدامها كخرز تحكم سلبي للتعويض.

أدت زيادة نسبة الكاشف الحجمي ل EDC إلى TCPP مع الحفاظ على كمية الخرزات ثابتة إلى زيادة MFI للخرزة حتى تم الوصول إلى هضبة بنسبة حوالي 2. كما لوحظت هضبة MFI حيث تم زيادة نسبة TCPP إلى الخرز مع الحفاظ على نسبة EDC إلى TCPP ثابتة. نظرا لأن TCPP قام بتسمية الخرز في غياب EDC ، فقد تكون هضبة MFI نتيجة لتشبع مواقع الربط التساهمية وغير التساهمية على سطح الخرزة. لوحظ منتج ثانوي للجسيمات المرتبطة ب TCPP عندما تم دمج EDC و TCPP عند الرقم الهيدروجيني 6. كان لهذه الجسيمات طيف مضان مشابه ل TCPP ولكنها لم تتشكل في غياب EDC ، مما يشير إلى أنه منتج ثانوي غير قابل للذوبان من تفاعل EDC مع TCPP. كانت الجسيمات غير منتظمة الشكل ، وعلى الرغم من أنها أصغر بشكل عام من 5 ميكرومتر ، إلا أنها يمكن أن تشكل مجاميع أكبر ويمكن أن تلتصق أيضا بسطح الخرز. كما لوحظت جسيمات مرتبطة ب TCPP عندما تفاعلت حبات البوليسترين الأمين مع TCPP و EDC. زادت كمية الجسيمات مع ارتفاع نسبة EDC إلى TCPP ونسبة TCPP إلى الخرز الأعلى. تعد نسب الكاشف المختارة في البروتوكول النهائي أساسية لنجاح إجراء وضع العلامات على الخرزة لأنها تضمن أن تعليق الخرزة الناتج يحتوي على MFI مرتفع بينما يظل مستوى الجسيمات مقبولا. لا يمنع مستوى الجسيمات المنتجة في هذا البروتوكول استخدام حبات TCPP للتعويض ، ولكن المستويات الأعلى من الجسيمات يمكن أن تعيق دقة إعدادات التعويض35. قمنا أيضا بتطوير إجراء ترشيح يمكن أن يقلل من مستوى الجسيمات بشكل كبير في حالة وجودها على مستوى عال.

أجرينا رد فعلنا باستخدام محرض دوار. يؤدي عدم إثارة التفاعل إلى تلطيخ أبطأ (البيانات غير معروضة). يوصى بوقت رد فعل 16 ساعة. تؤدي أوقات التفاعل الأطول (>24 ساعة) إلى مستويات أعلى من جسيمات TCPP ، بينما تؤدي أوقات التفاعل الأقصر (<8 ساعات) إلى انخفاض MFI الخرزة. بالنسبة للتحكم في الخرزة غير المسماة ، لم نستخدم حبات وظيفية أمينية لم يتم تمييزها ب TCPP لأن التألق الذاتي للخرزات غير الموسومة كان يتداخل مع حساب مصفوفات التعويض بشكل صحيح. بدلا من ذلك ، استخدمنا حبات البوليسترين غير الوظيفية المتشابهة في الصنع والحجم. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظنا بالخرز غير المسمى والمسمى TCPP في أنابيب منفصلة. مع وجود كلتا المجموعتين من الخرز في نفس الأنبوب ، لاحظنا بعض نقل TCPP إلى الخرزات غير المسماة (البيانات غير معروضة) ، مما تسبب في تحول يمين في MFI يحظر الحساب الصحيح لمصفوفة التعويض.

باختصار ، النقاط الحرجة لتحقيق MFI عالية للخرز المسمى TCPP هي نسب الكاشف المستخدمة أثناء تفاعل التلوين ، ووقت تفاعل التلوين ، وقطر الخرزات غير المصنفة. في هذا العمل ، قدم البروتوكول الموصوف أعلاه حبات ملطخة ب TCPP تم حجمها بشكل مناسب للاستخدام في مقياس التدفق الخلوي وكانت فلورية بما يكفي للتعويض. لم تفقد الخرزات الملطخة ب TCPP MFI كبيرة عند 4 درجات مئوية لمدة 300 يوم. كان طيف مضان حبات TCPP مشابها للطيف TCPP في المحلول. علاوة على ذلك ، فإن مصفوفات التعويض المحسوبة باستخدام حبات تحمل علامة TCPP وخلايا A549 الملطخة ولدت ملفات تعريف بلغم متطابقة تقريبا في فحصنا ، مما يدل على فائدة هذه الخرزات.

يصف هذا البروتوكول إعداد حبات تعويض TCPP التي كانت مفيدة على أداة Navios EX ، ولكن قد لا تعمل هذه الخرزات نفسها على أداة مختلفة بحساسية مختلفة36 وتكوين كاشف مختلف20. ومع ذلك ، يقترح هذا العمل طرقا لتعديل التألق من خلال حجم الخرزة ونسبة الكاشف. TCPP هو واحد فقط من العديد من البورفيرينات الفلورية التي أظهرت انتقائية الخلايا السرطانية في المختبر وفي الجسم الحي2،37،38،39. قد لا ترتبط جميع البورفيرينات الفلورية بخرز البوليسترين الذي يعمل بالأمين المستخدم في هذا البروتوكول. في الواقع ، يقتصر استخدام هذه الخرزات على البورفيرينات التي تحتوي على حمض كربوكسيلي. قد يؤدي التلوين التفاضلي لمجموعات الخلايا المتنوعة في عينات الأنسجة البشرية باستخدام البورفيرينات ، كما تم قياسه بواسطة قياس التدفق الخلوي ، إلى إلقاء نظرة ثاقبة على التطور المبكر للسرطان وتطوره وتشخيصه. يعد استخدام البورفيرينات الأخرى لتلطيخ عينات الأنسجة البشرية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام حبات التحكم المناسبة كمعايير تعويض ، اتجاها جذابا لمزيد من البحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين هم موظفون في تقنيات التقارب الحيوي.

Acknowledgments

نود أن نشكر ديفيد رودريغيز على المساعدة في إعداد الشكل وخدمات علم الأمراض الدقيقة (سان أنطونيو ، تكساس) لاستخدام مقياس التدفق الخلوي Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ، قياس التدفق الخلوي ، التحكم في التعويض ، الفلوروفور ، وضع العلامات ، حبات الأمين الوظيفية ، التوسط ، البورفيرين
حبات معدلة بالبورفيرين لاستخدامها كضوابط تعويض في قياس التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter