Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Het protocol beschrijft hoe op porfyrine gebaseerde compensatieparels voor flowcytometrie worden bereid door de reactie van amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels met de porfyrine TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC. Een filtratieprocedure wordt gebruikt om de deeltjesbijproducten te verminderen.

Abstract

Flowcytometrie kan snel diverse celpopulaties karakteriseren en kwantificeren op basis van fluorescentiemetingen. De cellen worden eerst gekleurd met een of meer fluorescerende reagentia, elk gefunctionaliseerd met een ander fluorescerend molecuul (fluorofoor) dat selectief aan cellen bindt op basis van hun fenotypische kenmerken, zoals antigeenexpressie van het celoppervlak. De intensiteit van fluorescentie van elk reagens gebonden aan cellen kan worden gemeten op de flowcytometer met behulp van kanalen die een bepaald golflengtebereik detecteren. Wanneer meerdere fluoroforen worden gebruikt, loopt het licht van individuele fluoroforen vaak over in ongewenste detectiekanalen, wat een correctie van de fluorescentie-intensiteitsgegevens vereist in een proces dat compensatie wordt genoemd.

Compensatiecontroledeeltjes, meestal polymeerparels gebonden aan een enkele fluorofoor, zijn nodig voor elke fluorofoor die wordt gebruikt in een celetiketteringsexperiment. Gegevens van compensatiedeeltjes van de flowcytometer worden gebruikt om een correctie toe te passen op de fluorescentie-intensiteitsmetingen. Dit protocol beschrijft de bereiding en zuivering van polystyreencompensatieparels covalent gefunctionaliseerd met het fluorescerende reagens meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine (TCPP) en hun toepassing in flowcytometriecompensatie. In dit werk werden amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels behandeld met TCPP en het amidekoppelingsreagens EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride) bij pH 6 en bij kamertemperatuur gedurende 16 uur met roeren. De TCPP-kralen werden geïsoleerd door centrifugeren en geresuspendeerd in een pH 7-buffer voor opslag. TCPP-gerelateerde deeltjes werden waargenomen als bijproduct. Het aantal van deze deeltjes kan worden verminderd met behulp van een optioneel filtratieprotocol. De resulterende TCPP-kralen werden met succes gebruikt op een flowcytometer voor compensatie in experimenten met menselijke sputumcellen gelabeld met meerdere fluoroforen. De TCPP-kralen bleken stabiel na 300 dagen bewaren in een koelkast.

Introduction

Porfyrines zijn al vele jaren van belang op biomedisch gebied vanwege hun fluorescentie en tumorgerichte eigenschappen 1,2,3. Therapeutische toepassingen zoals fotodynamische therapie (PDT) en sonodynamische therapie (SDT) omvatten de systemische toediening van een porfyrine aan een kankerpatiënt, de accumulatie van het geneesmiddel in de tumor en de gelokaliseerde blootstelling van de tumor aan een laserlicht van een specifieke golflengte of echografie. De blootstelling aan laserlicht of echografie leidt tot het genereren van reactieve zuurstofsoorten door de porfyrine en de daaropvolgende celdood 4,5. Bij fotodynamische diagnose (PDD) wordt porfyrinefluorescentie gebruikt om kankercellen te onderscheiden van normale cellen6. In deze context wordt protoporfyrine IX, een natuurlijke fluorescerende porfyrine die zich ophoopt in tumoren bij de systemische of lokale injectie van zijn voorloper, 5-aminolevulinezuur (5-ALA), gebruikt om gastro-intestinale stromale tumoren, blaaskanker en hersenkankerte identificeren 7,8. Meer recent werd 5-ALA-behandeling onderzocht als een benadering om minimale restziekte bij multipel myeloom te detecteren9. Ons laboratorium heeft de tetraarylporfyrine TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyfenyl)-21,23 H-porfine) gebruikt vanwege zijn vermogen om longkankercellen en kankergeassocieerde cellen selectief te kleuren in menselijke sputummonsters, wat een eigenschap is die is geëxploiteerd in slide-gebaseerde en flowcytometrische diagnostische testen10.

Sommige porfyrines zijn bifunctioneel in die zin dat ze kunnen worden gebruikt als therapeutische en diagnostische middelen 2,11. In biomedisch onderzoek worden dergelijke bifunctionele porfyrines gebruikt om te evalueren hoe hun vermogen om kankercellen selectief te richten en te doden een functie is van hun structuur en hoe het wordt beïnvloed door de aanwezigheid van andere verbindingen 12,13,14,15,16. Zowel de cellulaire opname van porfyrines als hun cytotoxiciteit kunnen op een flowcytometrisch platform op een high-throughput manier worden gemeten. De absorptie- en emissiespectra van fluorescerende porfyrines zijn complex, maar de meeste flowcytometrische platforms zijn uitgerust om ze correct te identificeren. Het absorptiespectrum van fluorescerende porfyrines wordt gekenmerkt door een sterke absorptieband in het bereik van 380-500 nm, bekend als de Soret-band. Twee tot vier zwakkere absorptiebanden worden over het algemeen waargenomen in het bereik van 500-750 nm (Q-banden)17. Een blauwe 488 nm laser, aanwezig in de meeste flowcytometers, of een violette laser (405 nm) kan licht van de juiste golflengte genereren om porfyrines te prikkelen. De emissiespectra van porfyrines vertonen meestal pieken in het bereik van 600-800 nm18, wat resulteert in zeer weinig spectrale overlap met fluoresceïne-isothiocyanaat of fycoerythrin (PE) fluoroforen, maar aanzienlijke overlap met andere vaak gebruikte fluoroforen, zoals allophycocyanine (APC), evenals tandemfluoroforen, zoals PE-Cy5 en anderen. Daarom zijn bij het gebruik van porfyrines in meerkleurige flowcytometrietests enkelvoudige fluorofoorcontroles essentieel om de spillover van fluorescentie in andere kanalen dan die welke is aangewezen om de fluorescentie van de porfyrine te meten, adequaat te corrigeren.

Idealiter zouden de enkelvoudige fluorofoorcontroles die worden gebruikt om de spillovermatrix voor een panel van fluoroforen te berekenen (ook wel "compensatiecontroles" genoemd) uit hetzelfde celtype of dezelfde celtypen bestaan als het monster. Het gebruik van de steekproef voor dit doel is echter niet optimaal als er om te beginnen zeer weinig steekproef is of als de doelpopulatie binnen de steekproef erg klein is (bijvoorbeeld als men wil kijken naar minimale restziekte of kankercellen in de vroege stadia van de ziekte). Een nuttig alternatief voor cellen zijn kralen gekoppeld aan dezelfde fluorofoor die wordt gebruikt om het monster te analyseren. Veel van dergelijke kralen zijn in de handel verkrijgbaar; Deze kralen zijn ofwel voorgelabeld met de gewenste fluorofoor (voorgelabelde fluorofoor-specifieke kralen)19,20, of er kan een fluorescerend gelabeld antilichaam aan worden bevestigd (antilichaamvangkralen)20,21. Hoewel commerciële compensatieparels beschikbaar zijn voor veel fluoroforen, zijn dergelijke kralen niet beschikbaar voor porfyrines, ondanks hun toenemende gebruik in fundamenteel en klinisch onderzoek.

Naast het behoud van monsters en positieve versus negatieve populaties van de juiste grootte, zijn de andere voordelen van het gebruik van kralen als compensatiecontroles het gemak van voorbereiding, lage achtergrondfluorescentie en uitstekende stabiliteit in de loop van de tijd22. Het potentiële nadeel van het gebruik van kralen als compensatiecontrole is dat het emissiespectrum van het fluorescerende antilichaam dat op kralen wordt gevangen, kan verschillen van dat van hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt om de cellen te labelen. Dit kan van specifiek belang zijn bij het gebruik van een spectrale flowcytometer20. Daarom moet de ontwikkeling van kralen als compensatiecontrole worden uitgevoerd op de flowcytometer die zal worden gebruikt voor de test waarvoor de kralen zijn ontwikkeld. Bovendien moet de ontwikkeling van de kralen een vergelijking omvatten met cellen die zijn gelabeld met hetzelfde fluorescerende kleuringsreagens.

Hier beschrijven we de bereiding van TCPP-amine-gefunctionaliseerde polystyreencompensatieparels, waarvan de mediane fluorescentie-intensiteit in het detectiekanaal vergelijkbaar was met die van TCPP-gelabelde cellen in sputum, en hun gebruik als compensatiecontroles voor flowcytometrie. De autofluorescentie van equivalente, niet-gefunctionaliseerde kralen was voldoende laag voor hun gebruik als negatieve fluorescentiecompensatiecontroles. Bovendien vertoonden deze kralen stabiliteit in opslag gedurende bijna 1 jaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

1. Bereiding van de TCPP-stamoplossing, 1,0 mg/ml

OPMERKING: Dit kan maandelijks worden voorbereid.

  1. Weeg met behulp van een analytische balans, spatel en weegpapier 49,0-50,9 mg TCPP. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram. Zet de gemeten hoeveelheid TCPP opzij beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de gewichtsmeting onstabiel is.
  2. Bepaal de vereiste hoeveelheden gezuiverd water en isopropanol (IPA) uit tabel 1 op basis van de hoeveelheid TCPP gewogen in stap 1.1. Voeg het gezuiverde water en isopropanol toe aan een glazen bekerglas van 100 ml en dek af met parafilm om te beschermen tegen verdamping.
  3. Bepaal de vereiste hoeveelheid natriumbicarbonaat uit tabel 1 op basis van de hoeveelheid TCPP die in stap 1.1 is gewogen.
  4. Weeg met behulp van de analytische balans, spatel en weegpapier de vereiste hoeveelheid natriumbicarbonaat af, bepaald in stap 1.3. Rond het gewicht af op 1/10 van een milligram.
    OPMERKING: Gebruik een statisch pistool als de gewichtsmeting onstabiel is.
  5. Voeg het natriumbicarbonaat toe aan het bekerglas van 100 ml met gezuiverd water en isopropanol. Bedek de oplossing met parafilm ter bescherming tegen verdamping.
  6. Leg de oplossing uit stap 1.5 op een roerplaat en roer tot het is opgelost (ca. 10 min)
  7. Meet de pH om er zeker van te zijn dat de natriumbicarbonaathoudende oplossing uit stap 1.6 een pH tussen 9 en 10 heeft.
  8. Voeg langzaam de TCPP gewogen in stap 1.1 toe aan de oplossing uit stap 1.7 en blijf roeren tot het is opgelost (~30 min). Bescherm tegen licht tijdens deze stap.
  9. Bewaren in een glazen of polypropyleen container bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.

2. Bereiding van 2-(N -morfolino)-ethaansulfonzuur (MES) en hemisodiumzoutbufferoplossing, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-buffer")

OPMERKING: Dit moet op de dag van gebruik worden bereid en op kamertemperatuur worden bewaard.

  1. Weeg 2,50 g MES hemisodiumzout af en voeg dit toe aan een plastic fles van 150 ml.
  2. Voeg 121 ml gezuiverd water toe en los op door handmatig schudden totdat er geen vaste stof zichtbaar is.
  3. Meet de pH van de MES-buffer om er zeker van te zijn dat deze tussen 6 en 6,2 ligt.
  4. Handhaven op kamertemperatuur voor gebruik op dezelfde dag.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) poeder

  1. Haal het EDC-poeder uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur staan tot gebruik in stap 5.

4. Amine-gefunctionaliseerde polystyreenkralen combineren met TCPP-oplossing

  1. Voeg 4,3 ml van de 0,1 M MES-bufferoplossing bereid in stap 2 toe aan een polypropyleenbuis van 15 ml.
  2. Vortex de amine-gefunctionaliseerde polystyreen kraal suspensie (10 μm, 2,5% w / v) voor 60 s op maximale snelheid.
  3. Voeg 288 μL van deze vers gevortexeerde kraalsuspensie toe aan de MES-buffer uit stap 4.1.
  4. Vortex de MES/kraaloplossing voor 15 s op maximale snelheid.
  5. Vortex de 1 mg/ml TCPP-oplossing bereid in stap 1 gedurende 60 s op maximale snelheid.
  6. Voeg 1,20 ml van deze vers gevortexeerde TCPP-stamoplossing toe aan de MES/kraalsuspensie uit stap 4.4.
  7. Vortex de MES/kraal/TCPP ophanging gedurende 15 s op maximale snelheid.
  8. Bedek de buis met folie terwijl de EDC-oplossing wordt bereid.

5. Bereiding van N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl) stamoplossing

OPMERKING: De EDC-oplossing is bederfelijk en moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt.

  1. Voeg 20,0 ml gezuiverd water toe aan een nieuwe conische buis van 50 ml.
  2. Weeg 200 mg EDC HCl uit stap 3 af en voeg dit toe aan het water (stap 5.1).
  3. Draai de EDC HCL gedurende 15 s op maximale snelheid om een duidelijke oplossing te genereren.

6. Bereiding van de EDC HCl/MES werkoplossing

OPMERKING: De EDC HCl/MES-oplossing is bederfelijk en moet onmiddellijk na bereiding worden gebruikt.

  1. Voeg 54,0 ml MES-bufferoplossing (bereid in stap 2) toe aan een plastic fles van 150 ml.
  2. Voeg 6,0 ml van de EDC HCl-stamoplossing (bereid in stap 5) toe aan de MES-bufferoplossing en meng door 10 s te schudden.

7. De kralen labelen met TCPP

  1. Voeg 4,5 ml EDC-werkoplossing (vanaf stap 6) toe aan de polypropyleenbuis van 15 ml met de kralen en TCPP in MES-buffer (stap 4.7).
  2. Plaats de buis in een omgekeerde rotator bij 35 rpm gedurende 16 uur bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht.
  3. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 1.000 × g.
  4. Zuig het supernatant op en resuspensie de kralen in 0,8 ml van Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
  5. Breng de kraaloplossing over in een amberkleurige injectieflacon met polypropyleen met een pipet van 1 ml en bewaar bij 4 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: De kralen zijn op dit moment minstens 3 maanden stabiel.

8. Kwaliteitscontrole (QC) van de TCPP-kralen door flowcytometrie

OPMERKING: De QC moet worden gecentreerd op de vraag of de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van de TCPP-kralen voldoende helder is voor het beoogde gebruik en de hoeveelheid deeltjes die door de procedure wordt gegenereerd. Zie de sectie representatieve resultaten voor meer informatie.

  1. Label een polystyreenbuis van 5 ml als 'TCPP-negatieve kralen'.
    OPMERKING: De negatieve kralen verschillen van de amine-gefunctionaliseerde kralen die worden gebruikt voor etikettering. Zie de tabel met materialen.
  2. Label een andere buis als 'TCPP-positieve kralen'.
  3. Label een andere buis als 'Regenboogkralen'.
  4. Aliquot 300 μL ijskoude HBSS in de buizen gelabeld met "TCPP negatieve kralen" en "TCPP positieve kralen."
  5. Voeg 500 μL ijskoud HBSS toe aan de buis met het label 'Regenboogkralen'.
  6. Vortex de niet-gefunctionaliseerde polystyreen (ongelabelde) kraalsuspensie kort op maximale snelheid (2-3 s), en voeg 10 μL ervan toe aan de buis met het label "TCPP negatieve kralen."
  7. Vortex de TCPP-gelabelde kraalsuspensie (afgerond in stap 7.5) kort op maximale snelheid en voeg 3 μL ervan toe aan de "TCPP positive beads" -buis.
  8. Vortex de Rainbow bead suspension kort op maximale snelheid, en voeg twee druppels van het in de "Rainbow beads" buis.
  9. Houd alle buizen op ijs, afgedekt en beschermd tegen licht.
  10. Start de juiste dagelijkse opstartprocedures van de flowcytometer en voer een QC uit om de optimale vloeistoffen en laseruitlijning te verifiëren.
    OPMERKING: Voor dit deel van het protocol wordt aangenomen dat de operator is getraind in het gebruik van de beschikbare flowcytometer, inclusief de procedures voor het standaardiseren van de lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit, evenals de basisprincipes voor het berekenen van de juiste compensatiematrix.
  11. Voer de Rainbow-kralen en de TCPP-kralen uit zonder de spanningsinstellingen tussen de verschillende runs te wijzigen.
    1. Ren en verzamel 10.000 evenementen van de Regenboogkralen.
    2. Voer een spoeling uit met water en verzamel 10.000 gebeurtenissen van de TCPP-negatieve kralen.
    3. Voer een spoeling uit met water en verzamel 10.000 gebeurtenissen van de TCPP-positieve kralen.
    4. Voer een waterspoeling van 1 minuut uit.
      OPMERKING: Het is belangrijk om een spoeling met water uit te voeren na het uitvoeren van de TCPP-kralen. Als de TCPP niet uit de lijnen in de cytometer wordt gespoeld, bestaat de mogelijkheid dat resterende TCPP cellen in de volgende te verkrijgen buis kan labelen.
    5. Voer de juiste reinigings- en afsluitprotocollen uit die specifiek zijn voor de instructies van de fabrikant voor de cytometer.
      OPMERKING: Voor representatieve resultaten, zie figuur 1.

9. Kraal filtratie

OPMERKING: Als de QC van de kralen door flowcytometrie (stap 8) een hoog aandeel deeltjes (70% of hoger) vertoont, overweeg dan om de kraalsuspensie te filteren met behulp van het onderstaande protocol (figuur 2).

  1. Voeg 3,20 ml ijskoude HBSS toe aan 0,8 ml van de TCPP-kraalsuspensie die in stap 7.5 is voltooid (waardoor een vijfvoudige verdunning ontstaat).
  2. Vortex de verdunde kraal suspensie op maximale snelheid gedurende 15 s.
  3. Verwijder de zuiger uit een wegwerpspuit van 5 ml.
  4. Breng de spuit aan met een glasvezelpuntfilter (5 μm, 13 mm diameter).
  5. Voeg 4 ml HBSS toe aan de spuit.
  6. Voeg 0,5 ml van de vortexed verdunde kraalsuspensie toe (stap 9.2).
  7. Gebruik de zuiger om de suspensie met ongeveer 2 druppels/s door de spuit/filteropstelling te filteren.
  8. Was de kralen door 5 ml vers HBSS door het filter in de spuit te trekken met ongeveer 2 druppels/s.
  9. Duw de HBSS er weer uit in de afvalcontainer met ongeveer 2 druppels/s.
  10. Om de kralen uit het filter te verwijderen, zuigt u nog eens 5 ml vers HBSS door het filter in de spuit.
  11. Verwijder het filter voorzichtig uit de spuit.
  12. Werp de kraalsuspensie uit de spuit in een conische centrifugebuis van 50 ml.
  13. Plaats het filter terug op de spuit en herhaal stap 9.10-9.12 nog vier keer. Gooi vervolgens het filter en de spuit weg.
  14. Herhaal stap 9.2-9.13 totdat alle kralen uit stap 9.1 zijn gefilterd. Gebruik een verse spuit en filter elke keer.
  15. Centrifugeer de gefilterde kralensuspensies gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij kamertemperatuur.
  16. Zuig het supernatant van elke buis van 50 ml op en resuspensie de kralen voorzichtig en combineer ze in 0,5 ml vers HBSS.
  17. Breng de kralen met een p1.000 micropipette over in een nieuwe amberkleurige, glazen of polypropyleen injectieflacon en bewaar bij 4 °C.
  18. Herhaal stap 8 om te bepalen of het aandeel TCPP-gerelateerde deeltjes in de gefilterde kraalsuspensie is afgenomen. Voor representatieve resultaten, zie figuur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol voor de TCPP-etikettering van kralen is relatief snel en efficiënt. Figuur 1 toont een representatieve uitkomst van het TCPP-kraaletiketteringsproces zoals bepaald door flowcytometrie. Figuur 1A toont het gestandaardiseerde profiel van regenboogkralen, zoals gedetecteerd in het juiste kanaal voor het detecteren van TCPP. Deze kralen dienen als QC voor de standaardisatie van de laserspanningen voor de detectie van TCPP door de flowcytometer. Figuur 1B toont het lichtverstrooiingsprofiel van amine-gefunctionaliseerd polystyreen, TCPP-gelabelde kralen. Figuur 1C toont het lichtverstrooiingsprofiel van niet-gefunctionaliseerde kralen (niet-gelabelde kralen); We gebruiken deze als een negatieve kralencontrole om de compensatiematrix te berekenen. De populatie aangegeven door de rode rechthoek, die afwezig is in de niet-gelabelde kraalsuspensie, vertegenwoordigt de TCPP-gerelateerde deeltjes die worden gevormd wanneer TCPP wordt blootgesteld aan het koppelingsreagens EDC. Dergelijke aggregaten moeten worden uitgesloten wanneer de fluorescentie-intensiteit (FI) van de kralen wordt bepaald. Figuur 1D toont de FI van de gelabelde kralen, geselecteerd door de zwarte poort in figuur 1B, die duidelijk enkele stammen hoger is dan de FI van de (ongelabelde) niet-gelabelde kralen (waarbij figuur 1D wordt vergeleken met figuur 1E).

Het aandeel deeltjes (d.w.z. de gebeurtenissen aangegeven door de rode poort in figuur 1B) kan per etiketteringsbatch verschillen. Voor de meeste standaard flowcytometrietoepassingen maakt een kraalsuspensie met 50% deeltjes of minder het mogelijk om compensatie correct in te stellen in een meerkleurig flowcytometrie-experiment met behulp van TCPP. Er zijn echter toepassingen waar geautomatiseerde gegevensanalyse wordt gebruikt, waarvoor een veel hoger deeltjesgehalte de juiste compensatie-instellingen kan verstoren. In dergelijke gevallen wordt filtratie aanbevolen (protocolstap 9 en figuur 2). Figuur 3 toont het effect van filtratie op de kraalsuspensie die voor ~65% uit deeltjes bestond (linkerpanelen van figuur 3A,B). Na filtratie daalde het deeltjesgehalte tot ~12%. De nadelige effecten van filtratie zijn enig verlies van kralen (niet weergegeven) en een licht verlies van FI (figuur 3C). Met deze effecten moet rekening worden gehouden wanneer filtratie van de kraalsuspensie wordt overwogen. Een alternatief voor parelfiltratie om het deeltjesgehalte te verlagen, is het veranderen van de verhouding tussen de kralen, de TCPP en het koppelingsreagens EDC. Veranderingen in deze verhoudingen hebben echter ook invloed op de FI van de kralen.

De relatie tussen de deeltjesvorming, MFI en kraal/TCPP/EDC-verhouding wordt geïllustreerd in figuur 4 en figuur 5. Figuur 4A en figuur 5A tonen de MFI van de gelabelde kralen als functie van respectievelijk de EDC/TCPP-verhouding en de TCPP/kraalverhouding. Met toenemende verhoudingen neemt de MFI toe totdat deze plateaus bereikt. De representatieve voorbeelden in figuur 4B en figuur 5B laten zien dat het deeltjesgehalte toeneemt met de respectievelijke toenemende verhouding. Dit TCPP-etiketteringsprotocol is geoptimaliseerd voor maximale MFI terwijl het deeltjesgehalte zo laag mogelijk blijft (pijlen in figuur 4A en figuur 5A). De deeltjes verschijnen alleen wanneer EDC wordt gebruikt als koppelingsreagens tijdens de etiketteringsprocedure. Met alleen kralen en TCPP worden geen deeltjes gevormd (niet weergegeven), maar de etikettering van de kralen resulteert in kralen met een veel lagere FI (waarbij figuur 6A wordt vergeleken met figuur 6B). We hebben geprobeerd deze op EDC gebaseerde koppelingsmethode te vervangen door een methode gebaseerd op een geactiveerde NHS (N-hydroxysuccinimide) ester van TCPP23. We vonden echter geen significant verschil in FI met behulp van deze alternatieve koppelingsmethode in vergelijking met alleen het gebruik van kralen en TCPP samen, wat suggereert dat er een verwaarloosbare covalente binding van TCPP aan de kralen is met deze methode (waarbij figuur 6B wordt vergeleken met figuur 6C).

De gegevens in alle cijfers tot nu toe zijn verzameld met behulp van kralen met een diameter van 10,6 μm. We veronderstelden dat grotere kralen meer TCPP-bindingsplaatsen kunnen hebben vanwege het grotere oppervlak en daarom een hogere FI zouden kunnen vertonen. Omgekeerd veronderstelden we dat kleinere kralen met kleinere oppervlakken en minder TCPP-bindingsplaatsen een lagere FI zouden moeten vertonen. Met hetzelfde etiketteringsprotocol als hier beschreven, maar met 8,6 μm kralen of 20 μm kralen (in plaats van 10,6 μm kralen), we vonden de voorspelde vermindering van FI in de 8,6 μm kralen in vergelijking met de 10,6 μm kralen (waarbij figuur 6D werd vergeleken met figuur 6A). De kralen van 20 μm vertoonden een FI van de schaal voor de flowcytometer die we gebruikten (gegevens niet getoond), maar deze grotere kralen vestigden zich snel daarna uit de oplossing en werden niet verder achtervolgd.

Dit protocol voor het labelen van kralen met TCPP is ontwikkeld met het doel een betrouwbaar compensatiehulpmiddel te hebben in flowcytometrie-experimenten waarbij TCPP wordt gebruikt om cellen te labelen. In het verleden gebruikten we hiervoor A549-cellen24, maar de etiketteringsprocedure resulteerde niet altijd in een hoge FI. Bovendien konden de cellen, zelfs na fixatie, niet langer dan 1 maand worden gebruikt. Het protocol voor het labelen van (10,6 μm) kralen met TCPP dat hierin wordt beschreven, resulteerde consequent in felgekleurde kralen, zoals weergegeven in figuur 1. Bovendien, toen dezelfde TCPP-gelabelde kralen na 300 dagen werden getest met flowcytometrie, zagen we geen significante verandering in de MFI noch in het deeltjesgehalte (figuur 7). De koppeling van TCPP aan de kralen had weinig effect op het fluorescentie-emissiespectrum (figuur 8A; vergelijking van de onderbroken zwarte lijn met de ononderbroken zwarte lijn, die het fluorescentie-emissiespectrum van TCPP in oplossing vertegenwoordigt). Het fluorescentie-emissiespectrum van TCPP-gelabelde kralen verschilde meer van het spectrum van TCPP gemeten in A549-longkankercellen, vooral rond de golflengten van 700-725 nm (figuur 8A; onderbroken zwarte lijn vergeleken met de oranje lijn, respectievelijk). Met de mogelijkheid om het TCPP-signaal van de andere signalen in een multi-fluorofoor-gelabeld sputummonster te compenseren, werkten de TCPP-gelabelde kralen echter even goed als de TCPP-gekleurde A549-cellen (waarbij figuur 8B met figuur 8C werd vergeleken, respectievelijk).

De. LMD-bestanden zijn te vinden in de FlowRepository (https://flowrepository.org), onder de ID's FR-FCM-Z6ZP (Figuur 1); FR-FCM-Z5UJ (figuur 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (figuur 4B); FR-FCM-Z6ZS (figuur 5B); FR-FCM-Z6ZB (figuur 6); FR-FCM-Z6Y5 (figuur 8B); en FR-FCM-Z6ZT (figuur 8C).

Figure 1
Figuur 1: Kwaliteitscontrole van de kralen gelabeld met TCPP. (A) Regenboogkralen. Gepresenteerd is het histogram van de regenboogkralen zoals gedetecteerd in het kanaal dat specifiek is voor de APC-fluorofoor. Dit kanaal kan ook worden gebruikt om TCPP-fluorescentie te detecteren. De Rainbow kralen dienen als QC voor de APC laser; De eerste en vierde piek moeten vallen in de regio die door de respectievelijke haakjes wordt aangegeven. (B,D) TCPP-gelabelde kralen. (C,E) Ongelabelde kralen. Dit specifieke monster van TCPP-gelabelde kralenoplossing bevatte 51,9% kralen (zwarte rechthoekige poort in B). De gebeurtenissen in de rode rechthoek vertegenwoordigen de deeltjes die zijn gevormd tijdens de TCPP-etikettering. Dergelijke deeltjes waren afwezig in de niet-gelabelde kraaloplossing (waarbij de rode rechthoeken in B en C werden vergeleken). De fluorescentie-intensiteiten van de TCPP-gelabelde en niet-gelabelde kralen worden respectievelijk in D en E weergegeven. Afkortingen: SSC = side scatter; FSC = voorwaartse verstrooiing; APC = allophycocyanine; TCPP = meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische weergave van de kralenfiltermethode die wordt gebruikt in protocolstappen 9.3-9.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Effecten van filtratie op deeltjes en fluorescentie-intensiteit. (A) Microscopiebeelden van 10 μm kralen gelabeld met TCPP voor (linker foto) en na filtratie (rechter afbeelding). De beelden zijn gemaakt met een 20x versterking. Schaalbalk = 20 μm. (B) De TCPP-kraalsuspensie voorafgaand aan filtratie (linkerprofiel) omvatte 25,6% kralen (zwarte rechthoek) en 65,7% puin of deeltjes (rode rechthoek). Het aandeel kralen in de suspensie steeg tot 74,7% na filtratie (rechterprofiel; zwarte rechthoek) en het puin daalde tot 11,9%. C) Histogrammen van de TCPP FI van de kralen zoals geïdentificeerd in B. Het histogram aan de linkerkant vertegenwoordigt de TCPP-gelabelde kralen vóór filtratie, met een FI iets hoger dan die van de kralen na filtratie (histogram aan de rechterkant). De rode lijnen, geplaatst op een FI van 1 × 103 in beide figuren, moeten de vergelijking van beide histogrammen vergemakkelijken. Afkortingen: SSC = side scatter; FSC = voorwaartse verstrooiing; APC = allophycocyanine; TCPP = meso-tetra(4-carboxyfenyl) porfine; FI = fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Relatie tussen de EDC/TCPP-verhouding, mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) en deeltjesvorming. (A) Gepresenteerd is de relatie tussen de EDC/TCPP-verhouding die wordt gebruikt in het kraaletiketteringsprotocol en de MFI van de daaruit voortvloeiende TCPP-gelabelde kralen. De curve toont de gemiddelde MFI van drie onafhankelijke experimenten ± standaarddeviatie (SD). De rode pijl (3,75) geeft de volumetrische verhouding aan van de EDC- en TCPP-oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. B) Representatieve lichtverstrooiingsprofielen van de kraalsuspensies, bereid met de EDC/TCPP-verhoudingen zoals aangegeven boven elk profiel. Alle profielen zijn afgeleid van hetzelfde experiment. De kralen worden aangegeven door de zwarte rechthoek. De deeltjesvorming, aangegeven door de rode rechthoeken, neemt toe met toenemende EDC/TCPP-verhoudingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. Relatie tussen de TCPP/kralenverhouding, MFI en deeltjesvorming. (A) Gepresenteerd is de relatie tussen de TCPP/kralen volumetrische verhouding die wordt gebruikt in het kraaletiketteringsprotocol en de MFI van de daaruit voortvloeiende TCPP-gelabelde kralen. De MFI neemt snel toe en bereikt een plateaufase na een TCPP/kralen verhouding van 2. De curve toont de gemiddelde MFI van drie onafhankelijke experimenten ± standaarddeviatie (SD). De rode pijl (4.17) geeft de verhouding aan die in dit protocol wordt gebruikt. B) Representatieve lichtverstrooiingsprofielen van de kralensuspensies, bereid met de TCCP/kralenverhoudingen zoals aangegeven boven elk profiel. Alle profielen zijn afgeleid van hetzelfde experiment. De kralen worden aangegeven door de zwarte rechthoeken. De deeltjesvorming, aangegeven door de rode rechthoeken, neemt toe met toenemende TCPP/kraalverhoudingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Een vergelijking van de gebruikte koppelingsmethoden en kralengroottes. Weergegeven zijn histogrammen van de fluorescentie-intensiteit van de kralen gelabeld met TCPP. (A) De 10,6 μm kralen werden geëtiketteerd volgens het meegeleverde protocol, inclusief het gebruik van het koppelingsreagens EDC. (B) Hetzelfde als (A), maar EDC is weggelaten tijdens het etiketteringsprotocol. (C) De 10,6 μm kralen werden geëtiketteerd met behulp van de NHS-ester, volgens de methode beschreven door Kabe et al.23. (D) Hetzelfde als (A), maar in plaats van 10,6 μm kralen werden 8,6 μm kralen gebruikt. De verticale rode lijnen in elk profiel zijn willekeurig ingesteld op 1 × 103 om vergelijkingen tussen de histogrammen te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Stabiliteit van de TCPP-kralen in de tijd. TCPP-gelabelde kralen (10 μm) werden geëtiketteerd volgens het protocol, bewaard in de koelkast bij 4 °C en bewaard in het donker. Dag 0 is de dag van het labelen. Op verschillende tijdstippen daarna werden aliquots van de opgeslagen kralen opnieuw geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Gepresenteerd worden metingen van de (A) MFI en (B) procentuele deeltjes ten opzichte van de dag 0 waarde, die willekeurig is vastgesteld op 100%. De horizontale oranje lijnen vertegenwoordigen de waarden 10% boven en 10% onder die op dag 0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: TCPP-kralen vergeleken met TCPP-gekleurde cellen als compensatie-instrumenten. (A) De fluorescentie-emissiespectra van TCCP in oplossing, TCPP gekoppeld aan kralen en TCPP na de kleuring van A549-longkankercellen werden gemeten op een microplaatlezer. De emissiespectra van oplosbaar en kraalgebonden TCPP lijken sterk op elkaar. Beide verschillen van die van gelabelde A549-cellen rond de golflengte van 700 nm. (B,C). Een sputummonster werd verwerkt tot enkele cellen en gelabeld met meerdere fluoroforen: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) en TCPP (FL6). Voor elke fluorofoor hebben we eenkleurige controlebuizen gemaakt met kralen in combinatie met de relevante fluorofoor. Voor TCPP werden twee controlebuizen opgezet: een met TCPP-gelabelde kralen en een met vaste A549-cellen gelabeld met TCPP. Dit stelde ons in staat om twee compensatiematrices te maken: (B) een waarin de TCPP-gelabelde kralen werden gebruikt als de compensatiecontrole voor TCPP (FL-6) en (C) een waarin TCPP-gelabelde A549-cellen werden gebruikt. Deze twee compensatiematrices lijken erg op elkaar, met het grootste verschil in TCPP-gerelateerde compensatie tussen TCPP (FL6) en FL-3. De bijbehorende dot plots die deze specifieke parameters weergeven, tonen bijna identieke profielen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Reagentia die nodig zijn voor de TCPP-stamoplossing. De hoeveelheden NaHCO3, gezuiverd water en isopropanol (IPA) zijn gebaseerd op de hoeveelheid TCPP gewogen in stap 1.1 (tussen 49,0 mg en 50,9 mg). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ondanks de vele toepassingen van porfyrines bij kankerdiagnose en -therapieën2, is er beperkte literatuur over hun potentiële gebruik als flowcytometrisch reagens voor de identificatie van kankerachtige versus niet-kankerachtige celpopulaties in primaire menselijke weefsels24,25,26. Ons onderzoek naar de flowcytometrische analyse van humaan sputum24,27 vereist de kleuring van gedissocieerde sputumcellen met TCPP en verschillende andere fluoroforen. Fluorescentiespillover van TCPP in de detectiekanalen die voor andere fluoroforen waren aangewezen, betekende echter dat een TCPP-gelabelde kraal nodig was als compensatiecontrole. Een dergelijke kraal was echter niet in de handel verkrijgbaar en moest worden ontwikkeld. De hechting van tetraarylporfyrines aan moleculaire zeven op basis van siliciumdioxide28,29 is gemeld. Op siliciumdioxide gebaseerde deeltjes bleken echter ongeschikt voor het opstellen van flowcytometriestandaarden (gegevens niet getoond). Daarom richtten onze studies zich op polystyreenkralen.

Een oplossing van TCPP in isopropanol-water (1:1 v/v)30 labelde de polystyreenkorrels bij pH 6, maar de MFI was te laag ten opzichte van de gekleurde cellen in onze test. We onderzochten covalente kraalmodificatie als een manier om de MFI te verhogen. De covalente modificatie van de amine-gefunctionaliseerde latexkralen met de NHS-ester van TCPP door amidatie werd eerder beschreven door Kabe et al.23 met behulp van niet-commerciële kralen met een diameter van 2 μm31. In de studie van Kabe et al.23 werd TCPP geïncubeerd in DMF met N-hydroxysuccinimide (NHS)32 gedurende 5 uur om een geactiveerde NHS-mono-ester van TCPP te bereiden. Deze geactiveerde esteroplossing werd vervolgens gereageerd met kralen die een terminale aminelinker bevatten. Toen we dit protocol echter toepasten op commerciële amine-gefunctionaliseerde polystyreenkralen, resulteerde de etikettering in kralen met een MFI die onvoldoende helder was voor compensatie. Daarom onderzochten we de directe amidatie van aminepolystyreenparels zonder een NHS-estertussenproduct te gebruiken.

In dit werk werden amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels behandeld met TCPP in aanwezigheid van het amidekoppelingsreagens EDC om amidebindingen te genereren tussen de aminogroepen op de kralen en de carboxygroepen op de TCPP. EDC werd geselecteerd vanwege de waterige oplosbaarheid, bewezen nut in waterige amidatiereacties over een breed pH-bereik, lage kosten en in water oplosbare bijproducten33,34. We reageerden aminepolystyreenkorrels met diameters van 8,6 μm, 10,6 μm en 20 μm met TCPP en EDC in water bij pH 6. Eerdere studies hebben aangetoond dat TCPP oplosbaar blijft bij deze pH, en deze pH is ook compatibel met EDC33. De gelabelde kralen van 8,6 μm resulteerden in een MFI die te laag was voor onze test. De 20 μm kralen hadden een voldoende hoge MFI, maar waren gevoelig voor bezinking uit suspensie en verstopping van de flowcytometer (niet weergegeven). De 10,6 μm kralen hadden een adequate MFI, bleven lang genoeg in suspensie voor flowcytometrie-analyse en werden dus geoptimaliseerd als compensatiestandaarden. Met name de equivalente niet-gelabelde kralen hadden een lage achtergrondfluorescentie en konden worden gebruikt als negatieve controlekralen ter compensatie.

Het verhogen van de volumetrische reagensverhouding van EDC tot TCPP terwijl de hoeveelheid kralen constant bleef, verhoogde de kraal MFI totdat een plateau werd bereikt in een verhouding van ongeveer 2. Een MFI-plateau werd ook waargenomen omdat de verhouding tussen TCPP en kralen werd verhoogd terwijl de EDC-/TCPP-verhouding constant bleef. Aangezien de TCPP de kralen labelde in afwezigheid van EDC, kan het MFI-plateau het gevolg zijn van covalente en niet-covalente bindingsplaatsen die verzadigd zijn op het oppervlak van de kraal. Een TCPP-gerelateerd deeltjesbijproduct werd waargenomen wanneer EDC en TCPP werden gecombineerd bij pH 6. Deze deeltjes hadden een fluorescentiespectrum vergelijkbaar met TCPP, maar vormden zich niet in afwezigheid van EDC, wat suggereert dat het een onoplosbaar bijproduct is van de reactie van EDC met TCPP. De deeltjes waren onregelmatig gevormd en, hoewel over het algemeen kleiner dan 5 μm, konden grotere aggregaten vormen en konden zich ook hechten aan het oppervlak van de kralen. TCPP-gerelateerde deeltjes werden ook waargenomen wanneer aminepolystyreenkorrels reageerden met TCPP en EDC. De hoeveelheid deeltjes nam toe met zowel een hogere EDC/TCPP-verhouding als een hogere TCPP-kralenverhouding. De in het definitieve protocol geselecteerde reagensverhoudingen zijn de sleutel tot het succes van de kraaletiketteringsprocedure omdat ze ervoor zorgen dat de resulterende kraalsuspensie een hoge MFI heeft terwijl het deeltjesniveau acceptabel blijft. Het niveau van deeltjes dat in dit protocol wordt geproduceerd, sluit het gebruik van TCPP-kralen voor compensatie niet uit, maar hogere niveaus van deeltjes kunnen de nauwkeurigheid van de compensatie-instellingen belemmeren35. We hebben ook een filtratieprocedure ontwikkeld die het niveau van deeltjes aanzienlijk kan verminderen als deze op een hoog niveau aanwezig zijn.

We voerden onze reactie uit met behulp van een roterend roerwerk. Het niet roeren van de reactie resulteert in langzamere kleuring (gegevens niet getoond). Een reactietijd van 16 uur wordt aanbevolen. Langere reactietijden (>24 uur) resulteren in hogere niveaus van TCPP-deeltjes, terwijl kortere reactietijden (<8 uur) resulteren in lagere hiel-MFI. Voor de ongelabelde kralenbestrijding gebruikten we geen amine-gefunctionaliseerde kralen die niet waren gelabeld met TCPP omdat de autofluorescentie van de niet-gelabelde kralen interfereerde met het correct berekenen van de compensatiematrices. In plaats daarvan gebruikten we niet-gefunctionaliseerde polystyreenkralen die qua merk en grootte vergelijkbaar waren. Daarnaast bewaarden we de ongelabelde en TCPP-gelabelde kralen in aparte tubes. Met beide sets kralen in dezelfde buis, zagen we enige overdracht van TCPP naar de niet-gelabelde kralen (gegevens niet getoond), wat een verschuiving naar rechts in de MFI veroorzaakte die de juiste berekening van de compensatiematrix verbood.

Samenvattend zijn de kritische punten voor het bereiken van een hoge MFI van de TCPP-gelabelde kralen de reagensverhoudingen die tijdens de kleuringsreactie worden gebruikt, de tijd van de kleuringsreactie en de diameter van de niet-gelabelde kralen. In dit werk bood het hierboven beschreven protocol TCPP-gekleurde kralen die de juiste grootte hadden voor gebruik in een flowcytometer en voldoende fluorescerend waren voor compensatie. De TCPP-gekleurde kralen verloren gedurende 300 dagen geen significante MFI bij 4 °C. Het fluorescentiespectrum van de TCPP-kralen was vergelijkbaar met dat van TCPP in oplossing. Bovendien genereerden de compensatiematrices berekend met TCPP-gelabelde kralen en gekleurde A549-cellen vrijwel identieke sputumprofielen in onze test, wat het nut van deze kralen aantoont.

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van TCPP-compensatieparels die nuttig waren op het Navios EX-instrument, maar dezelfde kralen werken mogelijk niet op een ander instrument met een andere gevoeligheid36 en een andere detectorconfiguratie20. Dit werk suggereert echter manieren om de fluorescentie te moduleren door de kraalgrootte en reagensverhouding. TCPP is slechts een van de vele fluorescerende porfyrines die in vitro en in vivo selectiviteit van kankercellen hebben aangetoond 2,37,38,39. Niet alle fluorescerende porfyrines kunnen binden aan de amine-gefunctionaliseerde polystyreenkorrels die in dit protocol worden gebruikt. In feite is het gebruik van deze kralen beperkt tot porfyrines die een carbonzuur bevatten. De differentiële kleuring van diverse celpopulaties in menselijke weefselmonsters met porfyrines, zoals gemeten door flowcytometrie, kan inzichten opleveren in de vroege ontwikkeling van kanker, de progressie en de prognose ervan. Het gebruik van andere porfyrines om menselijke weefselmonsters te kleuren en hun analyse door flowcytometrie, met behulp van geschikte controleparels als compensatienormen, is een aantrekkelijke richting voor verder onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs zijn medewerkers van bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

We willen David Rodriguez bedanken voor zijn hulp bij de figuurvoorbereiding en Precision Pathology Services (San Antonio, TX) voor het gebruik van zijn Navios EX-flowcytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

Deze maand in JoVE Nummer 193 Flowcytometrie compensatiecontrole fluorofoor etikettering amine-gefunctionaliseerde kralen amidatie porfyrine
Porfyrine-gemodificeerde kralen voor gebruik als compensatiecontroles in flowcytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter