Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

הפרוטוקול מתאר כיצד חרוזי פיצוי מבוססי פורפירין עבור ציטומטריית זרימה מוכנים על ידי התגובה של חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמין עם TCPP פורפירין ומגיב צימוד אמיד EDC. הליך סינון משמש כדי להפחית את תוצרי הלוואי של החלקיקים.

Abstract

ציטומטריית זרימה יכולה לאפיין ולכמת במהירות אוכלוסיות תאים מגוונות בהתבסס על מדידות פלואורסצנטיות. התאים מוכתמים תחילה בריאגנטים פלואורסצנטיים אחד או יותר, כאשר כל אחד מהם מתפקד עם מולקולה פלואורסצנטית אחרת (פלואורופור) הנקשרת לתאים באופן סלקטיבי בהתבסס על המאפיינים הפנוטיפיים שלהם, כגון ביטוי אנטיגן בפני השטח של התא. את עוצמת הפלואורסצנטיות מכל מגיב הקשור לתאים ניתן למדוד על ציטומטר הזרימה באמצעות ערוצים המזהים טווח מוגדר של אורכי גל. כאשר משתמשים בפלואורופורים מרובים, האור מפלואורופורים בודדים גולש לעתים קרובות לתעלות גילוי לא רצויות, מה שדורש תיקון לנתוני עוצמת הפלואורסצנטיות בתהליך שנקרא פיצוי.

חלקיקי בקרת פיצוי, בדרך כלל חרוזי פולימר הקשורים לפלואורופור יחיד, נדרשים עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי תיוג תאים. נתונים מחלקיקי פיצוי מציטומטר הזרימה משמשים ליישום תיקון למדידות עוצמת הפלואורסצנטיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה וטיהור של חרוזי פיצוי פוליסטירן המתפקדים באופן קוולנטי עם מגיב פלואורסצנטי מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין (TCPP) ויישומם בפיצוי ציטומטריית זרימה. בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו באמצעות TCPP ומגיב צימוד אמיד EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) ב- pH 6 ובטמפרטורת החדר במשך 16 שעות עם תסיסה. חרוזי TCPP בודדו על ידי צנטריפוגה והושעו מחדש במאגר pH 7 לאחסון. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו כתוצר לוואי. ניתן להפחית את מספר החלקיקים הללו באמצעות פרוטוקול סינון אופציונלי. חרוזי TCPP שהתקבלו שימשו בהצלחה על ציטומטר זרימה לפיצוי בניסויים עם תאי כיח אנושיים שסומנו עם פלואורופורים מרובים. חרוזי TCPP הוכחו כיציבים לאחר אחסון במקרר במשך 300 יום.

Introduction

פורפירינים היו בעלי עניין במשך שנים רבות בתחום הביו-רפואי בשל תכונותיהם הפלואורסצנטיות וממוקדות הגידול 1,2,3. יישומים טיפוליים כגון טיפול פוטודינמי (PDT) וטיפול סונודינמי (SDT) כרוכים במתן סיסטמי של פורפירין לחולה סרטן, הצטברות התרופה בגידול וחשיפה מקומית של הגידול לאור לייזר באורך גל מסוים או אולטרסאונד. החשיפה לאור לייזר או אולטרסאונד מובילה ליצירת מיני חמצן תגובתי על ידי הפורפירין ולאחר מכן למוות תאי 4,5. באבחון פוטודינמי (PDD), פורפירין פלואורסצנטי משמש להבדיל בין תאים סרטניים לתאים נורמליים6. בהקשר זה, פרוטופורפירין IX, פורפירין פלואורסצנטי טבעי המצטבר בגידולים עם הזרקה מערכתית או מקומית של קודמו, חומצה 5-אמינולבולינית (5-ALA), משמש לזיהוי גידולי סטרומה במערכת העיכול, סרטן שלפוחית השתן וסרטן המוח 7,8. לאחרונה, טיפול 5-ALA נחקר כגישה לאיתור מחלה שיורית מינימלית במיאלומה נפוצה9. המעבדה שלנו השתמשה בטטראריל פורפירין TCPP (5,10,15,20-טטרקיס-(4-קרבוקסיפניל)-21,23 H-פורפין) בשל יכולתו להכתים באופן סלקטיבי תאי סרטן ריאה ותאים הקשורים לסרטן בדגימות כיח אנושיות, תכונה שנוצלה בבדיקות אבחון ציטומטריות מבוססות שקופיות וזרימה10.

חלק מהפורפירינים הם דו-תפקודיים בכך שהם יכולים לשמש כסוכנים טיפוליים ואבחוניים 2,11. במחקר ביו-רפואי, פורפירינים דו-תפקודיים כאלה משמשים כדי להעריך כיצד יכולתם להתמקד באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים היא פונקציה של המבנה שלהם, כמו גם כיצד הוא מושפע מנוכחותן של תרכובות אחרות 12,13,14,15,16. ניתן למדוד הן את ספיגת התאים של פורפירינים והן את ציטוטוקסיות שלהם על פלטפורמה ציטומטרית של זרימה באופן בתפוקה גבוהה. ספקטרום הספיגה והפליטה של פורפירינים פלואורסצנטיים הוא מורכב, אך רוב הפלטפורמות הציטומטריות של הזרימה מצוידות כדי לזהות אותן נכון. ספקטרום הספיגה של פורפירינים פלואורסצנטיים מאופיין ברצועת ספיגה חזקה בתחום 380-500 ננומטר, המכונה רצועת סורט. שתיים עד ארבע רצועות ספיגה חלשות יותר נצפות בדרך כלל בתחום התדרים 500-750 ננומטר (Q)17. לייזר כחול של 488 ננומטר, שנמצא ברוב הציטומטרים של זרימה, או לייזר סגול (405 ננומטר) יכולים להפיק אור באורך הגל המתאים כדי לעורר פורפירינים. ספקטרום הפליטה של פורפירינים מציג בדרך כלל שיאים בטווח של 600-800 ננומטר18, מה שמביא לחפיפה ספקטרלית מועטה מאוד עם פלואורוסצאין איזותיוציאנט או פיקואריתרין (PE) פלואורופורים, אך חפיפה ניכרת עם פלואורופורים אחרים הנמצאים בשימוש לעתים קרובות, כגון אלופיקוציאנין (APC), כמו גם פלואורופורים טנדם, כגון PE-Cy5 ואחרים. לכן, בעת שימוש בפורפירינים במבחני ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, בקרות פלואורופור יחיד חיוניות כדי לתקן כראוי את זליגת הפלואורסצנטיות בתעלות אחרות מזו המיועדת למדוד את הפלואורסצנטיות של הפורפירין.

באופן אידיאלי, פקדי הפלואורופורים היחידים המשמשים לחישוב מטריצת הזליגה עבור פאנל של פלואורופורים (הנקראים גם "בקרות פיצוי") צריכים להיות מורכבים מאותם סוגי תאים כמו הדגימה. עם זאת, שימוש במדגם למטרה זו אינו אופטימלי אם יש מדגם קטן מאוד מלכתחילה או אם אוכלוסיית היעד בתוך המדגם קטנה מאוד (למשל, אם רוצים להסתכל על מחלה שיורית מינימלית או תאים סרטניים בשלבים המוקדמים של המחלה). חלופה שימושית לתאים היא חרוזים יחד עם אותו פלואורופור המשמש לניתוח הדגימה. חרוזים רבים כאלה זמינים מסחרית; חרוזים אלה מסומנים מראש עם הפלואורופור הרצוי (חרוזים ספציפיים לפלואורופור מסומנים מראש)19,20, או שניתן להצמיד להם נוגדן מסומן פלואורסצנטית (חרוזי לכידת נוגדנים)20,21. בעוד חרוזי פיצוי מסחריים זמינים עבור פלואורופורים רבים, חרוזים כאלה אינם זמינים עבור פורפירינים, למרות השימוש הגובר בהם במחקר בסיסי וקליני.

בנוסף לשימור הדגימות ולגודל מתאים של אוכלוסיות חיוביות לעומת שליליות, היתרונות האחרים של שימוש בחרוזים כבקרות פיצוי הם קלות ההכנה, פלואורסצנטיות רקע נמוכה ויציבות מעולה לאורך זמן22. החיסרון הפוטנציאלי של שימוש בחרוזים כבקרת פיצוי הוא שספקטרום הפליטה של הנוגדן הפלואורסצנטי שנלכד על חרוזים עשוי להיות שונה מזה של אותו נוגדן המשמש לסימון התאים. זה עשוי להיות בעל חשיבות ספציפית בעת שימוש בציטומטר זרימה ספקטרלית20. לכן, פיתוח חרוזים כבקרת פיצוי צריך להתבצע על ציטומטר הזרימה שישמש לבדיקה שעבורה מפותחים החרוזים. יתר על כן, התפתחות החרוזים צריכה לכלול השוואה עם תאים המסומנים באותו מגיב צביעה פלואורסצנטי.

כאן, אנו מתארים את ההכנה של חרוזי פיצוי פוליסטירן פונקציונליים TCPP, שעוצמת הפלואורסצנטיות החציונית שלהם בתעלת הגילוי הייתה דומה לזו של תאים המסומנים ב- TCPP בכיח, והשימוש בהם כבקרות פיצוי עבור ציטומטריית זרימה. האוטופלואורסצנטיות של חרוזים שווי ערך, לא פונקציונליים, הייתה נמוכה מספיק לשימוש בהם כבקרות פיצוי פלואורסצנטיות שליליות. בנוסף, חרוזים אלה הפגינו יציבות באחסון במשך כמעט שנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים צריכים להיעשות באמצעות ציוד מגן אישי מתאים.

1. הכנת תמיסת מלאי TCPP, 1.0 מ"ג / מ"ל

הערה: ניתן להכין זאת אחת לחודש.

  1. בעזרת איזון אנליטי, מרית ונייר שקילה, שוקלים 49.0-50.9 מ"ג TCPP. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם. הניחו בצד את הכמות הנמדדת של TCPP המוגנת מפני אור.
    הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.
  2. קבע את הכמויות הנדרשות של מים מטוהרים ואיזופרופנול (IPA) מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1. הוסיפו את המים המטוהרים והאיזופרופנול לכוס זכוכית בנפח 100 מ"ל, וכסו בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.
  3. קבע את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט מטבלה 1 בהתבסס על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1.
  4. באמצעות האיזון האנליטי, המרית ונייר השקילה, לשקול את הכמות הנדרשת של סודיום ביקרבונט שנקבעה בשלב 1.3. עיגלו את המשקולת ל-1/10 מיליגרם.
    הערה: השתמש באקדח סטטי אם קריאת המשקל אינה יציבה.
  5. הוסף את סודיום ביקרבונט לכוס 100 מ"ל המכילה מים מטוהרים ואיזופרופנול. כסו את התמיסה בפרפילם כדי להגן מפני אידוי.
  6. מניחים את התמיסה משלב 1.5 על צלחת ערבוב, ומערבבים עד להמסה (כ-10 דקות)
  7. למדוד את ה- pH כדי להבטיח כי תמיסה המכילה סודיום ביקרבונט משלב 1.6 יש pH בין 9 ל 10.
  8. הוסיפו באיטיות את TCPP במשקל שלב 1.1 לתמיסה משלב 1.7, והמשיכו לערבב עד להמסה (~30 דקות). יש להגן מפני אור במהלך שלב זה.
  9. יש לאחסן במיכל זכוכית או פוליפרופילן בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור.

2. הכנת 2-(N -morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) ותמיסת חיץ מלח המיסודיום, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("מאגר MES")

הערה: יש להכין אותו ביום השימוש ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.

  1. שקלו 2.50 גרם מלח המיסודיום MES, והוסיפו אותו לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.
  2. מוסיפים 121 מ"ל מים מטוהרים, וממיסים על ידי ניעור ידני עד שלא נראה מוצק.
  3. מדוד את ה- pH של מאגר MES כדי לוודא שהוא בין 6 ל- 6.2.
  4. יש לשמור בטמפרטורת החדר לשימוש באותו היום.

3. אבקת N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC)

  1. הוציאו את אבקת ה-EDC מהמקפיא והניחו לה לשבת בטמפרטורת החדר עד לשימוש בשלב 5.

4. שילוב חרוזי פוליסטירן פונקציונליים עם תמיסת TCPP

  1. הוסף 4.3 מ"ל של תמיסת חיץ MES 0.1 M שהוכנה בשלב 2 לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
  2. מערבול את מתלה חרוזי הפוליסטירן המתפקד על ידי אמין (10 מיקרומטר, 2.5% w/v) למשך 60 שניות במהירות מרבית.
  3. הוסף 288 μL של מתלה חרוזים טרי זה למאגר MES משלב 4.1.
  4. מערבול את פתרון MES/חרוז למשך 15 שניות במהירות מרבית.
  5. מערבול את פתרון TCPP 1 מ"ג/מ"ל שהוכן בשלב 1 עבור 60 שניות במהירות מרבית.
  6. הוסף 1.20 מ"ל של פתרון מניות TCPP טרי זה להשעיית MES/חרוזים משלב 4.4.
  7. סובב את מתלי MES/חרוז/TCPP למשך 15 שניות במהירות מרבית.
  8. מכסים את הצינור בנייר כסף בזמן שתמיסת EDC מוכנה.

5. הכנת תמיסת מלאי N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl)

הערה: תמיסת EDC מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.

  1. הוסף 20.0 מ"ל מים מטוהרים לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
  2. שקלו 200 מ"ג של EDC HCl משלב 3, והוסיפו אותו למים (שלב 5.1).
  3. מערבול את EDC HCL במשך 15 שניות במהירות מקסימלית כדי ליצור פתרון ברור.

6. הכנת פתרון העבודה EDC HCl/MES

הערה: תמיסת EDC HCl/MES מתכלה ויש להשתמש בה מיד לאחר ההכנה.

  1. הוסף 54.0 מ"ל של תמיסת חיץ MES (שהוכנה בשלב 2) לבקבוק פלסטיק של 150 מ"ל.
  2. הוסף 6.0 מ"ל של תמיסת מלאי EDC HCl (שהוכנה בשלב 5) לתמיסת מאגר MES, וערבב על-ידי ניעור במשך 10 שניות.

7. תיוג החרוזים עם TCPP

  1. הוסף 4.5 מ"ל של פתרון עבודה EDC (משלב 6) לצינור פוליפרופילן 15 מ"ל המכיל את החרוזים ו- TCPP במאגר MES (שלב 4.7).
  2. הניחו את הצינור במסובב הפוך במהירות 35 סל"ד למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר ומוגנים מפני אור.
  3. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם.
  4. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את החרוזים ב-0.8 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).
  5. מעבירים את תמיסת החרוזים לבקבוקון פוליפרופילן ענברי עם פיפטה של 1 מ"ל, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
    הערה: החרוזים יציבים לפחות 3 חודשים בשלב זה.

8. בדיקת איכות (QC) של חרוזי TCPP לפי ציטומטריית זרימה

הערה: ה- QC צריך להיות מרוכז בשאלה אם עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של חרוזי TCPP בהירה מספיק לשימוש המיועד שלהם וכמות החלקיקים הנוצרים על ידי ההליך. עיין בסעיף התוצאות המייצגות לקבלת פרטים נוספים.

  1. תייגו צינור פוליסטירן אחד בנפח 5 מ"ל כ"חרוזים שליליים TCPP".
    הערה: החרוזים השליליים שונים מהחרוזים הפונקציונליים המשמשים לתיוג. ראה טבלת חומרים.
  2. תייגו צינור אחר כ"חרוזים חיוביים TCPP".
  3. תייגו צינור אחר כ"חרוזי קשת".
  4. Aliquot 300 μL של HBSS קר כקרח לתוך צינורות המסומנים עם "חרוזים שליליים TCPP" ו "חרוזים חיוביים TCPP".
  5. הוסיפו 500 μL של HBSS קר כקרח לצינור המסומן כ"חרוזי קשת".
  6. מערבלים את מתלה החרוזים הלא פונקציונלי מפוליסטירן (ללא תווית) לזמן קצר במהירות מרבית (2-3 שניות), ומוסיפים 10 מיקרוליטר ממנו לצינור המסומן "חרוזים שליליים TCPP".
  7. מערבלים את מתלה החרוזים המסומן ב-TCPP (מסתיים בשלב 7.5) לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים 3 μL ממנו לצינור "TCPP positive beads".
  8. מערבבים את מתלה חרוזי הקשת לזמן קצר במהירות מרבית, ומוסיפים שתי טיפות ממנו לצינור "חרוזי הקשת".
  9. יש לשמור את כל הצינורות על קרח, מכוסים ומוגנים מפני אור.
  10. התחל את הליכי ההפעלה היומיים המתאימים של ציטומטר הזרימה, ובצע QC כדי לוודא את יישור הנוזלים והלייזר האופטימליים.
    הערה: עבור חלק זה של הפרוטוקול, ההנחה היא כי המפעיל מאומן בשימוש בציטומטר הזרימה הזמין, כולל הליכי סטנדרטיזציה של פיזור האור ועוצמת הפלואורסצנטיות, כמו גם את העקרונות הבסיסיים של חישוב מטריצת הפיצוי הנכונה.
  11. הפעל את חרוזי הקשת ואת חרוזי TCPP מבלי לשנות את הגדרות המתח בין הריצות השונות.
    1. הפעל ואסוף 10,000 אירועים של חרוזי הקשת.
    2. בצע שטיפה במים, ואסוף 10,000 אירועים של חרוזים שליליים TCPP.
    3. בצעו שטיפה במים, ואספו 10,000 אירועים של חרוזים חיוביים ל-TCPP.
    4. יש לבצע שטיפה במים במשך דקה.
      הערה: חשוב לבצע שטיפה במים לאחר הפעלת חרוזי TCPP. אם TCPP אינו נשטף מהקווים בציטומטר, קיימת אפשרות ש- TCPP שיורי יכול לסמן תאים בצינור הבא שיירכש.
    5. בצע את פרוטוקולי הניקוי והכיבוי המתאימים הספציפיים להוראות היצרן עבור הציטומטר.
      הערה: לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 1.

9. סינון חרוזים

הערה: אם ה-QC של החרוזים לפי ציטומטריית זרימה (שלב 8) מראה שיעור גבוה של חלקיקים (70% ומעלה), שקול לסנן את תרחיף החרוזים באמצעות הפרוטוקול שלהלן (איור 2).

  1. הוסף 3.20 מ"ל של HBSS קר כקרח ל- 0.8 מ"ל של מתלה חרוזי TCPP שהושלם בשלב 7.5 (יצירת דילול פי חמישה).
  2. מערבלים את מתלה החרוזים המדולל במהירות מרבית למשך 15 שניות.
  3. מוציאים את הבוכנה ממזרק חד פעמי של 5 מ"ל.
  4. התאימו את המזרק לפילטר קצה סיבי זכוכית (5 מיקרומטר, קוטר 13 מ"מ).
  5. הוסף 4 מ"ל של HBSS למזרק.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של תרחיף חרוזים מדולל מערבול (שלב 9.2).
  7. השתמש בבוכנה כדי לסנן את המתלה דרך מערך המזרק/מסנן במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.
  8. שטפו את החרוזים על ידי שאיבת 5 מ"ל HBSS טרי לתוך המזרק דרך הפילטר בערך 2 טיפות לשנייה.
  9. דחפו שוב את ה-HBSS החוצה לתוך מיכל האשפה במהירות של כ-2 טיפות לשנייה.
  10. כדי להסיר את החרוזים מהמסנן, ציירו עוד 5 מ"ל של HBSS טרי לתוך המזרק דרך המסנן.
  11. הסר בזהירות את המסנן מהמזרק.
  12. מוציאים את מתלה החרוזים מהמזרק לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
  13. החזירו את הפילטר למזרק וחזרו על שלבים 9.10-9.12 ארבע פעמים נוספות. לאחר מכן השליכו את המסנן והמזרק.
  14. חזור על שלבים 9.2-9.13 עד שכל החרוזים משלב 9.1 יסוננו. השתמשו במזרק טרי וסננו בכל פעם.
  15. צנטריפוגו את מתלי החרוזים המסוננים למשך 10 דקות ב-1,000 × גרם בטמפרטורת החדר.
  16. שאפו את הסופרנאטנט של כל צינור 50 מ"ל, והשעו מחדש בעדינות את החרוזים, ומשלבים אותם ב 0.5 מ"ל של HBSS טרי.
  17. מעבירים את החרוזים עם מיקרופיפטה p1,000 לבקבוקון ענבר, זכוכית או פוליפרופילן חדש, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
  18. חזור על שלב 8 כדי לקבוע אם שיעור החלקיקים הקשורים ל- TCPP במתלה החרוזים המסונן פחת. לקבלת תוצאות מייצגות, ראה איור 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה לסימון TCPP של חרוזים הוא מהיר ויעיל יחסית. איור 1 מראה תוצאה מייצגת של תהליך תיוג חרוזי TCPP כפי שנקבע על-ידי ציטומטריית זרימה. איור 1A מראה את הפרופיל הסטנדרטי של חרוזי הקשת, כפי שהוא מזוהה בערוץ המתאים לזיהוי TCPP. חרוזים אלה משמשים כ-QC לסטנדרטיזציה של מתחי הלייזר לגילוי TCPP על ידי ציטומטר הזרימה. איור 1B מראה את פרופיל פיזור האור של פוליסטירן מתפקד אמין, חרוזים המסומנים בתווית TCPP. איור 1C מראה את פרופיל פיזור האור של חרוזים לא פונקציונליים (חרוזים ללא תווית); אנו משתמשים בהם כבקרת חרוזים שלילית כדי לחשב את מטריצת הפיצוי. האוכלוסייה המצוינת על ידי המלבן האדום, אשר נעדר בתרחיף החרוזים ללא תווית, מייצגת את החלקיקים הקשורים ל- TCPP הנוצרים כאשר TCPP נחשף למגיב הצימוד EDC. יש להוציא אגרגטים כאלה כאשר נקבעת עוצמת הפלואורסצנטיות (FI) של החרוזים. איור 1D מראה את ה-FI של החרוזים המסומנים, שנבחר על-ידי השער השחור באיור 1B, שהוא בבירור כמה בולי עץ גבוהים יותר מה-FI של החרוזים הלא מסומנים (ללא תווית) (בהשוואה לאיור 1D לאיור 1E).

שיעור החלקיקים (כלומר, האירועים שצוינו על-ידי השער האדום באיור 1B) עשוי להשתנות בכל אצוות תיוג. עבור רוב יישומי הציטומטריה הסטנדרטיים של זרימה, תרחיף חרוזים עם 50% חלקיקים או פחות מאפשר להגדיר פיצוי נכון בניסוי ציטומטריית זרימה מרובת צבעים באמצעות TCPP. עם זאת, ישנם יישומים, למשל, שבהם נעשה שימוש בניתוח נתונים אוטומטי, שעבורם תוכן חלקיקים גבוה בהרבה עלול להפריע להגדרות פיצוי נאותות. במקרים כאלה, מומלץ לבצע סינון (פרוטוקול שלב 9 ואיור 2). איור 3 מראה את השפעת הסינון על תרחיף החרוזים שכלל ~65% חלקיקים (פאנלים שמאליים באיור 3A,B). לאחר הסינון, תכולת החלקיקים ירדה ל~12%. ההשפעות השליליות של סינון הן אובדן מסוים של חרוזים (לא מוצגים) ואובדן קל של FI (איור 3C). השפעות אלה יש לקחת בחשבון כאשר סינון של השעיית החרוזים נשקל. חלופה לסינון חרוזים כדי להוריד את תכולת החלקיקים היא לשנות את היחס בין החרוזים, TCPP ומגיב הצימוד EDC. עם זאת, שינויים ביחסים אלה משפיעים גם על FI של החרוזים.

הקשר בין היווצרות חלקיקים, MFI, ויחס חרוזים/TCPP/EDC מודגם באיור 4 ובאיור 5. איור 4A ואיור 5A מראים את ה-MFI של החרוזים המסומנים כפונקציה של יחס EDC/TCPP ויחס TCPP/חרוז, בהתאמה. עם יחסים הולכים וגדלים, ה- MFI גדל עד שהוא מתייצב. הדוגמאות המייצגות באיור 4B ובאיור 5B מראות שתכולת החלקיקים עולה עם היחס העולה בהתאמה. פרוטוקול תיוג TCPP זה עבר אופטימיזציה עבור MFI מרבי תוך שמירה על תכולת חלקיקים נמוכה ככל האפשר (חצים באיור 4A ובאיור 5A). החלקיקים מופיעים רק כאשר EDC משמש כמגיב צימוד במהלך הליך התווית. באמצעות חרוזים ו-TCPP בלבד, חלקיקים אינם נוצרים (לא מוצגים), אולם התיוג של החרוזים יוצר חרוזים עם FI נמוך בהרבה (בהשוואה לאיור 6A עם איור 6B). ניסינו להחליף שיטת צימוד מבוססת EDC זו בשיטה המבוססת על אסטר NHS מופעל (N-hydroxysuccinimide) של TCPP23. עם זאת, לא מצאנו הבדל משמעותי ב-FI באמצעות שיטת הצימוד החלופית הזו בהשוואה לשימוש רק בחרוזים וב-TCPP יחד, מה שמרמז על כך שיש קשירה קוולנטית זניחה של TCPP לחרוזים בשיטה זו (בהשוואה לאיור 6B עם איור 6C).

הנתונים שהוצגו בכל הנתונים עד כה נאספו באמצעות חרוזים בקוטר 10.6 מיקרומטר. שיערנו כי לחרוזים גדולים יותר עשויים להיות יותר אתרי קישור TCPP בשל שטח הפנים המוגדל ולכן הם יכולים להציג FI גבוה יותר. לעומת זאת, שיערנו כי חרוזים קטנים יותר עם שטח פנים קטן יותר ופחות אתרי קישור TCPP צריכים להציג FI נמוך יותר. באמצעות אותו פרוטוקול תיוג כמתואר כאן אך עם חרוזים של 8.6 מיקרומטר או חרוזים של 20 מיקרומטר (במקום חרוזים של 10.6 מיקרומטר), מצאנו את הירידה הצפויה ב-FI בחרוזים של 8.6 מיקרומטר בהשוואה לחרוזים של 10.6 מיקרומטר (בהשוואה לאיור 6D עם איור 6A). החרוזים בגודל 20 מיקרומטר הציגו FI מחוץ לקנה המידה עבור ציטומטר הזרימה שבו השתמשנו (הנתונים לא מוצגים), אך חרוזים גדולים אלה שקעו מחוץ לתמיסה במהירות לאחר מכן ולא המשיכו הלאה.

פרוטוקול זה לתיוג חרוזים עם TCPP פותח במטרה ליצור כלי פיצוי אמין בניסויי ציטומטריית זרימה שבהם TCPP משמש לתיוג תאים. בעבר, השתמשנו בתאי A549 למטרה זו24, אך הליך ההתוויה לא תמיד הביא ל- FI גבוה. יתר על כן, התאים, גם לאחר קיבוע, לא יכול לשמש במשך יותר מחודש אחד. פרוטוקול התיוג (10.6 מיקרומטר) של חרוזים עם TCPP המתואר כאן הביא באופן עקבי לחרוזים מוכתמים בבהירות, כפי שניתן לראות באיור 1. יתר על כן, כאשר אותם חרוזים המסומנים ב-TCPP נבדקו על-ידי ציטומטריית זרימה לאחר 300 יום, לא ראינו שינוי משמעותי ב-MFI וגם לא בתכולת החלקיקים (איור 7). לצימוד TCPP לחרוזים הייתה השפעה מועטה בלבד על ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית שלו (איור 8A; השוואת הקו השחור המקווקו לקו השחור המוצק, המייצג את ספקטרום הפלואורסצנטיות של TCPP בתמיסה). ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של חרוזים המסומנים ב-TCPP היה שונה יותר מהספקטרום של TCPP שנמדד בתוך תאי סרטן ריאות A549, במיוחד סביב אורכי גל של 700-725 ננומטר (איור 8A; קו שחור מקווקו בהשוואה לקו הכתום, בהתאמה). עם זאת, עם היכולת לפצות את אות TCPP מהאותות האחרים בדגימת כיח מרובת פלואורופורים, החרוזים המסומנים ב-TCPP עבדו באותה מידה כמו תאי A549 המוכתמים ב-TCPP (בהשוואה לאיור 8B עם איור 8C, בהתאמה).

ה. ניתן למצוא קובצי LMD במאגר FlowRepository (https://flowrepository.org), תחת המזהים FR-FCM-Z6ZP (איור 1); FR-FCM-Z5UJ (איור 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (איור 4B); FR-FCM-Z6ZS (איור 5B); FR-FCM-Z6ZB (איור 6); FR-FCM-Z6Y5 (איור 8B); ו-FR-FCM-Z6ZT (איור 8C).

Figure 1
איור 1: בדיקת איכות של החרוזים המסומנים ב-TCPP. (A) חרוזי קשת. מוצג ההיסטוגרמה של חרוזי הקשת כפי שזוהתה בתעלה הספציפית לפלואורופור APC. ערוץ זה יכול לשמש גם כדי לזהות פלואורסצנטיות TCPP. חרוזי הקשת משמשים כ-QC ללייזר הנגמ"ש; הפסגות הראשונה והרביעית אמורות ליפול באזור המצוין בסוגריים המתאימים. (ב,ד) חרוזים עם תווית TCPP. (ג,ה) חרוזים ללא תווית. מדגם ספציפי זה של תמיסת חרוזים עם תווית TCPP כלל 51.9% חרוזים (שער מלבן שחור ב-B). האירועים במלבן האדום מייצגים את החלקיקים שנוצרו במהלך תיוג TCPP. חלקיקים כאלה נעדרו בתמיסת החרוזים הלא מסומנת (השוואת המלבנים האדומים ב-B וב-C). עוצמות הפלואורסצנטיות של החרוזים המסומנים ב-TCPP ושל חרוזים ללא תווית מוצגים ב-D וב-E, בהתאמה. קיצורים: SSC = פיזור צד; FSC = פיזור קדימה; APC = allophycocyanin; TCPP = מזו-טטרה (4-קרבוקסיפניל) פורפין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצוג סכמטי של שיטת סינון החרוזים המשמשת בשלבי פרוטוקול 9.3-9.12. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השפעות הסינון על חלקיקים ועל עוצמת הפלואורסצנטיות. (A) תמונות מיקרוסקופיות של חרוזים בגודל 10 מיקרומטר המסומנים ב-TCPP לפני (תמונה שמאלית) ואחרי סינון (תמונה ימנית). התמונות צולמו בהגברה של פי 20. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) תרחיף חרוזי TCPP לפני הסינון (פרופיל שמאלי) כלל 25.6% חרוזים (מלבן שחור) ו-65.7% פסולת או חלקיקים (מלבן אדום). שיעור החרוזים בתרחיף עלה ל-74.7% לאחר סינון (פרופיל ימני; מלבן שחור), והפסולת ירדה ל-11.9%. (C) היסטוגרמות של TCPP FI של החרוזים כפי שזוהו ב-B. ההיסטוגרמה משמאל מייצגת את החרוזים המסומנים ב-TCPP לפני הסינון, עם FI מעט גבוה מזה של החרוזים לאחר הסינון (היסטוגרמה מימין). הקווים האדומים, הממוקמים ב- FI של 1 × 103 בשני האיורים, נועדו להקל על ההשוואה בין שתי ההיסטוגרמות. קיצורים: SSC = פיזור צד; FSC = פיזור קדימה; APC = allophycocyanin; TCPP = meso-tetra (4-carboxyphenyl) פורפין; FI = עוצמת פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הקשר בין יחס EDC/TCPP, עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) והיווצרות חלקיקים. (A) מוצג הקשר בין יחס EDC/TCPP המשמש בפרוטוקול תיוג החרוזים לבין ה- MFI של החרוזים המסומנים ב- TCPP שבא בעקבותיו. העקומה מציגה את ממוצע ה-MFI של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן (SD). החץ האדום (3.75) מציין את היחס הנפחי של פתרונות EDC ו- TCPP המשמשים בפרוטוקול זה. (B) פרופילי פיזור אור מייצגים של מתלי החרוזים שהוכנו עם יחסי EDC/TCPP כמצוין לעיל בכל פרופיל. כל הפרופילים נגזרים מאותו ניסוי. החרוזים מסומנים על ידי המלבן השחור. היווצרות החלקיקים, המסומנת על ידי המלבנים האדומים, גדלה עם הגדלת יחסי EDC/TCPP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. הקשר בין יחס TCPP/חרוזים, MFI והיווצרות חלקיקים. (A) מוצג הקשר בין היחס הנפחי TCPP/חרוזים המשמש בפרוטוקול תיוג החרוזים לבין MFI של החרוזים המסומנים ב-TCPP שלאחר מכן. ה-MFI גדל במהירות, ומגיע לשלב מישורי לאחר יחס TCPP/חרוזים של 2. העקומה מציגה את ממוצע ה-MFI של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן (SD). החץ האדום (4.17) מציין את היחס המשמש בפרוטוקול זה. (B) פרופילי פיזור אור מייצגים של מתלי החרוזים שהוכנו עם יחסי TCCP/חרוזים כפי שמצוין מעל כל פרופיל. כל הפרופילים נגזרים מאותו ניסוי. החרוזים מסומנים על ידי המלבנים השחורים. היווצרות החלקיקים, המסומנת על ידי המלבנים האדומים, עולה עם הגדלת יחסי TCPP/חרוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: השוואה בין שיטות הצימוד וגדלי החרוזים שבהם נעשה שימוש. מוצגות היסטוגרמות של עוצמת הפלואורסצנטיות של החרוזים המסומנים ב-TCPP. (A) החרוזים בגודל 10.6 מיקרומטר סומנו בהתאם לפרוטוקול שסופק, לרבות השימוש בריאגנט הצימוד EDC. (B) זהה ל-(A), אך EDC הושמט במהלך פרוטוקול התיוג. (C) החרוזים בגודל 10.6 מיקרומטר סומנו באמצעות אסטר NHS, בהתאם לשיטה שתוארה על ידי Kabe et al.23. (D) זהה ל-(A), אך במקום חרוזים של 10.6 מיקרומטר, נעשה שימוש בחרוזים של 8.6 מיקרומטר. הקווים האדומים האנכיים בכל פרופיל נקבעים באופן שרירותי על 1 × 103 כדי להקל על ההשוואה בין ההיסטוגרמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: יציבות חרוזי TCPP לאורך זמן. חרוזים עם תווית TCPP (10 מיקרומטר) סומנו בהתאם לפרוטוקול, אוחסנו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ונשמרו בחושך. יום 0 הוא יום התיוג. בנקודות זמן שונות לאחר מכן, aliquots של החרוזים המאוחסנים נותחו מחדש על ידי ציטומטריית זרימה. מוצגות מדידות של (A) MFI ו- (B) אחוז חלקיקים ביחס לערך יום 0, אשר נקבע באופן שרירותי על 100%. הקווים הכתומים האופקיים מייצגים את הערכים 10% מעל ו- 10% מתחת לערכים ביום 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: חרוזי TCPP בהשוואה לתאים מוכתמים ב-TCPP ככלי פיצוי. (A) ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית של TCCP בתמיסה, TCPP המצומד לחרוזים ו-TCPP לאחר צביעת תאי סרטן הריאה A549 נמדדו על קורא מיקרו-צלחות. ספקטרום הפליטה של TCPP מסיס וקשור לחרוזים דומה מאוד. שניהם שונים מזה של תאי A549 המסומנים סביב אורך הגל של 700 ננומטר. (ב,ג). דגימת כיח עובדה לתאים בודדים ותויגה עם פלואורופורים מרובים: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) ו-TCPP (FL6). עבור כל פלואורופור הכנו שפופרות בקרה בצבע יחיד המכילות חרוזים יחד עם הפלואורופור הרלוונטי. עבור TCPP, הוגדרו שני צינורות בקרה: אחד עם חרוזים המסומנים בתווית TCPP ואחד עם תאי A549 קבועים המסומנים ב- TCPP. זה איפשר לנו ליצור שתי מטריצות פיצוי: (B) אחת שבה החרוזים המסומנים ב-TCPP שימשו כבקרת פיצוי עבור TCPP (FL-6) ו-(C) שבה נעשה שימוש בתאי A549 המסומנים ב-TCPP. שתי מטריצות פיצוי אלה דומות מאוד, עם ההבדל הגדול ביותר בפיצוי הקשור ל-TCPP בין TCPP (FL6) ו-FL-3. תרשימי הנקודות הנלווים המציגים פרמטרים מסוימים אלה מציגים פרופילים כמעט זהים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ריאגנטים נדרשים עבור פתרון מלאי TCPP. הכמויות של NaHCO3, מים מטוהרים ואיזופרופנול (IPA) מבוססות על כמות TCPP שנשקלה בשלב 1.1 (בין 49.0 מ"ג ל-50.9 מ"ג). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות היישומים הרבים של פורפירינים באבחון סרטן וטיפולים2, קיימת ספרות מוגבלת על השימוש הפוטנציאלי שלהם כמגיב ציטומטרי זרימה לזיהוי אוכלוסיות תאים סרטניים לעומת לא סרטניים ברקמות אנושיות ראשוניות24,25,26. המחקר שלנו על ניתוח ציטומטרי זרימה של כיח אנושי24,27 דורש צביעה של תאי כיח מנותקים עם TCPP וכמה פלואורופורים אחרים. עם זאת, זליגה פלואורסצנטית של TCPP בתעלות הגילוי המיועדות לפלואורופורים אחרים פירושה שהיה צורך בחרוז המסומן ב-TCPP כבקרת פיצוי. עם זאת, חרוז כזה לא היה זמין מסחרית והיה צורך לפתח אותו. דווח על חיבור של פורפירינים טטרארילים למסננות מולקולריות מבוססות צורן דו-חמצני28,29. עם זאת, חלקיקים מבוססי צורן דו-חמצני התגלו כלא מתאימים לצורך הכנת תקני ציטומטריית זרימה (הנתונים לא מוצגים). לכן, המחקרים שלנו התמקדו בחרוזי פוליסטירן.

תמיסה של TCPP באיזופרופנול-מים (1:1 v/v)30 תייגה את חרוזי הפוליסטירן ב-pH 6, אך ה-MFI היה נמוך מדי ביחס לתאים המוכתמים בבדיקה שלנו. חקרנו שינוי חרוזים קוולנטי כדרך להגדיל את ה-MFI. השינוי הקוולנטי של חרוזי לטקס פונקציונליים אמין עם אסטר NHS של TCPP באמצעות אמציה תואר בעבר על ידי Kabe et al.23 באמצעות חרוזים לא מסחריים בקוטר 2 מיקרומטר31. במחקר שנערך על ידי Kabe et al.23 , TCPP הודגר ב- DMF עם N-hydroxysuccinimide (NHS)32 במשך 5 שעות כדי להכין מונו-אסטר NHS מופעל של TCPP. תמיסת אסטר מופעלת זו הגיבה אז בחרוזים שהכילו מקשר אמין טרמינלי. עם זאת, כאשר יישמנו פרוטוקול זה על חרוזי פוליסטירן מסחריים הפונקציונליים של אמין, התיוג הביא לכך שחרוזים עם MFI אינם בהירים מספיק לפיצוי. לכן, חקרנו את ההדבקה הישירה של חרוזי אמין פוליסטירן ללא שימוש בביניים אסטר NHS.

בעבודה זו, חרוזי פוליסטירן פונקציונליים של אמין טופלו עם TCPP בנוכחות מגיב צימוד אמיד EDC כדי ליצור קשרי אמיד בין קבוצות האמינו על החרוזים לבין קבוצות קרבוקסי על TCPP. EDC נבחר בגלל המסיסות המימית שלו, התועלת המוכחת שלו בתגובות אמידציה מימיות בטווח pH רחב, עלות נמוכה ומסיסה במים על ידי מוצרים33,34. הגבנו חרוזי אמין פוליסטירן בקטרים של 8.6 מיקרומטר, 10.6 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר עם TCPP ו-EDC במים ב-pH 6. מחקרים קודמים הצביעו על כך ש-TCPP נשאר מסיס ב-pH זה, ו-pH זה תואם גם ל-EDC33. החרוזים המסומנים בגודל 8.6 מיקרומטר הניבו MFI שהיה נמוך מדי עבור הבדיקה שלנו. לחרוזים של 20 מיקרומטר היה MFI גבוה מספיק, אך הם נטו לשקוע מחוץ למתלים ולסתום את ציטומטר הזרימה (לא מוצג). החרוזים בגודל 10.6 מיקרומטר היו בעלי MFI הולם, נשארו בתרחיף מספיק זמן לניתוח ציטומטריית זרימה ולכן עברו אופטימיזציה כתקני פיצוי. יש לציין כי החרוזים המקבילים ללא תווית היו בעלי פלואורסצנטיות רקע נמוכה ויכלו לשמש כחרוזי בקרה שליליים לפיצוי.

הגדלת יחס הריאגנט הנפחי של EDC ל- TCPP תוך שמירה על כמות חרוזים קבועה הגדילה את MFI החרוזים עד שהושגה רמה ביחס של כ -2. רמת MFI נצפתה גם כאשר היחס בין TCPP לחרוזים גדל תוך שמירה על יחס EDC ל- TCPP קבוע. מכיוון שה-TCPP תייג את החרוזים בהיעדר EDC, רמת MFI עשויה להיות תוצאה של אתרי קשירה קוולנטיים ולא קוולנטיים הרווים על פני השטח של החרוז. תוצר לוואי של חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפה כאשר EDC ו-TCPP שולבו ב-pH 6. לחלקיק זה היה ספקטרום פלואורסצנטי דומה ל-TCPP אך לא נוצר בהיעדר EDC, דבר המצביע על כך שהוא תוצר לוואי בלתי מסיס מהתגובה של EDC עם TCPP. החלקיקים היו בעלי צורה לא סדירה, ולמרות שבדרך כלל היו קטנים מ-5 מיקרומטר, הם יכלו ליצור אגרגטים גדולים יותר ויכלו גם להיצמד לפני השטח של החרוזים. חלקיקים הקשורים ל-TCPP נצפו גם כאשר חרוזי אמין פוליסטירן הגיבו עם TCPP ו-EDC. כמות החלקיקים גדלה הן עם יחס EDC ל-TCPP גבוה יותר והן עם יחס TCPP לחרוזים גבוה יותר. יחסי הריאגנט שנבחרו בפרוטוקול הסופי הם המפתח להצלחת הליך תיוג החרוזים מכיוון שהם מבטיחים כי למתלה החרוזים המתקבל יש MFI גבוה בעוד שרמת החלקיקים נשארת מקובלת. רמת החלקיקים המיוצרים בפרוטוקול זה אינה מונעת שימוש בחרוזי TCPP לפיצוי, אך רמות גבוהות יותר של חלקיקים יכולות לפגוע בדיוק של הגדרות הפיצוי35. פיתחנו גם הליך סינון שיכול להפחית את רמת החלקיקים באופן משמעותי במידה ואלה נמצאים ברמה גבוהה.

את תגובתנו ניהלנו באמצעות מסית מסתובב. אי התססת התגובה גורמת להכתמה איטית יותר (הנתונים אינם מוצגים). מומלץ זמן תגובה של 16 שעות. זמני תגובה ארוכים יותר (>24 שעות) גורמים לרמות גבוהות יותר של חלקיקי TCPP, בעוד שזמני תגובה קצרים יותר (<8 שעות) גורמים ל-MFI חרוזים נמוך יותר. עבור בקרת החרוזים ללא תווית, לא השתמשנו בחרוזים פונקציונליים של אמין שלא סומנו ב- TCPP מכיוון שהאוטופלואורסצנטיות של החרוזים הלא מסומנים הפריעה לחישוב נכון של מטריצות הפיצוי. במקום זאת, השתמשנו בחרוזי פוליסטירן לא פונקציונליים הדומים בצורתם ובגודלם. בנוסף, שמרנו את החרוזים ללא תווית ועם תווית TCPP בצינורות נפרדים. עם שתי קבוצות החרוזים באותו צינור, ראינו העברה מסוימת של TCPP לחרוזים ללא תווית (נתונים לא מוצגים), מה שגרם לשינוי ימינה ב- MFI שאסר על החישוב הנכון של מטריצת הפיצוי.

לסיכום, הנקודות הקריטיות להשגת MFI גבוה של החרוזים המסומנים ב-TCPP הם יחסי הריאגנט המשמשים במהלך תגובת הצביעה, זמן תגובת הצביעה וקוטר החרוזים הלא מסומנים. בעבודה זו, הפרוטוקול המתואר לעיל העניק חרוזים מוכתמים TCPP שהיו בגודל מתאים לשימוש בציטומטר זרימה והיו פלואורסצנטיים מספיק לפיצוי. החרוזים המוכתמים ב-TCPP לא איבדו MFI משמעותי ב-4°C במשך 300 ימים. ספקטרום הפלואורסצנטיות של חרוזי TCPP היה דומה לזה של TCPP בתמיסה. יתר על כן, מטריצות הפיצוי שחושבו עם חרוזים עם תווית TCPP ותאי A549 מוכתמים יצרו פרופילי כיח כמעט זהים בבדיקה שלנו, מה שמדגים את התועלת של חרוזים אלה.

פרוטוקול זה מתאר את הכנת חרוזי פיצוי TCPP שהיו שימושיים במכשיר Navios EX, אך ייתכן שאותם חרוזים לא יפעלו במכשיר אחר בעל רגישותשונה 36 ותצורת גלאי שונה20. עם זאת, עבודה זו מציעה דרכים לווסת את הפלואורסצנטיות באמצעות גודל החרוז ויחס מגיב. TCPP הוא רק אחד מכמה פורפירינים פלואורסצנטיים שהוכיחו סלקטיביות של תאים סרטניים במבחנה ו-in vivo 2,37,38,39. לא כל הפורפירינים הפלואורסצנטיים עשויים להיקשר לחרוזי הפוליסטירן המתפקדים על ידי אמין המשמשים בפרוטוקול זה. למעשה, השימוש בחרוזים אלה מוגבל לפורפירינים המכילים חומצה קרבוקסילית. הצביעה הדיפרנציאלית של אוכלוסיות תאים מגוונות בדגימות רקמה אנושית עם פורפירינים, כפי שנמדדה על ידי ציטומטריית זרימה, עשויה להניב תובנות לגבי התפתחותו המוקדמת של סרטן, התקדמותו והפרוגנוזה שלו. השימוש בפורפירינים אחרים כדי להכתים דגימות רקמה אנושית וניתוחם על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בחרוזי בקרה מתאימים כתקני פיצוי, הוא כיוון אטרקטיבי למחקר נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל הכותבים הם עובדים של bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לדיוויד רודריגז על הסיוע בהכנת הדמויות ושירותי הפתולוגיה המדויקת (סן אנטוניו, טקסס) על השימוש בציטומטר הזרימה Navios EX שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 193 ציטומטריית זרימה בקרת פיצויים פלואורופור תיוג חרוזים פונקציונליים אמין אמדציה פורפירין
חרוזים מהונדסים בפורפירין לשימוש כבקרות פיצוי בציטומטריית זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter