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Chemistry

Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Le protocole décrit comment les billes de compensation à base de porphyrine pour la cytométrie en flux sont préparées par la réaction de billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec le TCPP de porphyrine et le réactif de couplage amide EDC. Une procédure de filtration est utilisée pour réduire les sous-produits particulaires.

Abstract

La cytométrie en flux peut rapidement caractériser et quantifier diverses populations cellulaires en fonction des mesures de fluorescence. Les cellules sont d’abord colorées avec un ou plusieurs réactifs fluorescents, chacun fonctionnalisé avec une molécule fluorescente différente (fluorophore) qui se lie sélectivement aux cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques, telles que l’expression de l’antigène de surface cellulaire. L’intensité de fluorescence de chaque réactif lié aux cellules peut être mesurée sur le cytomètre en flux à l’aide de canaux qui détectent une gamme spécifiée de longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, la lumière des fluorophores individuels déborde souvent dans des canaux de détection indésirables, ce qui nécessite une correction des données d’intensité de fluorescence dans un processus appelé compensation.

Des particules de contrôle de compensation, généralement des billes de polymère liées à un seul fluorophore, sont nécessaires pour chaque fluorophore utilisé dans une expérience de marquage cellulaire. Les données des particules de compensation du cytomètre en flux sont utilisées pour appliquer une correction aux mesures d’intensité de fluorescence. Ce protocole décrit la préparation et la purification de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par covalence avec le réactif fluorescent méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP) et leur application dans la compensation de cytométrie en flux. Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine ont été traitées avec du TCPP et le réactif de couplage amide EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide) à pH 6 et à température ambiante pendant 16 h avec agitation. Les billes TCPP ont été isolées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon de pH 7 pour le stockage. Les particules liées au TCPP ont été observées comme sous-produit. Le nombre de ces particules pourrait être réduit à l’aide d’un protocole de filtration facultatif. Les billes TCPP résultantes ont été utilisées avec succès sur un cytomètre en flux pour la compensation dans des expériences avec des cellules d’expectorations humaines marquées avec plusieurs fluorophores. Les billes du RRCT se sont avérées stables après avoir été conservées au réfrigérateur pendant 300 jours.

Introduction

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral 1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’espèces réactives de l’oxygène par la porphyrine et à la mort cellulaire subséquente 4,5. Dans le diagnostic photodynamique (TED), la fluorescence de la porphyrine est utilisée pour distinguer les cellules cancéreuses des cellules normales6. Dans ce contexte, la protoporphyrine IX, une porphyrine fluorescente naturelle qui s’accumule dans les tumeurs lors de l’injection systémique ou locale de son précurseur, l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA), est utilisée pour identifier les tumeurs stromales gastro-intestinales, le cancer de la vessie et le cancer du cerveau 7,8. Plus récemment, le traitement au 5-ALA a été exploré comme approche pour détecter une maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple9. Notre laboratoire utilise la tétraarylporphyrine TCPP (5,10,15,20-tétrakis-(4-carboxyphényl)-21,23 H-porphine) pour sa capacité à colorer sélectivement les cellules cancéreuses du poumon et les cellules associées au cancer dans des échantillons d’expectorations humaines, une propriété qui a été exploitée dans les tests diagnostiques à base de lames et de cytométrie en flux10.

Certaines porphyrines sont bifonctionnelles en ce sens qu’elles peuvent être utilisées comme agents thérapeutiques et diagnostiques 2,11. Dans la recherche biomédicale, ces porphyrines bifonctionnelles sont utilisées pour évaluer comment leur capacité à cibler sélectivement et à tuer les cellules cancéreuses est fonction de leur structure ainsi que la façon dont elle est affectée par la présence d’autres composés 12,13,14,15,16. L’absorption cellulaire des porphyrines et leur cytotoxicité peuvent être mesurées sur une plate-forme cytométrique en flux de manière à haut débit. Les spectres d’absorption et d’émission des porphyrines fluorescentes sont complexes, mais la plupart des plateformes cytométriques en flux sont équipées pour les identifier correctement. Le spectre d’absorption des porphyrines fluorescentes est caractérisé par une forte bande d’absorption comprise entre 380 et 500 nm, connue sous le nom de bande Soret. Deux à quatre bandes d’absorption plus faibles sont généralement observées dans la gamme 500-750 nm (bandes Q)17. Un laser bleu de 488 nm, présent dans la plupart des cytomètres en flux, ou un laser violet (405 nm) peut générer une lumière de la longueur d’onde appropriée pour exciter les porphyrines. Les spectres d’émission des porphyrines affichent généralement des pics compris entre 600 et 800 nm18, ce qui entraîne très peu de chevauchement spectral avec l’isothiocyanate de fluorescéine ou les fluorophores de phycoérythrine (PE), mais un chevauchement considérable avec d’autres fluorophores souvent utilisés, tels que l’allophycocyanine (APC), ainsi que des fluorophores en tandem, tels que PE-Cy5 et autres. Par conséquent, lors de l’utilisation de porphyrines dans des essais de cytométrie en flux multicolore, les contrôles monofluorophores sont essentiels pour corriger adéquatement le débordement de la fluorescence dans des canaux autres que celui désigné pour mesurer la fluorescence de la porphyrine.

Idéalement, les témoins monofluorophores utilisés pour calculer la matrice de débordement pour un panel de fluorophores (également appelés « témoins de compensation ») devraient être constitués du même type de cellule que l’échantillon. Cependant, l’utilisation de l’échantillon à cette fin n’est pas optimale s’il y a très peu d’échantillon au départ ou si la population cible au sein de l’échantillon est très petite (par exemple, si l’on veut examiner une maladie résiduelle minimale ou des cellules cancéreuses aux premiers stades de la maladie). Une alternative utile aux cellules est les billes couplées avec le même fluorophore qui est utilisé pour analyser l’échantillon. Beaucoup de ces perles sont disponibles dans le commerce; Ces billes sont soit prémarquées avec le fluorophore désiré (billes spécifiques du fluorophore prémarquées)19,20, soit un anticorps marqué par fluorescence peut y être attaché (billes de capture d’anticorps)20,21. Bien que des billes de compensation commerciales soient disponibles pour de nombreux fluorophores, de telles billes ne sont pas disponibles pour les porphyrines, malgré leur utilisation croissante dans la recherche fondamentale et clinique.

En plus de la préservation des échantillons et des populations positives par rapport aux populations négatives de taille appropriée, les autres avantages de l’utilisation de billes comme contrôles compensatoires sont la facilité de préparation, la faible fluorescence de fond et l’excellente stabilité dans le temps22. L’inconvénient potentiel de l’utilisation de billes comme contrôle de compensation est que le spectre d’émission de l’anticorps fluorescent capturé sur les billes peut différer de celui du même anticorps utilisé pour marquer les cellules. Cela peut être d’une importance particulière lors de l’utilisation d’un cytomètre spectral20. Par conséquent, le développement de billes en tant que contrôle de compensation doit être effectué sur le cytomètre en flux qui sera utilisé pour le test pour lequel les billes sont développées. De plus, le développement des billes doit inclure une comparaison avec des cellules marquées avec le même réactif de coloration fluorescente.

Ici, nous décrivons la préparation de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par amine TCPP, dont l’intensité médiane de fluorescence dans le canal de détection était comparable à celle des cellules marquées TCPP dans les expectorations, et leur utilisation comme contrôles de compensation pour la cytométrie en flux. L’autofluorescence des billes équivalentes non fonctionnalisées était suffisamment faible pour être utilisée comme témoins de compensation de fluorescence négative. De plus, ces billes ont démontré une stabilité en stockage pendant près de 1 an.

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Protocol

Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation de la solution mère du TCPP, 1,0 mg/mL

NOTE: Cela peut être préparé mensuellement.

  1. À l’aide d’une balance analytique, d’une spatule et d’un papier de pesée, peser de 49,0 à 50,9 mg de RRCT. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. Mettez de côté la quantité mesurée de TCPP à l’abri de la lumière.
    REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
  2. Déterminer les quantités requises d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de TCPP pesée à l’étape 1.1 . Ajouter l’eau purifiée et l’isopropanol à un bécher en verre de 100 ml et couvrir de parafilm pour protéger de l’évaporation.
  3. Déterminer la quantité requise de bicarbonate de sodium à partir du tableau 1 en fonction de la quantité de RRCT pesée à l’étape 1.1 .
  4. À l’aide de la balance analytique, de la spatule et du papier de pesée, peser la quantité requise de bicarbonate de sodium déterminée à l’étape 1.3. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme.
    REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
  5. Ajouter le bicarbonate de sodium dans le bécher de 100 mL contenant de l’eau purifiée et de l’isopropanol. Couvrir la solution avec du parafilm pour protéger de l’évaporation.
  6. Placer la solution de l’étape 1.5 sur une plaque d’agitation et remuer jusqu’à dissolution (environ 10 min)
  7. Mesurer le pH pour s’assurer que la solution contenant du bicarbonate de sodium de l’étape 1.6 a un pH compris entre 9 et 10.
  8. Ajouter lentement le TCPP pesé à l’étape 1.1 à la solution de l’étape 1.7 et continuer à agiter jusqu’à dissolution (~30 min). Protéger de la lumière pendant cette étape.
  9. Conserver dans un contenant en verre ou en polypropylène à température ambiante et à l’abri de la lumière.

2. Préparation de l’acide 2-(N-morpholino)-éthanesulfonique (MES) et de la solution tampon de sel hémisodique, 0,1 M, pH 6,0-6,2 (« tampon MES »)

NOTE: Celui-ci doit être préparé le jour de l’utilisation et conservé à température ambiante.

  1. Pesez 2,50 g de sel hémisodique MES et ajoutez-le dans une bouteille en plastique de 150 mL.
  2. Ajouter 121 mL d’eau purifiée et dissoudre par agitation manuelle jusqu’à ce qu’aucun solide ne soit visible.
  3. Mesurer le pH du tampon MES pour s’assurer qu’il se situe entre 6 et 6,2.
  4. Conserver à température ambiante pour une utilisation le jour même.

3. N-(3-Diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) en poudre

  1. Sortez la poudre EDC du congélateur et laissez-la reposer à température ambiante jusqu’à utilisation à l’étape 5.

4. Combinaison de billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine avec une solution TCPP

  1. Ajouter 4,3 mL de la solution tampon MES 0,1 M préparée à l’étape 2 dans un tube en polypropylène de 15 mL.
  2. Vortex la suspension de billes de polystyrène fonctionnalisée à l’amine (10 μm, 2,5 % p/v) pendant 60 s à vitesse maximale.
  3. Ajouter 288 μL de cette suspension de billes fraîchement vortex au tampon MES à partir de l’étape 4.1.
  4. Vortex la solution MES/bille pendant 15 s à vitesse maximale.
  5. Vortex la solution TCPP à 1 mg/mL préparée à l’étape 1 pendant 60 s à vitesse maximale.
  6. Ajouter 1,20 mL de cette solution mère TCPP fraîchement vortée à la suspension MES/talon de l’étape 4.4.
  7. Vortex la suspension MES/perle/TCPP pendant 15 s à la vitesse maximale.
  8. Couvrir le tube avec du papier d’aluminium pendant la préparation de la solution EDC.

5. Préparation de solution mère d’hydrocholoride (HCl) de N-(3-diméthlyaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC)

REMARQUE : La solution EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.

  1. Ajouter 20,0 mL d’eau purifiée dans un nouveau tube conique de 50 mL.
  2. Peser 200 mg de HCl EDC à partir de l’étape 3 et l’ajouter à l’eau (étape 5.1).
  3. Vortex l’EDC HCL pendant 15 s à vitesse maximale pour générer une solution claire.

6. Préparation de la solution de travail HCl/MES d’EDC

REMARQUE : La solution HCl/MES d’EDC est périssable et doit être utilisée immédiatement après sa préparation.

  1. Ajouter 54,0 mL de solution tampon MES (préparée à l’étape 2) dans une bouteille de plastique de 150 mL.
  2. Ajouter 6,0 mL de la solution mère de HCl EDC (préparée à l’étape 5) à la solution tampon MES et mélanger en agitant pendant 10 s.

7. Étiquetage des billes avec le RRCT

  1. Ajouter 4,5 mL de solution de travail EDC (à partir de l’étape 6) au tube en polypropylène de 15 ml contenant les billes et le TCPP dans le tampon MES (étape 4.7).
  2. Placer le tube dans un rotateur inverseur à 35 tr/min pendant 16 h à température ambiante et à l’abri de la lumière.
  3. Centrifuger le tube à température ambiante pendant 10 min à 1 000 × g.
  4. Aspirer le surnageant et remettre les billes en suspension dans 0,8 mL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks.
  5. Transférer la solution de billes dans un flacon de polypropylène ambré à l’aide d’une pipette de 1 mL et conserver à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
    REMARQUE: Les perles sont stables pendant au moins 3 mois à ce stade.

8. Contrôle de la qualité (CQ) des billes du RRCT par cytométrie en flux

REMARQUE : Le CQ devrait être axé sur la question de savoir si l’intensité médiane de fluorescence (ICM) des billes du TCPP est suffisamment brillante pour l’utilisation prévue et la quantité de particules générées par la procédure. Voir la section des résultats représentatifs pour plus de détails.

  1. Étiquetez un tube en polystyrène de 5 ml comme « billes TCPP négatives ».
    REMARQUE: Les billes négatives sont différentes des perles fonctionnalisées aux amines utilisées pour l’étiquetage. Voir le tableau des matériaux.
  2. Étiquetez un autre tube comme « perles TCPP positives ».
  3. Étiquetez un autre tube comme « Perles arc-en-ciel ».
  4. Aliquote 300 μL d’HBSS glacé dans les tubes étiquetés avec « billes TCPP négatives » et « billes TCPP positives ».
  5. Ajoutez 500 μL de HBSS glacé dans le tube étiqueté « Perles arc-en-ciel ».
  6. Vortex brièvement la suspension de billes de polystyrène non fonctionnalisée (non étiquetée) à vitesse maximale (2-3 s) et ajoutez-en 10 μL dans le tube étiqueté « perles négatives TCPP ».
  7. Vortex la suspension de billes marquée TCPP (finalisée à l’étape 7.5) brièvement à la vitesse maximale, et ajoutez-en 3 μL dans le tube « Perles positives TCPP ».
  8. Faites un vortex de la suspension de perles arc-en-ciel brièvement à vitesse maximale et ajoutez-en deux gouttes dans le tube « Perles arc-en-ciel ».
  9. Gardez tous les tubes sur de la glace, couverts et protégés de la lumière.
  10. Initier les procédures de démarrage quotidiennes appropriées du cytomètre en flux et effectuer un contrôle qualité pour vérifier l’alignement optimal des fluides et du laser.
    NOTE: Pour cette partie du protocole, il est supposé que l’opérateur est formé à l’utilisation du cytomètre en flux disponible, y compris les procédures de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que les principes de base du calcul de la matrice de compensation correcte.
  11. Exécutez les perles Rainbow et les perles TCPP sans modifier les paramètres de tension entre les différentes exécutions.
    1. Courez et collectez 10 000 événements des perles arc-en-ciel.
    2. Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP négatives.
    3. Effectuez un rinçage à l’eau et recueillez 10 000 occurrences de billes TCPP-positives.
    4. Effectuer un rinçage à l’eau de 1 min.
      REMARQUE : Il est important d’effectuer un rinçage à l’eau après avoir utilisé les billes du RRCT. Si le TCPP n’est pas rincé à partir des lignes du cytomètre, il est possible que le TCPP résiduel puisse marquer les cellules dans le tube suivant à acquérir.
    5. Effectuez les protocoles de nettoyage et d’arrêt appropriés spécifiques aux instructions du fabricant pour le cytomètre.
      REMARQUE : Pour des résultats représentatifs, voir la figure 1.

9. Filtration des billes

REMARQUE : Si le CQ des billes par cytométrie en flux (étape 8) montre une forte proportion de particules (70 % ou plus), envisagez de filtrer la suspension du cordon en utilisant le protocole ci-dessous (Figure 2).

  1. Ajouter 3,20 mL de HBSS glacé à 0,8 mL de la suspension de billes de TCPP finalisée à l’étape 7.5 (créant une dilution quintuple).
  2. Vortex la suspension de billes diluées à vitesse maximale pendant 15 s.
  3. Retirez le piston d’une seringue jetable de 5 mL.
  4. Installez la seringue avec un filtre à embout en fibre de verre (5 μm, 13 mm de diamètre).
  5. Ajouter 4 mL de HBSS à la seringue.
  6. Ajouter 0,5 mL de la suspension de billes diluées vortex (étape 9.2).
  7. Utilisez le piston pour filtrer la suspension à travers la seringue/filtre à environ 2 gouttes/s.
  8. Lavez les billes en aspirant 5 ml d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre à environ 2 gouttes/s.
  9. Poussez à nouveau le HBSS dans le conteneur à déchets à environ 2 gouttes/s.
  10. Pour retirer les billes du filtre, aspirez 5 ml supplémentaires d’HBSS frais dans la seringue à travers le filtre.
  11. Retirez délicatement le filtre de la seringue.
  12. Éjecter la suspension du cordon de la seringue dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
  13. Replacez le filtre sur la seringue et répétez les étapes 9.10-9.12 quatre fois de plus. Jetez ensuite le filtre et la seringue.
  14. Répétez les étapes 9.2 à 9.13 jusqu’à ce que toutes les perles de l’étape 9.1 aient été filtrées. Utilisez une seringue neuve et filtrez à chaque fois.
  15. Centrifuger les suspensions filtrées de billes pendant 10 min à 1 000 × g à température ambiante.
  16. Aspirer le surnageant de chaque tube de 50 ml et remettre doucement les billes en suspension en les combinant dans 0,5 mL de HBSS frais.
  17. Transférer les billes à l’aide d’une micropipette p1 000 dans un nouveau flacon d’ambre, de verre ou de polypropylène et conserver à 4 °C.
  18. Répétez l’étape 8 pour déterminer si la proportion de particules liées au TCPP dans la suspension filtrée du cordon a diminué. Pour des résultats représentatifs, voir la figure 3.

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Representative Results

Ce protocole pour l’étiquetage TCPP des billes est relativement rapide et efficace. La figure 1 montre un résultat représentatif du processus d’étiquetage des billes du TCPP, déterminé par cytométrie en flux. La figure 1A montre le profil normalisé des perles arc-en-ciel, tel qu’il a été détecté dans le canal approprié pour détecter le TCPP. Ces billes servent de CQ pour la normalisation des tensions laser pour la détection du TCPP par le cytomètre en flux. La figure 1B montre le profil de diffusion de la lumière des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine, marquées par TCPP. La figure 1C montre le profil de diffusion de la lumière des billes non fonctionnalisées (perles non étiquetées); Nous les utilisons comme contrôle négatif pour calculer la matrice de compensation. La population indiquée par le rectangle rouge, qui est absent dans la suspension de billes non marquées, représente les particules liées au TCPP formées lorsque le TCPP est exposé au réactif de couplage EDC. Ces agrégats doivent être exclus lorsque l’intensité de fluorescence (FI) des billes est déterminée. La figure 1D montre l’IF des billes étiquetées, sélectionnées par la porte noire de la figure 1B, qui est nettement supérieure de plusieurs logs à la FI des perles non étiquetées (non étiquetées) (en comparant la figure 1D à la figure 1E).

La proportion de particules (c.-à-d. les événements indiqués par la porte rouge à la figure 1B) peut varier d’un lot d’étiquetage à l’autre. Pour la plupart des applications de cytométrie en flux standard, une suspension de billes avec 50% de particules ou moins permet de configurer correctement la compensation dans une expérience de cytométrie en flux multicolore utilisant TCPP. Il existe cependant des applications, par exemple, où l’analyse automatisée des données est utilisée, pour lesquelles un contenu en particules beaucoup plus élevé peut interférer avec les paramètres de compensation appropriés. Dans de tels cas, la filtration est recommandée (étape 9 du protocole et figure 2). La figure 3 montre l’effet de la filtration sur la suspension du cordon qui comprenait ~65 % de particules (panneaux de gauche de la figure 3A,B). Après filtration, la teneur en particules a diminué à ~12%. Les effets néfastes de la filtration sont une certaine perte de billes (non représentée) et une légère perte d’IF (figure 3C). Ces effets doivent être pris en compte lorsque la filtration de la suspension du cordon est envisagée. Une alternative à la filtration des billes pour réduire la teneur en particules consiste à modifier le rapport entre les billes, le TCPP et le réactif de couplage EDC. Cependant, les modifications de ces rapports affectent également l’IF des perles.

La relation entre la formation de particules, l’IMF et le rapport billes/TCPP/EDC est illustrée à la figure 4 et à la figure 5. La figure 4A et la figure 5A montrent l’IMF des billes étiquetées en fonction du rapport EDC/TCPP et du ratio TCPP/cordon, respectivement. Avec l’augmentation des ratios, l’IMF augmente jusqu’à ce qu’elle plafonne. Les exemples représentatifs de la figure 4B et de la figure 5B montrent que la teneur en particules augmente avec le rapport croissant respectif. Ce protocole d’étiquetage TCPP a été optimisé pour une IMF maximale tout en maintenant la teneur en particules aussi faible que possible (flèches dans les figures 4A et 5A). Les particules n’apparaissent que lorsque l’EDC est utilisé comme réactif de couplage pendant la procédure d’étiquetage. En utilisant uniquement des billes et le TCPP, les particules ne sont pas formées (non représentées), mais l’étiquetage des billes donne des billes avec un FI beaucoup plus faible (en comparant la figure 6A avec la figure 6B). Nous avons essayé de remplacer cette méthode de couplage basée sur l’EDC par une méthode basée sur un ester activé du NHS (N-hydroxysuccinimide) du TCPP23. Cependant, nous n’avons trouvé aucune différence significative dans l’IF utilisant cette méthode de couplage alternative par rapport à l’utilisation simultanée des billes et du TCPP, ce qui suggère qu’il existe une liaison covalente négligeable du TCPP aux billes avec cette méthode (en comparant la figure 6B avec la figure 6C).

Les données présentées dans toutes les figures jusqu’à présent ont été collectées à l’aide de billes de 10,6 μm de diamètre. Nous avons émis l’hypothèse que les billes plus grandes pourraient avoir plus de sites de liaison TCPP en raison de la surface accrue et pourraient donc afficher une FI plus élevée. Inversement, nous avons émis l’hypothèse que les billes plus petites avec des surfaces plus petites et moins de sites de liaison TCPP devraient présenter un FI plus faible. En utilisant le même protocole d’étiquetage que celui décrit ici, mais avec des billes de 8,6 μm ou des billes de 20 μm (au lieu de perles de 10,6 μm), nous avons trouvé la réduction prévue de l’IF dans les billes de 8,6 μm par rapport aux billes de 10,6 μm (en comparant la figure 6D avec la figure 6A). Les billes de 20 μm présentaient un IF hors de l’échelle du cytomètre en flux que nous avons utilisé (données non présentées), mais ces billes plus grosses se sont dépossédées rapidement par la suite et n’ont pas été poursuivies.

Ce protocole de marquage des billes avec TCPP a été développé dans le but de disposer d’un outil de compensation fiable dans les expériences de cytométrie en flux où TCPP est utilisé pour marquer les cellules. Dans le passé, nous utilisions des cellules A549 à cette fin24, mais la procédure d’étiquetage n’aboutissait pas toujours à un FI élevé. De plus, les cellules, même après fixation, ne pouvaient pas être utilisées pendant plus de 1 mois. Le protocole d’étiquetage des billes (10,6 μm) avec TCPP décrit ici a systématiquement donné lieu à des billes tachées de vif, comme le montre la figure 1. De plus, lorsque les mêmes billes marquées TCPP ont été testées par cytométrie en flux après 300 jours, nous n’avons pas observé de changement significatif dans l’IMF ni dans la teneur en particules (Figure 7). Le couplage du TCPP aux billes a eu peu d’effet sur son spectre d’émission de fluorescence (figure 8A; comparaison de la ligne noire pointillée à la ligne noire continue, qui représente le spectre d’émission de fluorescence du TCPP en solution). Le spectre d’émission de fluorescence des billes marquées par TCPP différait davantage du spectre du TCPP mesuré à l’intérieur des cellules cancéreuses du poumon A549, en particulier autour des longueurs d’onde de 700 à 725 nm (Figure 8A; ligne noire pointillée par rapport à la ligne orange, respectivement). Cependant, avec la capacité de compenser le signal TCPP des autres signaux dans un échantillon d’expectorations marquées par plusieurs fluorophores, les billes marquées TCPP fonctionnaient aussi bien que les cellules A549 colorées TCPP (en comparant la figure 8B avec la figure 8C, respectivement).

Le. Les fichiers LMD se trouvent dans le FlowRepository (https://flowrepository.org), sous les ID FR-FCM-Z6ZP (Figure 1) ; FR-FCM-Z5UJ (figure 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (figure 4B); FR-FCM-Z6ZS (figure 5B); FR-FCM-Z6ZB (Figure 6); FR-FCM-Z6Y5 (figure 8B); et FR-FCM-Z6ZT (figure 8C).

Figure 1
Figure 1 : Contrôle de la qualité des billes étiquetées avec le TCPP. (A) Perles arc-en-ciel. L’histogramme des perles arc-en-ciel détectées dans le canal spécifique au fluorophore APC est présenté. Ce canal peut également être utilisé pour détecter la fluorescence TCPP. Les perles arc-en-ciel servent de QC pour le laser APC; Les premier et quatrième sommets devraient se situer dans la région indiquée par les parenthèses respectives. (B, D) Perles étiquetées TCPP. (C,E) Perles non étiquetées. Cet échantillon particulier de solution de billes marquées par TCPP comprenait 51,9 % de billes (porte rectangulaire noire en B). Les événements dans le rectangle rouge représentent les particules qui se sont formées lors de l’étiquetage TCPP. Ces particules étaient absentes dans la solution de billes non étiquetées (en comparant les rectangles rouges en B et C). Les intensités de fluorescence des billes marquées et non marquées par TCPP sont présentées en D et E, respectivement. Abréviations : SSC = dispersion latérale; FSC = diffusion vers l’avant; APC = allophycocyanine; TCPP = méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la méthode de filtrage des billes utilisée dans les étapes du protocole 9.3 à 9.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effets de la filtration sur les particules et l’intensité de fluorescence. (A) Images microscopiques de billes de 10 μm marquées avec TCPP avant (photo de gauche) et après filtration (image de droite). Les images ont été prises à une amplification 20x. Barre d’échelle = 20 μm. (B) La suspension de billes du TCPP avant filtration (profil de gauche) comprenait 25,6 % de billes (rectangle noir) et 65,7 % de débris ou de particules (rectangle rouge). La proportion de billes dans la suspension a augmenté à 74,7% après filtration (profil droit; rectangle noir), et les débris ont diminué à 11,9%. (C) Histogrammes de l’IFR du RRCT des billes identifiées à la section B. L’histogramme de gauche représente les billes marquées TCPP avant filtration, avec un FI légèrement supérieur à celui des billes après filtration (histogramme à droite). Les lignes rouges, placées à un FI de 1 × 103 dans les deux figures, doivent faciliter la comparaison des deux histogrammes. Abréviations : SSC = dispersion latérale; FSC = diffusion vers l’avant; APC = allophycocyanine; TCPP = méso-tétra(4-carboxyphényl)porphine; FI = intensité de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Relation entre le rapport EDC/TCPP, l’intensité médiane de fluorescence (ICM) et la formation de particules. (A) La relation entre le rapport EDC/TCPP utilisé dans le protocole d’étiquetage des billes et l’IMF des billes marquées TCPP qui en découlent. La courbe montre l’IMF moyenne de trois expériences indépendantes ± écart-type (ET). La flèche rouge (3,75) indique le rapport volumétrique des solutions EDC et TCPP utilisées dans ce protocole. (B) Profils représentatifs de diffusion de la lumière des suspensions de billes préparées avec les rapports EDC/TCPP comme indiqué ci-dessus de chaque profil. Tous les profils sont dérivés de la même expérience. Les perles sont indiquées par le rectangle noir. La formation de particules, indiquée par les rectangles rouges, augmente avec l’augmentation des rapports EDC/TCPP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Relation entre le ratio TCPP/billes, l’IMF et la formation de particules. (A) La relation entre le rapport volumétrique TCPP/billes utilisé dans le protocole d’étiquetage des billes et l’IMF des billes marquées TCPP qui en découlent est présentée. L’IMF augmente rapidement, atteignant une phase de plateau après un ratio TCPP/billes de 2. La courbe montre l’IMF moyenne de trois expériences indépendantes ± écart-type (ET). La flèche rouge (4,17) indique le ratio utilisé dans ce protocole. (B) Profils représentatifs de diffusion de la lumière des suspensions de billes préparées avec les rapports TCCP/billes comme indiqué ci-dessus de chaque profil. Tous les profils sont dérivés de la même expérience. Les perles sont indiquées par les rectangles noirs. La formation de particules, indiquée par les rectangles rouges, augmente avec l’augmentation des rapports TCPP/cordon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison des méthodes d’accouplement et des tailles de cordons utilisées. Les histogrammes de l’intensité de fluorescence des billes marquées avec TCPP sont montrés. (A) Les billes de 10,6 μm ont été étiquetées conformément au protocole fourni, y compris l’utilisation du réactif de couplage EDC. (B) La même chose que (A), mais EDC a été omise pendant le protocole d’étiquetage. (C) Les billes de 10,6 μm ont été étiquetées à l’aide de l’ester NHS, selon la méthode décrite par Kabe et al.23. (D) Identique à (A), mais au lieu de billes de 10,6 μm, des billes de 8,6 μm ont été utilisées. Les lignes rouges verticales de chaque profil sont fixées arbitrairement à 1 × 103 pour faciliter les comparaisons entre les histogrammes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Stabilité des billes du RRCT au fil du temps. Les billes marquées TCPP (10 μm) ont été étiquetées conformément au protocole, conservées au réfrigérateur à 4 °C et conservées dans l’obscurité. Le jour 0 est le jour de l’étiquetage. À divers moments par la suite, les aliquotes des billes stockées ont été réanalysées par cytométrie en flux. Les mesures de l’IMF (A) et du pourcentage de particules (B) présentées par rapport à la valeur du jour 0, qui a été fixée arbitrairement à 100%. Les lignes horizontales orange représentent les valeurs 10 % au-dessus et 10 % au-dessous de celles du jour 0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Les billes TCPP comparées aux cellules colorées TCPP comme outils de compensation. (A) Les spectres d’émission de fluorescence du TCCP en solution, du TCPP couplé à des billes et du TCPP après coloration des cellules cancéreuses du poumon A549 ont été mesurés sur un lecteur de microplaques. Les spectres d’émission des TCPP solubles et liés aux billes sont très similaires. Les deux diffèrent de celle des cellules A549 marquées autour de la longueur d’onde de 700 nm. (B, C). Un échantillon d’expectorations a été transformé en cellules uniques et marqué avec plusieurs fluorophores : AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) et TCPP (FL6). Pour chaque fluorophore, nous avons préparé des tubes de contrôle unicolores contenant des billes couplées au fluorophore correspondant. Pour le TCPP, deux tubes de contrôle ont été mis en place : l’un avec des billes marquées TCPP et l’autre avec des cellules A549 fixes marquées avec TCPP. Cela nous a permis de créer deux matrices de compensation : (B) une dans laquelle les billes marquées TCPP ont été utilisées comme contrôle de compensation pour TCPP (FL-6) et (C) une dans laquelle des cellules A549 marquées TCPP ont été utilisées. Ces deux matrices de compensation sont très semblables, la plus grande différence de compensation liée au RRCT étant entre le RRCT (FL6) et le RRCT-3. Les diagrammes à points qui les accompagnent et qui affichent ces paramètres particuliers présentent des profils presque identiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Réactifs requis pour la solution mère du RRCT. Les quantités de NaHCO3, d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) sont basées sur la quantité de TCPP pesée à l’étape 1.1 (entre 49,0 mg et 50,9 mg). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Malgré les nombreuses applications des porphyrines dans le diagnostic et la thérapeutique du cancer2, il existe peu de littérature sur leur utilisation potentielle comme réactif cytométrique en flux pour l’identification des populations de cellules cancéreuses par rapport aux populations de cellules non cancéreuses dans les tissus humains primaires24,25,26. Nos recherches sur l’analyse cytométrique en flux des expectorations humaines24,27 nécessitent la coloration des cellules d’expectorations dissociées avec TCPP et plusieurs autres fluorophores. Cependant, le débordement de fluorescence du TCPP dans les canaux de détection désignés pour d’autres fluorophores signifiait qu’un cordon marqué TCPP était nécessaire comme contrôle de compensation. Cependant, aucune perle de ce type n’était disponible dans le commerce et a dû être développée. La fixation de porphyrines tétraaryliques à des tamis moléculaires à base de dioxyde de silicium28,29 a été rapportée. Cependant, les particules à base de dioxyde de silicium se sont révélées inappropriées pour la préparation des étalons de cytométrie en flux (données non présentées). Par conséquent, nos études se sont concentrées sur les billes de polystyrène.

Une solution de TCPP dans de l’eau isopropanol (1:1 v/v)30 a marqué les billes de polystyrène à pH 6, mais l’IMF était trop faible par rapport aux cellules colorées dans notre essai. Nous avons exploré la modification covalente des billes comme moyen d’augmenter l’IMF. La modification covalente des billes de latex fonctionnalisées par amine avec l’ester NHS du TCPP par amidation a déjà été décrite par Kabe et coll.23 à l’aide de billes non commerciales de 2 μmde diamètre 31. Dans l’étude de Kabe et coll.23, le TCPP a été incubé dans du DMF avec du N-hydroxysuccinimide (NHS)32 pendant 5 heures pour préparer un monoester activé du TCPP dans le NHS. Cette solution d’ester activé a ensuite été mise à réagir avec des billes contenant un agent de liaison amine terminal. Cependant, lorsque nous avons appliqué ce protocole à des billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines commerciales, l’étiquetage a abouti à des billes avec une IMF insuffisamment brillante pour la compensation. Par conséquent, nous avons exploré l’amidation directe des billes de polystyrène amine sans utiliser d’intermédiaire ester NHS.

Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines ont été traitées avec du TCPP en présence du réactif de couplage amide EDC pour générer des liaisons amides entre les groupes aminés sur les billes et les groupes carboxy sur le TCPP. L’EDC a été choisi en raison de sa solubilité aqueuse, de son utilité avérée dans les réactions d’amidation aqueuse sur une large plage de pH, de son faible coût et de ses sous-produits solubles dans l’eau33,34. Nous avons réagi avec des billes de polystyrène amine de diamètre de 8,6 μm, 10,6 μm et 20 μm avec TCPP et EDC dans de l’eau à pH 6. Des études antérieures ont indiqué que le TCPP reste soluble à ce pH, et ce pH est également compatible avec EDC33. Les billes de 8,6 μm marquées ont donné une IMF trop faible pour notre test. Les billes de 20 μm avaient une IMF suffisamment élevée mais étaient sujettes à se déposer hors de la suspension et à obstruer le cytomètre en flux (non représenté). Les billes de 10,6 μm avaient une IMF adéquate, restaient en suspension assez longtemps pour l’analyse par cytométrie en flux et étaient donc optimisées en tant que normes de compensation. Notamment, les billes équivalentes non marquées avaient une faible fluorescence de fond et pouvaient être utilisées comme billes de contrôle négatif pour la compensation.

L’augmentation du rapport de réactif volumétrique EDC / TCPP tout en maintenant la quantité de billes constante a augmenté l’IMF du cordon jusqu’à ce qu’un plateau soit atteint à un rapport d’environ 2. Un plateau d’IFM a également été observé lorsque le ratio TCPP/billes a augmenté tout en maintenant le ratio EDC/TCPP constant. Étant donné que le TCPP a étiqueté les billes en l’absence d’EDC, le plateau de l’IMF peut être le résultat de sites de liaison covalents et non covalents saturés à la surface du cordon. Un sous-produit particulaire lié au TCPP a été observé lorsque la PE et le TCPP ont été combinés à pH 6. Cette particule avait un spectre de fluorescence similaire à celui du TCPP, mais ne s’est pas formée en l’absence de perturbateurs endocriniens, ce qui suggère qu’il s’agit d’un sous-produit insoluble de la réaction de l’EDC avec le TCPP. Les particules avaient une forme irrégulière et, bien que généralement inférieures à 5 μm, pouvaient former des agrégats plus gros et pouvaient également adhérer à la surface des billes. Des particules liées au TCPP ont également été observées lorsque des billes de polystyrène amine ont réagi avec le TCPP et l’EDC. La quantité de particules augmentait avec un rapport EDC/TCPP plus élevé et un ratio TCPP/billes plus élevé. Les ratios de réactifs sélectionnés dans le protocole final sont essentiels au succès de la procédure d’étiquetage des billes, car ils garantissent que la suspension de billes résultante a une IMF élevée tandis que le niveau de particules reste acceptable. Le niveau de particules produites dans le présent protocole n’exclut pas l’utilisation de billes TCPP pour la compensation, mais des niveaux plus élevés de particules peuvent nuire à la précision des paramètres de compensation35. Nous avons également développé une procédure de filtration qui peut réduire considérablement le niveau de particules si celles-ci sont présentes à un niveau élevé.

Nous avons mené notre réaction à l’aide d’un agitateur rotatif. Le fait de ne pas agiter la réaction entraîne une coloration plus lente (données non présentées). Un temps de réaction de 16 heures est recommandé. Des temps de réaction plus longs (>24 h) entraînent des niveaux plus élevés de particules TCPP, tandis que des temps de réaction plus courts (<8 h) entraînent une IMF à billes plus faible. Pour le contrôle des billes non étiquetées, nous n’avons pas utilisé de billes fonctionnalisées aux amines qui n’étaient pas étiquetées avec TCPP parce que l’autofluorescence des billes non marquées interférait avec le calcul correct des matrices de compensation. Au lieu de cela, nous avons utilisé des perles de polystyrène non fonctionnalisées similaires en termes de fabrication et de taille. De plus, nous avons conservé les perles non étiquetées et étiquetées TCPP dans des tubes séparés. Avec les deux ensembles de billes dans le même tube, nous avons observé un certain transfert de TCPP vers les billes non étiquetées (données non présentées), ce qui a provoqué un décalage à droite dans l’IMF qui a empêché le calcul correct de la matrice de compensation.

En résumé, les points critiques pour obtenir une IMF élevée des billes marquées TCPP sont les ratios de réactifs utilisés pendant la réaction de coloration, le moment de la réaction de coloration et le diamètre des billes non marquées. Dans ce travail, le protocole décrit ci-dessus offrait des billes colorées TCPP qui étaient de taille appropriée pour être utilisées dans un cytomètre en flux et qui étaient suffisamment fluorescentes pour la compensation. Les billes colorées TCPP n’ont pas perdu d’IMF significative à 4 °C pendant 300 jours. Le spectre de fluorescence des billes TCPP était comparable à celui des billes TCPP en solution. De plus, les matrices de compensation calculées avec des billes marquées TCPP et des cellules A549 colorées ont généré des profils d’expectorations pratiquement identiques dans notre essai, démontrant l’utilité de ces perles.

Ce protocole décrit la préparation des billes de compensation TCPP qui ont été utiles sur l’instrument Navios EX, mais ces mêmes billes peuvent ne pas fonctionner sur un instrument différent avec une sensibilité différente36 et une configuration de détecteur différente20. Cependant, ce travail suggère des moyens de moduler la fluorescence à travers la taille du cordon et le rapport de réactif. Le TCPP n’est qu’une des nombreuses porphyrines fluorescentes qui ont démontré une sélectivité des cellules cancéreuses in vitro et in vivo 2,37,38,39. Les porphyrines fluorescentes ne peuvent pas toutes se lier aux billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines utilisées dans le présent protocole. En fait, l’utilisation de ces billes est limitée aux porphyrines qui contiennent un acide carboxylique. La coloration différentielle de diverses populations cellulaires dans des échantillons de tissus humains avec des porphyrines, mesurée par cytométrie en flux, pourrait donner un aperçu du développement précoce du cancer, de sa progression et de son pronostic. L’utilisation d’autres porphyrines pour colorer des échantillons de tissus humains et leur analyse par cytométrie en flux, en utilisant des billes de contrôle appropriées comme normes de compensation, est une orientation intéressante pour la poursuite des recherches.

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Disclosures

Tous les auteurs sont des employés de bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation des figures et Precision Pathology Services (San Antonio, TX) pour l’utilisation de son cytomètre en flux Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 193 cytométrie en flux contrôle de compensation fluorophore marquage billes fonctionnalisées aux amines amidation porphyrine
Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux
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Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

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