Summary
このプロトコルでは、アミン官能化ポリスチレンビーズとポルフィリンTCPPおよびアミドカップリング試薬EDCとの反応によって、フローサイトメトリー用のポルフィリンベースの補償ビーズがどのように調製されるかについて説明しています。ろ過手順は、粒子状の副産物を減らすために使用されます。
Abstract
フローサイトメトリーは、蛍光測定に基づいて多様な細胞集団を迅速に特性評価および定量することができます。細胞はまず1つ以上の蛍光試薬で染色され、それぞれが異なる蛍光分子(蛍光色素)で機能化され、細胞表面抗原発現などの表現型特性に基づいて細胞に選択的に結合します。細胞に結合した各試薬からの蛍光強度は、指定された範囲の波長を検出するチャネルを使用してフローサイトメーターで測定できます。複数の蛍光色素を使用する場合、個々の蛍光色素からの光が望ましくない検出チャンネルにこぼれることが多く、補正と呼ばれるプロセスで蛍光強度データを補正する必要があります。
補償対照粒子(通常は単一の蛍光色素に結合したポリマービーズ)は、細胞標識実験で使用される各蛍光色素に必要です。フローサイトメーターからの補償粒子からのデータは、蛍光強度測定に補正を適用するために使用されます。このプロトコルでは、蛍光試薬メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン(TCPP)で共有結合的に官能基化されたポリスチレン補正ビーズの調製と精製、およびフローサイトメトリー補正への応用について説明します。本研究では,アミン官能化ポリスチレンビーズをTCPPとアミドカップリング試薬EDC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩)でpH 6,室温で16時間撹拌しながら処理した。TCPPビーズを遠心分離により単離し、保存のためにpH7緩衝液に再懸濁した。TCPP関連の微粒子が副産物として観察された。これらの微粒子の数は、オプションのろ過プロトコルを使用して減らすことができます。得られたTCPPビーズは、複数の蛍光色素で標識されたヒト喀痰細胞を用いた実験において、補正のためにフローサイトメーターでうまく使用されました。TCPPビーズは、冷蔵庫で300日間保存した後、安定であることが証明されました。
Introduction
ポルフィリンは、その蛍光特性と腫瘍標的特性により、生物医学分野で長年にわたって関心を集めてきました1,2,3。光線力学療法(PDT)およびソノダイナミック療法(SDT)などの治療用途は、癌患者へのポルフィリンの全身投与、腫瘍における薬物の蓄積、および特定の波長のレーザー光または超音波への腫瘍の局所的曝露を伴う。レーザー光または超音波への曝露は、ポルフィリンによる活性酸素種の生成とそれに続く細胞死につながります4,5。光線力学的診断(PDD)では、ポルフィリン蛍光を使用して癌細胞と正常細胞を区別します6。これに関連して、プロトポルフィリンIXは、その前駆体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の全身または局所注射時に腫瘍に蓄積する天然の蛍光ポルフィリンであり、消化管間質腫瘍、膀胱癌、および脳腫瘍を特定するために使用されます7,8。最近では、多発性骨髄腫における最小限の残存病変を検出するためのアプローチとして5-ALA治療が検討された9。当研究室では、テトラアリールポルフィリンTCPP(5,10,15,20-テトラキス-(4-カルボキシフェニル)-21,23H-ポルフィン)を用いており、ヒト喀痰検体中の肺がん細胞やがん関連細胞を選択的に染色することができ、スライドベースやフローサイトメトリー診断アッセイで利用されている特性です10。
いくつかのポルフィリンは、治療薬および診断薬として使用できるという点で二機能性である2,11。生物医学研究では、このような二官能性ポルフィリンを使用して、癌細胞を選択的に標的にして殺す能力がそれらの構造の関数であり、他の化合物の存在によってどのように影響を受けるかを評価します12、13、14、15、16。ポルフィリンの細胞内取り込みとその細胞毒性の両方を、フローサイトメトリープラットフォームでハイスループットな方法で測定できます。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルと発光スペクトルは複雑ですが、ほとんどのフローサイトメトリープラットフォームはそれらを正しく識別するために装備されています。蛍光ポルフィリンの吸収スペクトルは、ソーレー帯として知られる380〜500nmの範囲の強い吸収帯によって特徴付けられる。一般に、500〜750 nmの範囲(Qバンド)で2〜4個の弱い吸収バンドが観察されます17。ほとんどのフローサイトメーターに存在する青色の488 nmレーザー、または紫色レーザー(405 nm)は、ポルフィリンを励起するための適切な波長の光を生成できます。ポルフィリンの発光スペクトルは通常、600〜800 nmの範囲にピークを示し18、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリン(PE)フルオロフォアとのスペクトルオーバーラップはほとんどありませんが、アロフィコシアニン(APC)などの他のよく使用されるフルオロフォアや、PE-Cy5などのタンデムフルオロフォアとはかなり重複します。したがって、マルチカラーフローサイトメトリーアッセイでポルフィリンを使用する場合、ポルフィリンの蛍光を測定するために指定されたチャネル以外のチャネルでの蛍光のスピルオーバーを適切に補正するには、シングルフルオロフォアコントロールが不可欠です。
理想的には、蛍光色素パネルのスピルオーバーマトリックスの計算に使用される単一蛍光色素コントロール(「補正コントロール」とも呼ばれます)は、サンプルと同じ細胞タイプで構成されている必要があります。ただし、そもそもサンプルが非常に少ない場合、またはサンプル内のターゲット集団が非常に少ない場合(たとえば、病気の初期段階で最小限の残存疾患または癌細胞を調べたい場合)は、この目的でサンプルを使用することは最適ではありません。細胞の有用な代替物は、サンプルの分析に使用されるのと同じ蛍光色素と結合されたビーズです。そのようなビーズの多くは市販されている。これらのビーズは、目的の蛍光色素で事前に標識されているか(標識済み蛍光色素特異的ビーズ)19,20、または蛍光標識された抗体をそれらに付着させることができます(抗体捕捉ビーズ)20,21。市販の補正ビーズは多くの蛍光色素に利用できますが、このようなビーズは基礎研究や臨床研究での使用が増加しているにもかかわらず、ポルフィリンには利用できません。
サンプルの保存と適切なサイズのポジティブ集団とネガティブ集団に加えて、ビーズを補償コントロールとして使用する他の利点は、調製の容易さ、低バックグラウンド蛍光、および長期にわたる優れた安定性です22。ビーズを補償コントロールとして使用することの潜在的な欠点は、ビーズに捕捉された蛍光抗体の発光スペクトルが、細胞の標識に使用される同じ抗体の発光スペクトルと異なる可能性があることです。これは、スペクトルフローサイトメーター20を使用する場合に特に重要であり得る。したがって、補償制御としてのビーズの開発は、ビーズが開発されるアッセイに使用されるフローサイトメーター上で行われる必要がある。さらに、ビーズの開発には、同じ蛍光染色試薬で標識された細胞との比較を含める必要があります。
ここでは、検出チャネル内の蛍光強度の中央値が喀痰中のTCPP標識細胞と同等であったTCPPアミン官能化ポリスチレン補正ビーズの調製と、フローサイトメトリーの補正コントロールとしての使用について説明します。同等の非官能化ビーズの自家蛍光は、負の蛍光補償対照として使用するには十分に低かった。さらに、これらのビーズは、ほぼ1年間の貯蔵安定性を示しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての手順は、適切な個人用保護具を使用して行う必要があります。
1. TCPP原液の調製 1.0 mg/mL
注:これは毎月準備できます。
- 分析天びん、へら、および計量紙を使用して、49.0〜50.9 mgのTCPPを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。測定された量のTCPPを光から保護しておきます。
注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。 - ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から精製水とイソプロパノール(IPA)の必要量を決定します。精製水とイソプロパノールを100 mLのガラスビーカーに加え、蒸発から保護するためにパラフィルムで覆います。
- ステップ1.1で秤量したTCPPの量に基づいて、 表1 から重炭酸ナトリウムの必要量を決定します。
- 分析天びん、ヘラ、および計量紙を使用して、ステップ1.3で決定した必要量の重炭酸ナトリウムを計量します。重量をミリグラムの1/10に丸めます。
注意: 重量の読み取り値が不安定な場合は、静的ガンを使用してください。 - 精製水とイソプロパノールを含む100mLビーカーに重炭酸ナトリウムを加えます。蒸発から保護するために溶液をパラフィルムで覆います。
- ステップ1.5の溶液を攪拌プレートに置き、溶解するまで攪拌します(約10分)
- pHを測定して、ステップ1.6の重炭酸ナトリウム含有溶液のpHが9〜10であることを確認します。
- ステップ1.1で秤量したTCPPをステップ1.7の溶液にゆっくりと加え、溶解するまで攪拌を続けます(~30分)。このステップ中は光から保護してください。
- ガラス製またはポリプロピレン製の容器に室温で保管し、光から保護してください。
2. 2-(N -モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)およびヘミナトリウム塩緩衝液、0.1 M、pH 6.0-6.2(「MES緩衝液」)の調製
注意: これは使用日に準備し、室温に保つ必要があります。
- MESヘミナトリウム塩2.50gを量り、150mLのペットボトルに加えます。
- 精製水121 mLを加え、固形物が見えなくなるまで手動で振とうして溶解します。
- MESバッファーのpHを測定して、6〜6.2であることを確認します。
- 同じ日に使用するために室温に維持してください。
3. N-(3-ジメトリアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)粉末
- EDCパウダーを冷凍庫から取り出し、手順5で使用するまで室温で放置します。
4. アミン官能化ポリスチレンビーズとTCPP溶液の組み合わせ
- ステップ2で調製した0.1 M MES緩衝液4.3 mLを15 mLポリプロピレンチューブに加えます。
- アミン官能化ポリスチレンビーズ懸濁液(10 μm、2.5% w/v)を最高速度で60秒間ボルテックスします。
- この新たにボルテックスしたビーズ懸濁液288 μLをステップ4.1のMESバッファーに加えます。
- MES/ビーズ溶液を最大速度で15秒間ボルテックスします。
- ステップ1で調製した1 mg/mL TCPP溶液を最大速度で60秒間ボルテックスします。
- この新たにボルテックスしたTCPPストック溶液1.20 mLを、ステップ4.4のMES/ビーズ懸濁液に加えます。
- MES/ビーズ/TCPPサスペンションを最高速度で15秒間ボルテックスします。
- EDC溶液を調製している間、チューブをホイルで覆います。
5. N-(3-ジメトリアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド(EDC)ヒドロコロリド(HCl)原液の調製
注意: EDC溶液は腐りやすいため、調製後すぐに使用する必要があります。
- 20.0 mLの精製水を新しい50 mLコニカルチューブに追加します。
- ステップ3で200mgのEDC HClを量り、水に加えます(ステップ5.1)。
- EDC HCLを最大速度で15秒間ボルテックスして、明確なソリューションを生成します。
6. EDC HCl/MESワーキングソリューションの調製
注意: EDC HCl / MES溶液は腐りやすいため、調製後すぐに使用する必要があります。
- 54.0 mLのMES緩衝溶液(ステップ2で調製)を150 mLのペットボトルに追加します。
- 6.0 mLのEDC HClストック溶液(ステップ5で調製)をMES緩衝液に加え、10秒間振とうして混合します。
7. TCPPによるビーズの標識
- ビーズとTCPPを含む15 mLのポリプロピレンチューブに4.5 mLのEDC作業溶液(ステップ6から)をMESバッファーに加えます(ステップ4.7)。
- チューブを35rpmの反転ローテーターに室温で16時間置き、光から保護します。
- チューブを室温で1,000 × gで10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ビーズを0.8 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に再懸濁します。
- ビーズ溶液を1 mLピペットで琥珀色のポリプロピレンバイアルに移し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
注:この時点で、ビーズは少なくとも3か月間安定しています。
8. フローサイトメトリーによるTCPPビーズの品質チェック(QC)
注:QCは、TCPPビーズの蛍光強度の中央値(MFI)が、使用目的と手順によって生成される微粒子の量に対して十分に明るいかどうかに集中する必要があります。詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください。
- 1本の5 mLポリスチレンチューブに「TCPPネガティブビーズ」というラベルを付けます。
注:ネガティブビーズは、ラベリングに使用されるアミン官能化ビーズとは異なります。 材料表を参照してください。 - 別のチューブに「TCPPポジティブビーズ」というラベルを付けます。
- 別のチューブに「レインボービーズ」というラベルを付けます。
- 300 μLの氷冷HBSSを「TCPP陰性ビーズ」および「TCPP陽性ビーズ」でラベル付けされたチューブに分注します。
- 氷冷したHBSSを500μLの「レインボービーズ」とラベル付けされたチューブに加えます。
- 非官能化ポリスチレン(ラベルなし)ビーズ懸濁液を最高速度(2〜3秒)で短時間ボルテックスし、「TCPPネガティブビーズ」とラベル表示されたチューブに10μLを加えます。
- TCPP標識ビーズ懸濁液(ステップ7.5で完成)を最高速度で短時間ボルテックスし、3 μLを「TCPP陽性ビーズ」チューブに追加します。
- レインボービーズサスペンションを最高速度で短時間ボルテックスし、「レインボービーズ」チューブに2滴加えます。
- すべてのチューブを氷の上に置き、覆い、光から保護してください。
- フローサイトメーターの適切な毎日の起動手順を開始し、QCを実行して最適な流体とレーザーアライメントを検証します。
注:プロトコルのこの部分では、オペレーターは、光散乱と蛍光強度を標準化する手順、および正しい補償マトリックスを計算する基本原則を含む、利用可能なフローサイトメーターの使用について訓練されていることを前提としています。 - レインボービーズとTCPPビーズは、異なる実行の間に電圧設定を変更せずに実行します。
- レインボービーズのイベントを10,000回実行して収集します。
- 水ですすぎを行い、TCPP陰性ビーズのイベントを10,000回収集します。
- 水ですすぎを行い、TCPP陽性ビーズのイベントを10,000回収集します。
- 1分間の水すすぎを行います。
注意: TCPPビーズを実行した後は、水ですすぐことが重要です。TCPPがサイトメーターのラインから洗い流されない場合、残留TCPPが次に取得されるチューブ内の細胞を標識できる可能性がある。 - サイトメーターの製造元の指示に固有の適切なクリーニングおよびシャットダウンプロトコルを実行します。
メモ: 代表的な結果については、 図 1 を参照してください。
9.ビーズろ過
注:フローサイトメトリー(ステップ8)によるビーズのQCが高い割合(70%以上)を示している場合は、以下のプロトコルを使用してビーズ懸濁液をろ過することを検討してください(図2)。
- ステップ7.5で終了した0.8 mLのTCPPビーズ懸濁液に3.20 mLの氷冷HBSSを加えます(5倍希釈を作成します)。
- 希釈したビーズ懸濁液を最高速度で15秒間ボルテックスします。
- 使い捨ての5mLシリンジからプランジャーを取り外します。
- シリンジにガラス繊維チップフィルター(5 μm、直径13 mm)を取り付けます。
- 4 mLのHBSSをシリンジに加えます。
- ボルテックス希釈ビーズ懸濁液0.5 mLを加えます(ステップ9.2)。
- プランジャーを使用して、シリンジ/フィルターのセットアップで懸濁液を約2滴/秒でろ過します。
- 5 mLの新しいHBSSをフィルターを通して約2滴/秒でシリンジに引き込み、ビーズを洗浄します。
- HBSSを約2滴/秒で廃棄物容器に再度押し出します。
- フィルターからビーズを取り除くには、フィルターを通してさらに5 mLの新しいHBSSをシリンジに引き込みます。
- シリンジからフィルターを慎重に取り外します。
- ビーズ懸濁液をシリンジから50 mLの円錐形遠心管に排出します。
- フィルターをシリンジに戻し、手順9.10〜9.12をさらに4回繰り返します。次に、フィルターとシリンジを廃棄します。
- 手順9.2のすべてのビーズがろ過されるまで、手順9.1〜9.13を繰り返します。毎回新しい注射器とフィルターを使用してください。
- ろ過したビーズ懸濁液を室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。
- 各50 mLチューブの上清を吸引し、ビーズを穏やかに再懸濁し、0.5 mLの新鮮なHBSSに混ぜ合わせます。
- p1,000マイクロピペットでビーズを新しい琥珀色、ガラス、またはポリプロピレンのバイアルに移し、4°Cで保存します。
- ステップ8を繰り返して、ろ過されたビーズ懸濁液中のTCPP関連微粒子の割合が減少したかどうかを判断します。代表的な結果については、 図 3 を参照してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ビーズのTCPPラベリングのためのこのプロトコルは、比較的高速で効率的です。図1は、フローサイトメトリーによって決定されたTCPPビーズ標識プロセスの代表的な結果を示す。図1Aは、TCPPを検出するための適切なチャネルで検出されたレインボービーズの標準化されたプロファイルを示しています。これらのビーズは、フローサイトメーターによるTCPPの検出のためのレーザー電圧の標準化のためのQCとして機能します。図1Bは、アミン官能化ポリスチレン、TCPP標識ビーズの光散乱プロファイルを示しています。図1Cは、非官能化ビーズ(非標識ビーズ)の光散乱プロファイルを示しています。これらを負のビードコントロールとして使用して、補償行列を計算します。赤色の長方形で示した集団は、標識のないビーズ懸濁液には存在せず、TCPPがカップリング試薬EDCに曝露されたときに形成されるTCPP関連微粒子を表す。このような凝集体は、ビーズの蛍光強度(FI)が決定されるときに除外する必要があります。図1Dは、図1Bの黒いゲートによって選択された標識ビーズのFIを示しており、これは明らかに(未処理の)ラベルなしビーズのFIよりも数対数高い(図1Dと図1Eを比較)。
微粒子の割合(すなわち、 図1Bの赤いゲートで示された事象)は、標識バッチごとに異なり得る。ほとんどの標準的なフローサイトメトリーアプリケーションでは、50%以下の微粒子を含むビーズ懸濁液により、TCPPを用いたマルチカラーフローサイトメトリー実験で補正を正しく設定することができます。ただし、たとえば、自動データ分析が使用されるアプリケーションがあり、粒子含有量がはるかに多いと、適切な補正設定が妨げられる可能性があります。このような場合は、ろ過が推奨されます(プロトコルステップ9および 図2)。図 3 は、~65%の微粒子を含むビーズ懸濁液に対するろ過の効果を示しています( 図3A、Bの左パネル)。ろ過後、粒子含有量は~12%に減少しました。ろ過の悪影響は、ビーズの損失(図示せず)とFIのわずかな損失です(図3C)。これらの影響は、ビーズ懸濁液のろ過を検討する際に考慮する必要があります。粒子含有量を下げるためのビーズろ過の代替手段は、ビーズ、TCPP、およびカップリング試薬EDCの比率を変更することです。ただし、これらの比率の変化はビーズのFIにも影響します。
粒子形成、MFI、およびビーズ/TCPP/EDC比の関係を図4と図5に示します。図4Aおよび図5Aは、それぞれEDC/TCPP比およびTCPP/ビーズ比の関数としての標識ビーズのMFIを示す。比率が増加すると、MFIはプラトーになるまで増加します。図4Bおよび図5Bの代表例は、粒子含有量がそれぞれの増加率とともに増加することを示している。このTCPPラベリングプロトコルは、微粒子含有量を可能な限り低く抑えながら、MFIが最大になるように最適化されています(図4Aおよび図5Aの矢印)。微粒子は、標識手順中にEDCがカップリング試薬として使用された場合にのみ現れます。ビーズとTCPPのみを使用すると、微粒子は形成されませんが(図示せず)、ビーズの標識により、FIがはるかに低いビーズが得られます(図6Aと図6Bの比較)。このEDCベースのカップリング法を、TCPP23の活性化NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)エステルに基づく方法に置き換えることを試みた。しかし、ビーズとTCPPを一緒に使用する場合と比較して、この代替カップリング法を使用した場合と比較してFIに有意差は見られず、この方法ではTCPPのビーズへの共有結合が無視できることが示唆されました(図6Bと図6Cの比較)。
これまでのすべての図で示されているデータは、直径10.6μmのビーズを使用して収集されました。我々は、より大きなビーズは表面積の増加によりより多くのTCPP結合部位を有する可能性があり、したがって、より高いFIを示す可能性があると仮定した。 逆に、表面積が小さく、TCPP結合部位が少ない小さなビーズは、より低いFIを示すはずであると仮定しました。 ここで説明したのと同じラベリングプロトコルを使用しますが、8.6 μmビーズまたは20 μmビーズを使用します(10.6 μmビーズの代わりに)。 10.6 μmビーズと比較して、8.6 μmビーズのFIの予測減少が見られました(図6Dと図6Aの比較)。20 μmビーズは、使用したフローサイトメーターのスケールから外れたFIを示しましたが(データは示されていません)、これらの大きなビーズはその後すぐに溶液から沈降し、それ以上追求されませんでした。
TCPPでビーズを標識するためのこのプロトコルは、TCPPを使用して細胞を標識するフローサイトメトリー実験において信頼性の高い補正ツールを使用することを目的として開発されました。過去には、この目的のためにA549細胞を使用しました24が、標識手順が必ずしも高いFIをもたらすとは限りませんでした。さらに、当該細胞は、固定後であっても、1ヶ月以上使用することができなかった。本明細書に記載のTCPPで(10.6 μm)ビーズを標識するためのプロトコルは、図1に示すように、一貫して明るく染色されたビーズをもたらしました。さらに、同じTCPP標識ビーズを300日後にフローサイトメトリーでテストしたところ、MFIや微粒子含有量に大きな変化は見られませんでした(図7)。TCPPのビーズへの結合は、その蛍光発光スペクトルにほとんど影響を与えませんでした(図8A;破線の黒い線と溶液中のTCPPの蛍光発光スペクトルを表す黒い実線の比較)。TCPP標識ビーズの蛍光発光スペクトルは、特に700-725 nmの波長付近で、A549肺がん細胞内で測定されたTCPPのスペクトルとは大きく異なっていた(図8A;オレンジ色の線と比較して黒い破線)。しかし、マルチフルオロフォア標識喀痰サンプル中の他のシグナルからのTCPPシグナルを補償する能力により、TCPP標識ビーズはTCPP染色されたA549細胞と同様に良好に機能しました(それぞれ図8Bと図8Cを比較)。
ザ。LMD ファイルは、フローリポジトリ (https://flowrepository.org) の ID FR-FCM-Z6ZP にあります (図 1)。FR-FCM-Z5UJ (図 3B,C);FR-FCM-Z6ZR (図 4B);FR-FCM-Z6ZS (図 5B);FR-FCM-Z6ZB (図 6);FR-FCM-Z6Y5 (図 8B);およびFR-FCM-Z6ZT(図8C)。
図1:TCPPでラベル付けされたビーズの品質チェック。 (A)レインボービーズ。APC蛍光色素に特異的なチャネルで検出されたレインボービーズのヒストグラムを示します。このチャンネルは、TCPP蛍光の検出にも使用できます。レインボービーズは、APCレーザーのQCとして機能します。1番目と4番目のピークは、それぞれの括弧で示された領域にあるはずです。(B,D)TCPP標識ビーズ。(C,E)ラベルのないビーズ。TCPP標識ビーズ溶液のこの特定のサンプルには、51.9%のビーズ(Bの黒い長方形ゲート)が含まれていました。赤い四角形のイベントは、TCPP ラベル付け中に形成された微粒子を表します。このような微粒子は、非標識ビーズ溶液には存在しなかった(BおよびCにおける赤い長方形の比較)。TCPP標識ビーズおよび非標識ビーズの蛍光強度は、それぞれDおよびEで示されている。略語:SSC =サイドスキャッター;FSC = 前方散乱;APC = アロフィコシアニン;TCPP = メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロトコルステップ9.3〜9.12で使用されるビードフィルタリング方法の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:微粒子と蛍光強度に対するろ過の影響。 (A)TCPPで標識した10 μmビーズの顕微鏡画像(左の写真)とろ過後(右の画像)。画像は20倍の増幅で撮影されました。スケールバー = 20 μm。 (B)ろ過前のTCPPビーズ懸濁液(左プロファイル)には、25.6%のビーズ(黒い長方形)と65.7%の破片または粒子(赤い長方形)が含まれていました。懸濁液中のビーズの割合はろ過後に74.7%に増加し(右のプロファイル;黒い長方形)、破片は11.9%に減少しました。(C) Bで特定されたビーズのTCPP FIのヒストグラム。左側のヒストグラムはろ過前のTCPP標識ビーズを表し、ろ過後のビーズよりもわずかに高いFIです(右側のヒストグラム)。両方の図で 1 × 103 の FI に配置された赤い線は、両方のヒストグラムの比較を容易にするためのものです。略語:SSC =サイドスキャッター;FSC = 前方散乱;APC = アロフィコシアニン;TCPP = メソテトラ(4-カルボキシフェニル)ポルフィン;FI = 蛍光強度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:EDC/TCPP比、蛍光強度中央値(MFI)、微粒子形成の関係。 (A)ビーズラベリングプロトコルで使用されるEDC/TCPP比と、その後のTCPPラベルビーズのMFIとの関係を示します。曲線は、標準偏差(SD)±3つの独立した実験の平均MFIを示す。赤い矢印(3.75)は、このプロトコルで使用されるEDCおよびTCPPソリューションの体積比を示します。(B)上記のEDC/TCPP比で調製したビーズ懸濁液の代表的な光散乱プロファイル。すべてのプロファイルは同じ実験から派生しています。ビーズは黒い長方形で示されています。赤い長方形で示された粒子形成は、EDC/TCPP比の増加とともに増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.TCPP/ビーズ比、MFI、微粒子形成の関係 (A)ビーズラベリングプロトコルで使用されるTCPP/ビーズの体積比と、その後のTCPPラベルビーズのMFIとの関係を示します。MFIは急速に増加し、TCPP/ビーズ比2の後にプラトー段階に達します。曲線は、標準偏差(SD)±3つの独立した実験の平均MFIを示す。赤い矢印(4.17)は、このプロトコルで使用される比率を示します。(B)上記のTCCP/ビーズ比で調製したビーズ懸濁液の代表的な光散乱プロファイル。すべてのプロファイルは同じ実験から派生しています。ビーズは黒い長方形で示されます。赤い長方形で示されている粒子形成は、TCPP/ビーズ比の増加とともに増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:使用した結合方法とビードサイズの比較。 TCPPで標識したビーズの蛍光強度のヒストグラムを示す。(A)10.6 μmビーズは、カップリング試薬EDCの使用を含め、提供されたプロトコルに従って標識されました。(B)(A)と同じですが、ラベリングプロトコル中にEDCが省略されました。(C)10.6 μmビーズを、Kabeら23によって記載された方法に従って、NHSエステルを用いて標識した。(D)(A)と同様ですが、10.6μmビーズの代わりに8.6μmビーズを使用しました。各プロファイルの赤い縦線は、ヒストグラム間の比較を容易にするために、1 × 103 に任意に設定されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:経時的なTCPPビーズの安定性。 TCPP標識ビーズ(10μm)をプロトコルに従って標識し、4°Cの冷蔵庫で保存し、暗所に保管した。0日目はラベリングの日です。その後の様々な時点で、保存したビーズのアリコートをフローサイトメトリーによって再分析した。提示されたのは、100%に任意に設定した0日目の値に対する(A)MFIおよび(B)微粒子の割合の測定値である。オレンジ色の水平線は、0 日目の値より 10% 上と 10% 下の値を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:補正ツールとしてのTCPP染色細胞と比較したTCPPビーズ 。 (a)溶液中のTCCP、ビーズに結合したTCPP、およびA549肺癌細胞を染色した後のTCPPの蛍光発光スペクトルをマイクロプレートリーダーで測定した。可溶性TCPPとビーズ結合TCPPの発光スペクトルは非常に類似しています。どちらも、700nmの波長付近で標識されたA549細胞のそれとは異なります。(B、C)。喀痰サンプルを単一細胞に加工し、複数の蛍光色素(AF488(FL1)、BV510(FL10)、PE(FL2)、PE-CF594(FL3)、およびTCPP(FL6)で標識しました。各蛍光色素について、関連する蛍光色素と結合したビーズを含む単色制御チューブを用意しました。TCPPについては、TCPP標識ビーズとTCPP標識固定A549セルの2つのコントロールチューブを設置しました。これにより、(B)TCPP標識ビーズをTCPPの補償対照(FL-6)として用いたもの、(C)TCPP標識A549細胞を用いたものの2つの補償マトリックスを作成することができた。これら2つの補償マトリックスは非常に類似しており、TCPP(FL6)とFL-3のTCPP関連の補償に最も大きな違いがあります。これらの特定のパラメータを表示する付随するドットプロットは、ほぼ同一のプロファイルを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:TCPP原液に必要な試薬。 NaHCO3、精製水、およびイソプロパノール(IPA)の量は、ステップ1.1で計量されたTCPPの量(49.0 mgから50.9 mgの間)に基づいています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
癌の診断および治療におけるポルフィリンの多くの用途にもかかわらず2、初代ヒト組織における癌性細胞集団と非癌細胞集団を同定するためのフローサイトメトリー試薬としてのポルフィリンの使用の可能性に関する文献は限られています24、25、26。ヒト喀痰のフローサイトメトリー分析に関する当社の研究では、解離した喀痰細胞をTCPPおよび他のいくつかの蛍光色素で染色する必要があります。しかし、他の蛍光色素用に指定された検出チャネルでのTCPPの蛍光スピルオーバーは、補正制御としてTCPP標識ビーズが必要であることを意味しました。しかし、そのようなビーズは市販されておらず、開発する必要がありました。二酸化ケイ素ベースのモレキュラーシーブ28,29へのテトラアリールポルフィリンの付着が報告されている。しかしながら、二酸化ケイ素ベースの粒子は、フローサイトメトリー標準物質を調製する目的には不適切であることが判明した(データは示さず)。したがって、私たちの研究はポリスチレンビーズに焦点を当てました。
イソプロパノール水(1:1 v/v)30中のTCPP溶液は、pH 6でポリスチレンビーズを標識しましたが、MFIはアッセイで染色された細胞に対して低すぎました。MFIを増加させる方法として、共有結合ビーズ修飾を検討しました。アミド化によるTCPPのNHSエステルによるアミン官能化ラテックスビーズの共有結合修飾は、非市販の直径2μmビーズ31を用いたKabeら23によって以前に記載された。Kabe et al.23による研究では、TCPPをDMF中でN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)32と5時間インキュベートし、活性化NHSモノエステルを調製した。次いで、この活性化エステル溶液を、末端アミンリンカーを含むビーズと反応させた。しかし、このプロトコルを市販のアミン官能化ポリスチレンビーズに適用したところ、MFIが補正に不十分なビーズが標識されました。そこで、NHSエステル中間体を用いずにアミンポリスチレンビーズを直接アミド化することを検討した。
本研究では、アミン官能化ポリスチレンビーズをアミドカップリング試薬EDCの存在下でTCPPで処理し、ビーズ上のアミノ基とTCPP上のカルボキシ基との間にアミド結合を生成させた。EDCは、その水性溶解性、広いpH範囲にわたる水性アミド化反応における実証済みの有用性、低コスト、および製品33,34による水溶性のために選択されました。直径8.6 μm、10.6 μm、20 μmのアミンポリスチレンビーズを、pH6の水中でTCPPおよびEDCと反応させた。以前の研究では、TCPPはこのpHで可溶性のままであり、このpHはEDC33とも適合性があることが示されています。標識された8.6 μmビーズは、MFIが低すぎてアッセイには低すぎました。20 μmビーズは十分に高いMFIを有していたが、懸濁液から沈降し、フローサイトメーター(図示せず)を詰まらせる傾向があった。10.6 μmビーズは適切なMFIを有し、フローサイトメトリー分析に十分な時間懸濁液中に留まったため、補正標準として最適化されました。特に、同等の非標識ビーズはバックグラウンド蛍光が低く、補償用のネガティブコントロールビーズとして使用できました。
ビーズ量を一定に保ちながらEDCとTCPPの容量試薬比を上げると、ビーズMFIが約2の割合でプラトーに達するまで増加しました。EDCとTCPPの比率を一定に保ちながら、TCPPとビーズの比率が増加したため、MFIプラトーも観察されました。TCPPはEDCの非存在下でビーズを標識するので、MFIプラトーは、共有結合部位および非共有結合部位がビーズの表面上で飽和した結果であり得る。EDCとTCPPをpH6で組み合わせると、TCPP関連の粒子状副産物が観察されました。この微粒子はTCPPと同様の蛍光スペクトルを有していたが、EDCの非存在下では形成されず、EDCとTCPPとの反応による不溶性の副産物であることが示唆された。粒子は不規則な形状であり、一般に5μm未満ですが、より大きな凝集体を形成する可能性があり、ビーズの表面に付着する可能性もあります。アミンポリスチレンビーズをTCPPおよびEDCと反応させた場合にも、TCPP関連の粒子が観察されました。微粒子の量は、EDC対TCPP比が高くなり、TCPPとビーズの比率が高くなるにつれて増加しました。最終プロトコルで選択された試薬比は、粒子レベルが許容範囲内でありながら、結果として得られるビーズ懸濁液が高いMFIを有することを保証するため、ビーズラベリング手順の成功の鍵となります。このプロトコルで生成される微粒子のレベルは、補償のためのTCPPビーズの使用を排除するものではないが、より高いレベルの微粒子は、補償設定35の精度を妨げる可能性がある。また、微粒子が高レベルで存在する場合に粒子のレベルを大幅に減らすことができるろ過手順を開発しました。
回転撹拌機を用いて反応を行った。反応を攪拌しないと、染色が遅くなります(データは示されていません)。16時間の反応時間を推奨します。反応時間が長い(>24時間)とTCPP粒子のレベルが高くなり、反応時間が短い(<8時間)とビーズMFIが低くなります。非標識ビーズコントロールでは、非標識ビーズの自家蛍光が補償マトリックスの正しい計算を妨げていたため、TCPPで標識されていないアミン官能化ビーズを使用しませんでした。代わりに、メーカーとサイズが似ている非官能化ポリスチレンビーズを使用しました。さらに、非標識ビーズとTCPP標識ビーズを別々のチューブに保管しました。両方のビーズセットを同じチューブに入れると、TCPPがラベルのないビーズ(データ示さず)にいくらか移動し、MFIの右シフトが発生し、補償マトリックスの正しい計算が妨げられました。
要約すると、TCPP標識ビーズの高いMFIを達成するための重要なポイントは、染色反応中に使用される試薬比、染色反応の時間、および非標識ビーズの直径です。この研究では、上記のプロトコルにより、フローサイトメーターで使用するのに適したサイズで、補償に十分な蛍光性を備えたTCPP染色ビーズが得られました。TCPP染色ビーズは、4°Cで300日間有意なMFIを失わなかった。TCPPビーズの蛍光スペクトルは溶液中のTCPPの蛍光スペクトルと同等であった。さらに、TCPP標識ビーズと染色されたA549細胞で計算された補正マトリックスは、私たちのアッセイで実質的に同一の喀痰プロファイルを生成し、これらのビーズの有用性を実証しました。
このプロトコルは、Navios EX機器上で有用であったTCPP補償ビーズの調製を記述するが、これらの同じビーズは、異なる感度36および異なる検出器構成20を有する異なる機器では動作しない可能性がある。しかし、この研究は、ビーズサイズと試薬比によって蛍光を調節する方法を示唆しています。TCPPは、インビトロおよびインビボで癌細胞の選択性を示したいくつかの蛍光ポルフィリンのうちの1つにすぎません2,37,38,39。すべての蛍光ポルフィリンが、このプロトコルで使用されるアミン官能化ポリスチレンビーズに結合するわけではありません。実際、これらのビーズの使用は、カルボン酸を含むポルフィリンに限定されています。ヒト組織サンプル中の多様な細胞集団をポルフィリンで示差染色し、フローサイトメトリーで測定することで、がんの初期発生、進行、予後に関する手掛かりが得られる可能性があります。ヒト組織サンプルを染色するための他のポルフィリンの使用と、適切なコントロールビーズを補正基準として使用するフローサイトメトリーによるそれらの分析は、さらなる研究にとって魅力的な方向性です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
すべての著者はバイオアフィニティテクノロジーズの従業員です。
Acknowledgments
フィギュアの準備を支援してくれたDavid Rodriguezと、Navios EXフローサイトメーターの使用についてプレシジョンパソロジーサービス(テキサス州サンアントニオ)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable - 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable - 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
- Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
