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Chemistry

Porphyrin-modifizierte Beads zur Verwendung als Kompensationskontrollen in der Durchflusszytometrie

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Das Protokoll beschreibt, wie Porphyrin-basierte Kompensationsbeads für die Durchflusszytometrie durch die Reaktion von Amin-funktionalisierten Polystyrol-Beads mit dem Porphyrin TCPP und dem Amid-Kupplungsreagenz EDC hergestellt werden. Ein Filtrationsverfahren wird eingesetzt, um die partikulären Nebenprodukte zu reduzieren.

Abstract

Die Durchflusszytometrie kann verschiedene Zellpopulationen auf der Grundlage von Fluoreszenzmessungen schnell charakterisieren und quantifizieren. Die Zellen werden zunächst mit einem oder mehreren fluoreszierenden Reagenzien gefärbt, die jeweils mit einem anderen fluoreszierenden Molekül (Fluorophor) funktionalisiert werden, das aufgrund ihrer phänotypischen Eigenschaften, wie z. B. der Antigenexpression auf der Zelloberfläche, selektiv an Zellen bindet. Die Intensität der Fluoreszenz von jedem Reagenz, das an Zellen gebunden ist, kann auf dem Durchflusszytometer mit Kanälen gemessen werden, die einen bestimmten Wellenlängenbereich erfassen. Wenn mehrere Fluorophore verwendet werden, schwappt das Licht einzelner Fluorophore oft in unerwünschte Detektionskanäle über, was eine Korrektur der Fluoreszenzintensitätsdaten in einem Prozess erfordert, der als Kompensation bezeichnet wird.

Kompensationskontrollpartikel, in der Regel Polymerkügelchen, die an einen einzelnen Fluorophor gebunden sind, werden für jeden Fluorophor benötigt, der in einem Zellmarkierungsexperiment verwendet wird. Daten von Kompensationspartikeln aus dem Durchflusszytometer werden verwendet, um eine Korrektur der Fluoreszenzintensitätsmessungen vorzunehmen. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Aufreinigung von Polystyrol-Kompensationskügelchen, die kovalent mit dem fluoreszierenden Reagenz Meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphin (TCPP) funktionalisiert sind, und deren Anwendung in der Durchflusszytometrie-Kompensation. In dieser Arbeit wurden aminfunktionalisierte Polystyrolkügelchen mit TCPP und dem Amid-Kupplungsreagenz EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid) bei pH 6 und bei Raumtemperatur für 16 h unter Rühren behandelt. Die TCPP-Beads wurden durch Zentrifugation isoliert und zur Lagerung in einem pH-7-Puffer resuspendiert. TCPP-bedingte Partikel wurden als Nebenprodukt beobachtet. Die Anzahl dieser Partikel könnte durch ein optionales Filtrationsprotokoll reduziert werden. Die daraus resultierenden TCPP-Beads wurden erfolgreich auf einem Durchflusszytometer zur Kompensation in Experimenten mit humanen Sputumzellen eingesetzt, die mit mehreren Fluorophoren markiert waren. Die TCPP-Kügelchen erwiesen sich nach 300-tägiger Lagerung im Kühlschrank als stabil.

Introduction

Porphyrine sind aufgrund ihrer Fluoreszenz- und Tumor-Targeting-Eigenschaften seit vielen Jahren im biomedizinischen Bereich von Interesse 1,2,3. Therapeutische Anwendungen wie die photodynamische Therapie (PDT) und die sonodynamische Therapie (SDT) beinhalten die systemische Verabreichung eines Porphyrins an einen Krebspatienten, die Akkumulation des Medikaments im Tumor und die lokale Exposition des Tumors mit einem Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge oder Ultraschall. Die Bestrahlung mit Laserlicht oder Ultraschall führt zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch das Porphyrin und in der Folge zum Zelltod 4,5. In der photodynamischen Diagnostik (PDD) wird die Porphyrinfluoreszenz verwendet, um Krebszellen von normalen Zellen zu unterscheiden6. In diesem Zusammenhang wird Protoporphyrin IX, ein natürliches fluoreszierendes Porphyrin, das sich bei systemischer oder lokaler Injektion seiner Vorstufe, der 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), in Tumoren anreichert, zur Identifizierung von gastrointestinalen Stromatumoren, Blasenkrebs und Hirntumoren verwendet 7,8. In jüngerer Zeit wurde die 5-ALA-Behandlung als Ansatz zur Erkennung einer minimalen Resterkrankung beim Multiplen Myelomuntersucht 9. Unser Labor verwendet das Tetraarylporphyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphin) wegen seiner Fähigkeit, selektiv Lungenkrebszellen und krebsassoziierte Zellen in menschlichen Sputumproben zu färben, eine Eigenschaft, die in objektträgerbasierten und durchflusszytometrischen diagnostischen Assays ausgenutzt wurde10.

Einige Porphyrine sind insofern bifunktional, als sie als therapeutische und diagnostische Mittel eingesetzt werden können 2,11. In der biomedizinischen Forschung werden solche bifunktionalen Porphyrine verwendet, um zu bewerten, wie ihre Fähigkeit, Krebszellen selektiv anzugreifen und abzutöten, von ihrer Struktur abhängt und wie sie durch das Vorhandensein anderer Verbindungen beeinflusst wird 12,13,14,15,16. Sowohl die zelluläre Aufnahme von Porphyrinen als auch ihre Zytotoxizität können auf einer durchflusszytometrischen Plattform im Hochdurchsatz gemessen werden. Die Absorptions- und Emissionsspektren von fluoreszierenden Porphyrinen sind komplex, aber die meisten durchflusszytometrischen Plattformen sind in der Lage, sie korrekt zu identifizieren. Das Absorptionsspektrum fluoreszierender Porphyrine zeichnet sich durch eine starke Absorptionsbande im Bereich von 380-500 nm aus, die als Soret-Bande bezeichnet wird. Zwei bis vier schwächere Absorptionsbanden werden im Allgemeinen im Bereich von 500-750 nm (Q-Banden) beobachtet17. Ein blauer 488-nm-Laser, der in den meisten Durchflusszytometern vorhanden ist, oder ein violetter Laser (405 nm) können Licht der entsprechenden Wellenlänge erzeugen, um Porphyrine anzuregen. Die Emissionsspektren von Porphyrinen zeigen typischerweise Spitzen im Bereich von 600-800 nm18, was zu einer sehr geringen spektralen Überlappung mit Fluoresceinisothiocyanat- oder Phycoerythrin (PE)-Fluorophoren, aber zu einer erheblichen Überlappung mit anderen häufig verwendeten Fluorophoren, wie Allophycocyanin (APC), sowie Tandem-Fluorophoren, wie PE-Cy5 und anderen, führt. Daher sind bei der Verwendung von Porphyrinen in mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Assays Einzelfluorophorkontrollen unerlässlich, um den Spillover der Fluoreszenz in anderen Kanälen als dem, der für die Messung der Fluoreszenz des Porphyrins vorgesehen ist, angemessen zu korrigieren.

Idealerweise sollten die Einzelfluorophor-Kontrollen, die zur Berechnung der Spillover-Matrix für ein Panel von Fluorophoren verwendet werden (auch "Kompensationskontrollen" genannt), aus denselben Zelltypen wie die Probe bestehen. Die Verwendung der Probe für diesen Zweck ist jedoch nicht optimal, wenn es zunächst nur sehr wenige Proben gibt oder wenn die Zielpopulation innerhalb der Probe sehr klein ist (z. B. wenn man minimale Resterkrankungen oder Krebszellen in frühen Stadien der Krankheit betrachten möchte). Eine nützliche Alternative zu Zellen sind Beads, die mit demselben Fluorophor gekoppelt sind, der zur Analyse der Probe verwendet wird. Viele dieser Perlen sind im Handel erhältlich; Diese Beads sind entweder mit dem gewünschten Fluorophor vormarkiert (vormarkierte Fluorophor-spezifische Beads)19,20, oder es kann ein fluoreszenzmarkierter Antikörper an sie angehängt werden (Antibody Capture Beads)20,21. Während für viele Fluorophore kommerzielle Kompensationskügelchen zur Verfügung stehen, sind solche Beads für Porphyrine trotz ihres zunehmenden Einsatzes in der Grundlagen- und klinischen Forschung nicht verfügbar.

Neben der Probenkonservierung und der angemessenen Größe positiver und negativer Populationen sind die weiteren Vorteile der Verwendung von Beads als Kompensationskontrollen die einfache Präparation, die geringe Hintergrundfluoreszenz und die ausgezeichnete Stabilität über die Zeit22. Der potenzielle Nachteil der Verwendung von Beads als Kompensationskontrolle besteht darin, dass sich das Emissionsspektrum des fluoreszierenden Antikörpers, der auf Beads eingefangen wird, von dem desselben Antikörpers unterscheiden kann, der zur Markierung der Zellen verwendet wird. Dies kann bei Verwendung eines spektralen Durchflusszytometers20 von besonderer Bedeutung sein. Daher muss die Entwicklung von Beads als Kompensationskontrolle auf dem Durchflusszytometer durchgeführt werden, das für den Assay verwendet wird, für den die Beads entwickelt werden. Darüber hinaus muss die Entwicklung der Kügelchen einen Vergleich mit Zellen beinhalten, die mit demselben fluoreszierenden Färbereagenz markiert sind.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Herstellung von TCPP-Amin-funktionalisierten Polystyrol-Kompensationsbeads, deren mediane Fluoreszenzintensität im Detektionskanal mit der von TCPP-markierten Zellen im Sputum vergleichbar war, und deren Verwendung als Kompensationskontrollen für die Durchflusszytometrie. Die Autofluoreszenz von äquivalenten, nicht-funktionalisierten Beads war niedrig genug, um sie als negative Fluoreszenzkompensationskontrollen zu verwenden. Darüber hinaus zeigten diese Perlen eine Lagerstabilität von fast 1 Jahr.

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Protocol

Alle Verfahren müssen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

1. Herstellung der TCPP-Stammlösung, 1,0 mg/ml

HINWEIS: Dies kann monatlich erstellt werden.

  1. Wiegen Sie mit einer Analysenwaage, einem Spatel und einem Wiegepapier 49,0 bis 50,9 mg TCPP ab. Runden Sie das Gewicht auf 1/10 Milligramm. Stellen Sie die gemessene Menge an TCPP lichtgeschützt beiseite.
    Anmerkungen: Verwenden Sie eine statische Pistole, wenn die Gewichtsanzeige instabil ist.
  2. Bestimmen Sie die erforderlichen Mengen an gereinigtem Wasser und Isopropanol (IPA) aus Tabelle 1 auf der Grundlage der in Schritt 1.1 gewogenen TCPP-Menge. Geben Sie das gereinigte Wasser und Isopropanol in ein 100-ml-Glasbecherglas und bedecken Sie es mit Parafilm, um es vor Verdunstung zu schützen.
  3. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Natriumbicarbonat aus Tabelle 1 auf der Grundlage der in Schritt 1.1 gewogenen TCPP-Menge.
  4. Wiegen Sie mit der Analysenwaage, dem Spatel und dem Wiegepapier die in Schritt 1.3 ermittelte erforderliche Menge an Natriumbicarbonat ab. Runden Sie das Gewicht auf 1/10 Milligramm.
    Anmerkungen: Verwenden Sie eine statische Pistole, wenn die Gewichtsanzeige instabil ist.
  5. Geben Sie das Natriumbicarbonat in das 100-ml-Becherglas mit gereinigtem Wasser und Isopropanol. Decken Sie die Lösung mit Parafilm ab, um sie vor Verdunstung zu schützen.
  6. Geben Sie die Lösung aus Schritt 1.5 auf eine Rührplatte und rühren Sie, bis sie sich aufgelöst hat (ca. 10 min)
  7. Messen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass die natriumbicarbonathaltige Lösung aus Schritt 1.6 einen pH-Wert zwischen 9 und 10 hat.
  8. Fügen Sie das in Schritt 1.1 gewogene TCPP langsam zur Lösung aus Schritt 1.7 hinzu und rühren Sie weiter, bis es sich aufgelöst hat (~30 min). Schützen Sie sich während dieses Schritts vor Licht.
  9. In einem Glas- oder Polypropylenbehälter bei Raumtemperatur und lichtgeschützt aufbewahren.

2. Herstellung von 2-(N-Morpholino )-ethansulfonsäure (MES) und Heminatriumsalz-Pufferlösung, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("MES-Puffer")

Anmerkungen: Dies muss am Tag der Verwendung zubereitet und bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

  1. Wiegen Sie 2,50 g MES-Heminatriumsalz ab und geben Sie es in eine 150-ml-Plastikflasche.
  2. Fügen Sie 121 ml gereinigtes Wasser hinzu und lösen Sie es durch manuelles Schütteln auf, bis kein Feststoff mehr sichtbar ist.
  3. Messen Sie den pH-Wert des MES-Puffers, um sicherzustellen, dass er zwischen 6 und 6,2 liegt.
  4. Bei Raumtemperatur aufbewahren, um am selben Tag verwendet zu werden.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC)-Pulver

  1. Nehmen Sie das EDC-Pulver aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es bis zur Verwendung in Schritt 5 bei Raumtemperatur ruhen.

4. Kombination von Amin-funktionalisierten Polystyrolkügelchen mit TCPP-Lösung

  1. Geben Sie 4,3 ml der in Schritt 2 hergestellten 0,1 m MES-Pufferlösung in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen.
  2. Wirbeln Sie die Amin-funktionalisierte Polystyrol-Kügelchensuspension (10 μm, 2,5 % w/v) für 60 s bei maximaler Geschwindigkeit.
  3. Geben Sie 288 μl dieser frisch gewirbelten Perlensuspension in den MES-Puffer aus Schritt 4.1.
  4. Wirbeln Sie die MES/Wulst-Lösung 15 s lang bei maximaler Geschwindigkeit.
  5. Die in Schritt 1 hergestellte 1 mg/ml TCPP-Lösung wird 60 s lang bei maximaler Geschwindigkeit aufgewirbelt.
  6. Geben Sie 1,20 ml dieser frisch vortexed TCPP-Stammlösung in die MES/Bead-Suspension aus Schritt 4.4.
  7. Wirbeln Sie die MES-/Wulst-/TCPP-Aufhängung 15 s lang bei maximaler Geschwindigkeit auf.
  8. Decken Sie das Röhrchen mit Folie ab, während die EDC-Lösung zubereitet wird.

5. Herstellung von N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid (EDC)-hydrocholorid (HCl) Stammlösung

Anmerkungen: Die EDC-Lösung ist verderblich und sollte sofort nach der Zubereitung verwendet werden.

  1. Geben Sie 20,0 ml gereinigtes Wasser in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen.
  2. Wiegen Sie 200 mg EDC HCl aus Schritt 3 ab und geben Sie es in das Wasser (Schritt 5.1).
  3. Wirbeln Sie die EDC HCL 15 s lang mit maximaler Geschwindigkeit auf, um eine klare Lösung zu erzeugen.

6. Vorbereitung der EDC HCl/MES-Arbeitslösung

HINWEIS: Die EDC HCl/MES-Lösung ist verderblich und sollte sofort nach der Zubereitung verwendet werden.

  1. Geben Sie 54,0 ml MES-Pufferlösung (hergestellt in Schritt 2) in eine 150-ml-Plastikflasche.
  2. 6,0 ml der EDC-HCl-Stammlösung (hergestellt in Schritt 5) in die MES-Pufferlösung geben und 10 s lang unter Schütteln mischen.

7. Beschriftung der Perlen mit TCPP

  1. Geben Sie 4,5 ml EDC-Arbeitslösung (aus Schritt 6) in das 15-ml-Polypropylenröhrchen, das die Perlen und TCPP in MES-Puffer enthält (Schritt 4.7).
  2. Legen Sie das Rohr für 16 h bei Raumtemperatur und lichtgeschützt in einen Umkehrrotator bei 35 U/min.
  3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 min bei 1.000 × g.
  4. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Beads in 0,8 ml Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS).
  5. Übertragen Sie die Perlenlösung mit einer 1-ml-Pipette in eine durchstechflasche aus braunem Polypropylen und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
    HINWEIS: Die Perlen sind zu diesem Zeitpunkt mindestens 3 Monate haltbar.

8. Qualitätskontrolle (QC) der TCPP-Beads mittels Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die Qualitätskontrolle sollte sich darauf konzentrieren, ob die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der TCPP-Kügelchen für ihren Verwendungszweck hell genug ist und wie viel Partikel durch das Verfahren erzeugt werden. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse".

  1. Beschriften Sie ein 5-ml-Styroporröhrchen als "TCPP-negative Beads".
    HINWEIS: Die negativen Beads unterscheiden sich von den Amin-funktionalisierten Beads, die für die Beschriftung verwendet werden. Siehe Materialtabelle.
  2. Beschriften Sie ein anderes Röhrchen als "TCPP-positive Beads".
  3. Beschrifte eine andere Tube mit "Regenbogenperlen".
  4. Aliquotieren Sie 300 μl eiskaltes HBSS in die Röhrchen, die mit "TCPP negative Beads" und "TCPP positive Beads" gekennzeichnet sind.
  5. Geben Sie 500 μl eiskaltes HBSS in das Röhrchen mit der Bezeichnung "Regenbogenperlen".
  6. Die nicht funktionalisierte Polystyrol-Bead-Suspension (unmarkiert) kurz mit maximaler Geschwindigkeit (2-3 s) aufwirbeln und 10 μL davon in das Röhrchen mit der Aufschrift "TCPP negative Beads" geben.
  7. Die TCPP-markierte Bead-Suspension (finalisiert in Schritt 7.5) kurz mit maximaler Geschwindigkeit aufwirbeln und 3 μL davon in das "TCPP positive beads"-Röhrchen geben.
  8. Wirbeln Sie die Rainbow-Perlenaufhängung kurz mit maximaler Geschwindigkeit und geben Sie zwei Tropfen davon in das "Rainbow Beads"-Röhrchen.
  9. Bewahren Sie alle Röhren abgedeckt und lichtgeschützt auf Eis auf.
  10. Leiten Sie die entsprechenden täglichen Startvorgänge des Durchflusszytometers ein und führen Sie eine Qualitätskontrolle durch, um die optimale Flüssigkeits- und Laserausrichtung zu überprüfen.
    HINWEIS: Für diesen Teil des Protokolls wird davon ausgegangen, dass der Bediener in der Verwendung des verfügbaren Durchflusszytometers geschult ist, einschließlich der Verfahren zur Standardisierung der Lichtstreuung und Fluoreszenzintensität sowie der Grundprinzipien zur Berechnung der korrekten Kompensationsmatrix.
  11. Führen Sie die Rainbow-Perlen und die TCPP-Perlen aus, ohne die Spannungseinstellungen zwischen den verschiedenen Durchläufen zu ändern.
    1. Laufe und sammle 10.000 Events der Regenbogenperlen.
    2. Führen Sie eine Spülung mit Wasser durch und sammeln Sie 10.000 Ereignisse der TCPP-negativen Beads.
    3. Führen Sie eine Spülung mit Wasser durch und sammeln Sie 10.000 Ereignisse der TCPP-positiven Beads.
    4. Führen Sie eine 1-minütige Wasserspülung durch.
      Anmerkungen: Es ist wichtig, nach dem Ausführen der TCPP-Perlen eine Spülung mit Wasser durchzuführen. Wenn das TCPP nicht aus den Leitungen im Zytometer gespült wird, besteht die Möglichkeit, dass verbleibendes TCPP Zellen im nächsten zu erfassenden Röhrchen markieren kann.
    5. Führen Sie die entsprechenden Reinigungs- und Abschaltprotokolle durch, die für die Anweisungen des Herstellers für das Zytometer spezifisch sind.
      HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse finden Sie in Abbildung 1.

9. Perlenfiltration

HINWEIS: Wenn die Qualitätskontrolle der Beads durch Durchflusszytometrie (Schritt 8) einen hohen Anteil an Partikeln (70 % oder mehr) zeigt, sollten Sie die Beadsuspension mit dem folgenden Protokoll filtern (Abbildung 2).

  1. Fügen Sie 3,20 ml eiskaltes HBSS zu 0,8 ml der in Schritt 7.5 abgeschlossenen TCPP-Perlensuspension hinzu (wodurch eine fünffache Verdünnung entsteht).
  2. Wirbeln Sie die verdünnte Wulstsuspension 15 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vor.
  3. Entfernen Sie den Kolben aus einer 5-ml-Einwegspritze.
  4. Setzen Sie die Spritze mit einem Glasfaserfilter (5 μm, 13 mm Durchmesser) ein.
  5. Geben Sie 4 ml HBSS in die Spritze.
  6. Fügen Sie 0,5 ml der vortexed verdünnten Perlensuspension hinzu (Schritt 9.2).
  7. Verwenden Sie den Kolben, um die Suspension mit ca. 2 Tropfen/s durch die Spritze/Filtereinrichtung zu filtern.
  8. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 5 ml frisches HBSS mit ca. 2 Tropfen/s durch den Filter in die Spritze ziehen.
  9. Schieben Sie das HBSS mit ca. 2 Tropfen/s wieder in den Abfallbehälter.
  10. Um die Perlen aus dem Filter zu entfernen, ziehen Sie weitere 5 ml frisches HBSS durch den Filter in die Spritze.
  11. Entfernen Sie vorsichtig den Filter aus der Spritze.
  12. Werfen Sie die Perlensuspension aus der Spritze in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  13. Setzen Sie den Filter wieder auf die Spritze und wiederholen Sie die Schritte 9.10-9.12 noch viermal. Entsorgen Sie dann den Filter und die Spritze.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 9.2-9.13, bis alle Perlen aus Schritt 9.1 gefiltert sind. Verwenden Sie jedes Mal eine frische Spritze und filtern Sie.
  15. Die filtrierten Kügelchensuspensionen werden 10 min bei 1.000 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert.
  16. Aspirieren Sie den Überstand jedes 50-ml-Röhrchens und resuspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig, indem Sie sie in 0,5 ml frischem HBSS kombinieren.
  17. Übertragen Sie die Kügelchen mit einer p1.000-Mikropipette in ein neues Durchstechflasche aus Braun-, Glas- oder Polypropylen und lagern Sie sie bei 4 °C.
  18. Wiederholen Sie Schritt 8, um festzustellen, ob der Anteil der TCPP-bezogenen Partikel in der gefilterten Perlensuspension abgenommen hat. Repräsentative Ergebnisse finden Sie in Abbildung 3.

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Representative Results

Dieses Protokoll für die TCPP-Beschriftung von Perlen ist relativ schnell und effizient. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis des TCPP-Bead-Markierungsprozesses, wie er durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde. Abbildung 1A zeigt das standardisierte Profil von Rainbow-Perlen, wie es im entsprechenden Kanal zur Erkennung von TCPP erkannt wird. Diese Kügelchen dienen als QC für die Standardisierung der Laserspannungen für die Detektion von TCPP durch das Durchflusszytometer. Abbildung 1B zeigt das Lichtstreuprofil von Amin-funktionalisiertem Polystyrol, TCPP-markierten Beads. Abbildung 1C zeigt das Lichtstreuprofil von nicht-funktionalisierten Beads (unmarkierte Beads); Diese verwenden wir als negative Wulstkontrolle, um die Kompensationsmatrix zu berechnen. Die durch das rote Rechteck angezeigte Population, die in der unmarkierten Bead-Suspension fehlt, repräsentiert die TCPP-bezogenen Partikel, die gebildet werden, wenn TCPP dem Kopplungsreagenz EDC ausgesetzt wird. Solche Aggregate sollten bei der Bestimmung der Fluoreszenzintensität (FI) der Beads ausgeschlossen werden. Abbildung 1D zeigt die FI der markierten Perlen, ausgewählt durch das schwarze Gate in Abbildung 1B, die deutlich mehrere Stämme höher ist als die FI der (unated) unbeschrifteten Perlen (Vergleich zu Abbildung 1D zu Abbildung 1E).

Der Anteil der Partikel (d. h. die Ereignisse, die durch das rote Gate in Abbildung 1B angezeigt werden) kann je nach Etikettiercharge variieren. Für die meisten Standard-Durchflusszytometrie-Anwendungen ermöglicht eine Bead-Suspension mit 50 % Partikeln oder weniger die korrekte Einstellung der Kompensation in einem mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Experiment mit TCPP. Es gibt jedoch Anwendungen, bei denen beispielsweise eine automatisierte Datenanalyse zum Einsatz kommt, bei der ein viel höherer Partikelgehalt die richtigen Kompensationseinstellungen beeinträchtigen kann. In solchen Fällen wird eine Filtration empfohlen (Protokollschritt 9 und Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt die Wirkung der Filtration auf die Perlensuspension, die ~65 % Partikel enthielt (linke Tafeln von Abbildung 3A,B). Nach der Filtration sank der Partikelgehalt auf ~12%. Die nachteiligen Auswirkungen der Filtration sind ein gewisser Verlust von Perlen (nicht gezeigt) und ein leichter Verlust von FI (Abbildung 3C). Diese Effekte sollten berücksichtigt werden, wenn eine Filtration der Raupensuspension in Betracht gezogen wird. Eine Alternative zur Perlenfiltration zur Senkung des Partikelgehalts besteht darin, das Verhältnis zwischen den Perlen, dem TCPP und dem Kopplungsreagenz EDC zu ändern. Änderungen dieser Verhältnisse wirken sich jedoch auch auf das FI der Perlen aus.

Die Beziehung zwischen der Partikelbildung, dem MFI und dem Bead/TCPP/EDC-Verhältnis ist in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt. Abbildung 4A und Abbildung 5A zeigen den MFI der markierten Beads in Abhängigkeit vom EDC/TCPP-Verhältnis bzw. dem TCPP/Bead-Verhältnis. Mit steigenden Quoten steigt der MFI, bis er ein Plateau erreicht. Die repräsentativen Beispiele in Abbildung 4B und Abbildung 5B zeigen, dass der Partikelgehalt mit dem jeweils zunehmenden Verhältnis zunimmt. Dieses TCPP-Labeling-Protokoll wurde für maximale MFI optimiert, während der Partikelgehalt so gering wie möglich gehalten wurde (Pfeile in Abbildung 4A und Abbildung 5A). Die Partikel treten nur auf, wenn EDC während des Markierungsvorgangs als Kupplungsreagenz verwendet wird. Wenn nur Beads und TCPP verwendet werden, werden keine Partikel gebildet (nicht gezeigt), aber die Markierung der Beads führt zu Beads mit viel niedrigerem FI (Vergleich von Abbildung 6A mit Abbildung 6B). Wir haben versucht, diese EDC-basierte Kopplungsmethode durch eine Methode zu ersetzen, die auf einem aktivierten NHS-Ester (N-Hydroxysuccinimid) von TCPP23 basiert. Wir fanden jedoch keinen signifikanten Unterschied in der FI mit dieser alternativen Kopplungsmethode im Vergleich zur reinen Verwendung von Beads und TCPP zusammen, was darauf hindeutet, dass es bei dieser Methode eine vernachlässigbare kovalente Bindung von TCPP an die Beads gibt (Vergleich von Abbildung 6B mit Abbildung 6C).

Die in allen bisherigen Abbildungen dargestellten Daten wurden mit Kügelchen mit einem Durchmesser von 10,6 μm erhoben. Wir stellten die Hypothese auf, dass größere Beads aufgrund der vergrößerten Oberfläche mehr TCPP-Bindungsstellen aufweisen und daher eine höhere FI aufweisen könnten. Umgekehrt stellten wir die Hypothese auf, dass kleinere Beads mit kleineren Oberflächen und weniger TCPP-Bindungsstellen eine niedrigere FI aufweisen sollten. Verwendung des gleichen Markierungsprotokolls wie hier beschrieben, jedoch mit 8,6 μm Beads oder 20 μm Beads (anstelle von 10,6 μm Beads), Wir fanden die vorhergesagte Verringerung des FI in den 8,6 μm Beads im Vergleich zu den 10,6 μm Beads (Vergleich von Abbildung 6D mit Abbildung 6A). Die 20-μm-Kügelchen wiesen für das von uns verwendete Durchflusszytometer einen FI-Wert außerhalb der Skala auf (Daten nicht gezeigt), aber diese größeren Kügelchen setzten sich danach schnell aus der Lösung ab und wurden nicht weiter verfolgt.

Dieses Protokoll für die Markierung von Beads mit TCPP wurde entwickelt, um ein zuverlässiges Kompensationswerkzeug in Durchflusszytometrie-Experimenten zu haben, bei denen TCPP zur Markierung von Zellen verwendet wird. In der Vergangenheit haben wir dafür A549-Zellen verwendet24, aber das Markierungsverfahren führte nicht immer zu einem hohen FI. Darüber hinaus konnten die Zellen, auch nach der Fixierung, nicht länger als 1 Monat verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll für die Markierung (10,6 μm) von Beads mit TCPP führte durchweg zu hell gefärbten Beads, wie in Abbildung 1 dargestellt. Als die gleichen TCPP-markierten Beads nach 300 Tagen durchflusszytometrisch getestet wurden, beobachteten wir keine signifikante Veränderung des MFI oder des Partikelgehalts (Abbildung 7). Die Kopplung von TCPP an die Beads hatte nur geringe Auswirkungen auf das Fluoreszenzemissionsspektrum (Abbildung 8A; Vergleich der gestrichelten schwarzen Linie mit der durchgezogenen schwarzen Linie, die das Fluoreszenzemissionsspektrum von TCPP in Lösung darstellt). Das Fluoreszenzemissionsspektrum von TCPP-markierten Beads unterschied sich stärker von dem Spektrum von TCPP, das in A549-Lungenkrebszellen gemessen wurde, insbesondere im Wellenlängenbereich von 700-725 nm (Abbildung 8A; gestrichelte schwarze Linie im Vergleich zur orangefarbenen Linie). Mit der Fähigkeit, das TCPP-Signal von den anderen Signalen in einer Multi-Fluorophor-markierten Sputumprobe zu kompensieren, funktionierten die TCPP-markierten Beads jedoch genauso gut wie die TCPP-gefärbten A549-Zellen (Vergleich in Abbildung 8B bzw. Abbildung 8C).

Das. LMD-Dateien befinden sich im FlowRepository (https://flowrepository.org) unter den IDs FR-FCM-Z6ZP (Abbildung 1); FR-FCM-Z5UJ (Abbildung 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (Abbildung 4B); FR-FCM-Z6ZS (Abbildung 5B); FR-FCM-Z6ZB (Abbildung 6); FR-FCM-Z6Y5 (Abbildung 8B); und FR-FCM-Z6ZT (Abbildung 8C).

Figure 1
Abbildung 1: Qualitätskontrolle der mit TCPP beschrifteten Perlen. (A) Regenbogenperlen. Dargestellt wird das Histogramm der Rainbow Beads, wie sie in dem für den APC-Fluorophor spezifischen Kanal detektiert wurden. Dieser Kanal kann auch zur Detektion der TCPP-Fluoreszenz verwendet werden. Die Rainbow-Perlen dienen als Qualitätskontrolle für den APC-Laser; Der erste und vierte Gipfel sollten in den Bereich fallen, der durch die jeweiligen Klammern angegeben ist. (B,D) TCPP-markierte Perlen. (C,E) Unbeschriftete Perlen. Diese spezielle Probe einer TCPP-markierten Perlenlösung enthielt 51,9 % Perlen (schwarzes Rechteck in B). Die Ereignisse im roten Rechteck stellen die Partikel dar, die sich während der TCPP-Beschriftung gebildet haben. Solche Partikel fehlten in der unmarkierten Bead-Lösung (Vergleich der roten Rechtecke in B und C). Die Fluoreszenzintensitäten der TCPP-markierten und unmarkierten Beads werden in D bzw. E dargestellt. Abkürzungen: SSC = Seitenstreuung; FSC = Vorwärtsstreuung; APC = Allophycocyanin; TCPP = Meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Darstellung der in den Protokollschritten 9.3-9.12 verwendeten Perlenfiltermethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Auswirkungen der Filtration auf Partikel und Fluoreszenzintensität. (A) Mikroskopische Aufnahmen von 10 μm Beads, die mit TCPP markiert sind, vor (linkes Bild) und nach der Filtration (rechtes Bild). Die Bilder wurden mit einer 20-fachen Verstärkung aufgenommen. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Die TCPP-Perlensuspension vor der Filtration (linkes Profil) enthielt 25,6 % Perlen (schwarzes Rechteck) und 65,7 % Schmutz oder Partikel (rotes Rechteck). Der Anteil der Perlen in der Suspension erhöhte sich nach der Filtration auf 74,7 % (rechtes Profil; schwarzes Rechteck) und die Ablagerungen verringerten sich auf 11,9 %. (C) Histogramme des TCPP-FI der in B genannten Perlen. Das Histogramm auf der linken Seite stellt die TCPP-markierten Beads vor der Filtration dar, mit einem FI, der etwas höher ist als der der Beads nach der Filtration (Histogramm rechts). Die roten Linien, die in beiden Abbildungen bei einem FI von 1 × 103 platziert sind, sollen den Vergleich beider Histogramme erleichtern. Abkürzungen: SSC = Seitenstreuung; FSC = Vorwärtsstreuung; APC = Allophycocyanin; TCPP = Meso-Tetra(4-carboxyphenyl)porphin; FI = Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Zusammenhang zwischen dem EDC/TCPP-Verhältnis, der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) und der Partikelbildung. (A) Dargestellt wird die Beziehung zwischen dem EDC/TCPP-Verhältnis, das im Bead-Labeling-Protokoll verwendet wird, und dem MFI der nachfolgenden TCPP-markierten Beads. Die Kurve zeigt den durchschnittlichen MFI von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung (SD). Der rote Pfeil (3,75) zeigt das Volumenverhältnis der in diesem Protokoll verwendeten EDC- und TCPP-Lösungen an. (B) Repräsentative Lichtstreuungsprofile der Perlsuspensionen, die mit den EDC/TCPP-Verhältnissen hergestellt wurden, wie über jedem Profil angegeben. Alle Profile stammen aus demselben Experiment. Die Perlen sind durch das schwarze Rechteck gekennzeichnet. Die partikuläre Bildung, die durch die roten Rechtecke gekennzeichnet ist, nimmt mit zunehmendem EDC/TCPP-Verhältnis zu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5. Zusammenhang zwischen dem TCPP/Beads-Verhältnis, MFI und Partikelbildung. (A) Dargestellt wird die Beziehung zwischen dem im Bead-Labeling-Protokoll verwendeten TCPP/Beads-Volumenverhältnis und dem MFI der nachfolgenden TCPP-markierten Beads. Der MFI steigt schnell an und erreicht nach einem TCPP/Beads-Verhältnis von 2 eine Plateau-Phase. Die Kurve zeigt den durchschnittlichen MFI von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichung (SD). Der rote Pfeil (4.17) zeigt das in diesem Protokoll verwendete Verhältnis an. (B) Repräsentative Lichtstreuungsprofile der Perlensuspensionen, die mit den TCCP/Perlen-Verhältnissen hergestellt wurden, wie über jedem Profil angegeben. Alle Profile stammen aus demselben Experiment. Die Perlen sind durch die schwarzen Rechtecke gekennzeichnet. Die partikuläre Bildung, die durch die roten Rechtecke angezeigt wird, nimmt mit zunehmendem TCPP/Bead-Verhältnis zu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Ein Vergleich der verwendeten Kopplungsmethoden und Wulstgrößen. Dargestellt sind Histogramme der Fluoreszenzintensität der mit TCPP markierten Beads. (A) Die 10,6-μm-Kügelchen wurden gemäß dem bereitgestellten Protokoll markiert, einschließlich der Verwendung des Kopplungsreagenzes EDC. (B) Identisch mit (A), jedoch wurde EDC während des Kennzeichnungsprotokolls weggelassen. (C) Die 10,6 μm großen Kügelchen wurden mit dem NHS-Ester gemäß der von Kabe et al.23 beschriebenen Methode markiert. (D) Wie (A), jedoch wurden anstelle von 10,6 μm Perlen 8,6 μm Perlen verwendet. Die vertikalen roten Linien in jedem Profil werden willkürlich auf 1 × 103 festgelegt, um Vergleiche zwischen den Histogrammen zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Stabilität der TCPP-Perlen über die Zeit. TCPP-markierte Kügelchen (10 μm) wurden nach dem Protokoll markiert, im Kühlschrank bei 4 °C gelagert und im Dunkeln aufbewahrt. Tag 0 ist der Tag der Etikettierung. Zu verschiedenen Zeitpunkten danach wurden die Aliquots der gelagerten Beads mittels Durchflusszytometrie erneut analysiert. Dargestellt werden Messungen des (A) MFI und (B) prozentualen Feinstaubs relativ zum Tag 0 Wert, der willkürlich auf 100% festgelegt wurde. Die horizontalen orangefarbenen Linien stellen die Werte dar, die 10 % über und 10 % unter denen von Tag 0 liegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: TCPP-Beads im Vergleich zu TCPP-gefärbten Zellen als Kompensationswerkzeuge. (A) Die Fluoreszenzemissionsspektren von TCCP in Lösung, TCPP gekoppelt an Beads und TCPP nach der Färbung von A549-Lungenkrebszellen wurden auf einem Mikroplatten-Reader gemessen. Die Emissionsspektren von löslichem und bead-gebundenem TCPP sind sehr ähnlich. Beide unterscheiden sich von den markierten A549-Zellen um die Wellenlänge von 700 nm. (B,C). Eine Sputumprobe wurde in Einzelzellen zerlegt und mit mehreren Fluorophoren markiert: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) und TCPP (FL6). Für jeden Fluorophor stellten wir einfarbige Kontrollröhrchen her, die Beads enthielten, die mit dem entsprechenden Fluorophor gekoppelt waren. Für TCPP wurden zwei Kontrollröhrchen aufgebaut: eines mit TCPP-markierten Beads und eines mit festen A549-Zellen, die mit TCPP markiert sind. Dies ermöglichte es uns, zwei Kompensationsmatrizen zu erstellen: (B) eine, in der die TCPP-markierten Beads als Kompensationskontrolle für TCPP (FL-6) verwendet wurden, und (C) eine, in der TCPP-markierte A549-Zellen verwendet wurden. Diese beiden Kompensationsmatrizen sind sehr ähnlich, wobei der größte Unterschied in der TCPP-bezogenen Kompensation zwischen TCPP (FL6) und FL-3 besteht. Die beigefügten Punktdiagramme, die diese speziellen Parameter anzeigen, zeigen nahezu identische Profile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Reagenzien, die für die TCPP-Stammlösung benötigt werden. Die Mengen an NaHCO3, gereinigtem Wasser und Isopropanol (IPA) basieren auf der in Schritt 1.1 gewogenen Menge an TCPP (zwischen 49,0 mg und 50,9 mg). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Trotz der zahlreichen Anwendungen von Porphyrinen in der Krebsdiagnostik und -therapie2 gibt es nur begrenzte Literatur über ihre potenzielle Verwendung als durchflusszytometrisches Reagenz zur Identifizierung von krebsartigen und nicht-krebsartigen Zellpopulationen in primären menschlichen Geweben24,25,26. Unsere Forschung zur durchflusszytometrischen Analyse von humanem Sputum24,27 erfordert die Färbung von dissoziierten Sputumzellen mit TCPP und mehreren anderen Fluorophoren. Der Fluoreszenz-Spillover von TCPP in den für andere Fluorophore vorgesehenen Detektionskanälen bedeutete jedoch, dass ein TCPP-markiertes Bead als Kompensationskontrolle benötigt wurde. Eine solche Perle war jedoch nicht im Handel erhältlich und musste entwickelt werden. Die Bindung von Tetraarylporphyrinen an siliziumdioxidbasierte Molekularsiebe28,29 wurde berichtet. Partikel auf Siliziumdioxidbasis erwiesen sich jedoch als ungeeignet für die Erstellung von Durchflusszytometriestandards (Daten nicht gezeigt). Daher konzentrierten sich unsere Studien auf Styroporkügelchen.

Eine Lösung von TCPP in Isopropanol-Wasser (1:1 v/v)30 markierte die Polystyrolkügelchen bei pH 6, aber der MFI war im Vergleich zu den gefärbten Zellen in unserem Assay zu niedrig. Wir untersuchten die kovalente Bead-Modifikation als eine Möglichkeit, den MFI zu erhöhen. Die kovalente Modifikation der aminfunktionalisierten Latexkügelchen mit dem NHS-Ester von TCPP durch Amidierung wurde zuvor von Kabe et al.23 unter Verwendung nicht-kommerzieller Kügelchen mit einem Durchmesser von 2 μmbeschrieben 31. In der Studie von Kabe et al.23 wurde TCPP in DMF mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)32 für 5 h inkubiert, um einen aktivierten NHS-Monoester von TCPP herzustellen. Diese aktivierte Esterlösung wurde dann mit Kügelchen umgesetzt, die einen terminalen Aminlinker enthielten. Als wir dieses Protokoll jedoch auf kommerzielle Amin-funktionalisierte Polystyrol-Kügelchen anwandten, führte die Markierung zu Kügelchen mit einem MFI, das für eine Kompensation nicht hell genug war. Daher untersuchten wir die direkte Amidierung von Amin-Polystyrol-Kügelchen ohne Verwendung eines NHS-Ester-Zwischenprodukts.

In dieser Arbeit wurden aminfunktionalisierte Polystyrolkügelchen in Gegenwart des Amid-Kupplungsreagenzes EDC mit TCPP behandelt, um Amidbindungen zwischen den Aminogruppen auf den Kügelchen und den Carboxygruppen auf dem TCPP zu erzeugen. EDC wurde aufgrund seiner wässrigen Löslichkeit, seines nachgewiesenen Nutzens bei wässrigen Amidierungsreaktionen über einen weiten pH-Bereich, seiner geringen Kosten und seiner wasserlöslichen Nebenprodukte ausgewählt33,34. Wir haben Amin-Polystyrol-Kügelchen mit Durchmessern von 8,6 μm, 10,6 μm und 20 μm mit TCPP und EDC in Wasser bei pH 6 umgesetzt. Frühere Studien haben gezeigt, dass TCPP bei diesem pH-Wert löslich bleibt, und dieser pH-Wert ist auch mit EDC33 kompatibel. Die markierten 8,6 μm Beads führten zu einem MFI, der für unseren Assay zu niedrig war. Die 20-μm-Kügelchen hatten einen ausreichend hohen MFI, neigten aber dazu, sich aus der Suspension abzusetzen und das Durchflusszytometer zu verstopfen (nicht gezeigt). Die 10,6 μm Beads wiesen einen adäquaten MFI auf, blieben lange genug in der Schwebe für die durchflusszytometrische Analyse und wurden daher als Kompensationsstandards optimiert. Bemerkenswert ist, dass die äquivalenten unmarkierten Beads eine geringe Hintergrundfluoreszenz aufwiesen und als Negativkontrollbeads zur Kompensation verwendet werden konnten.

Durch die Erhöhung des volumetrischen Reagenzverhältnisses von EDC zu TCPP bei konstanter Menge an Beads wurde der Bead-MFI erhöht, bis ein Plateau bei einem Verhältnis von etwa 2 erreicht wurde. Es wurde auch ein MFI-Plateau beobachtet, da das Verhältnis von TCPP zu Perlen erhöht wurde, während das Verhältnis von EDC zu TCPP konstant blieb. Da das TCPP die Beads in Abwesenheit von EDC markierte, könnte das MFI-Plateau darauf zurückzuführen sein, dass kovalente und nicht-kovalente Bindungsstellen auf der Oberfläche des Beads gesättigt sind. Ein TCPP-bedingtes partikuläres Nebenprodukt wurde beobachtet, wenn EDC und TCPP bei pH 6 kombiniert wurden. Dieses Partikel hatte ein ähnliches Fluoreszenzspektrum wie TCPP, bildete sich aber nicht in Abwesenheit von EDC, was darauf hindeutet, dass es sich um ein unlösliches Nebenprodukt der Reaktion von EDC mit TCPP handelt. Die Partikel waren unregelmäßig geformt und konnten zwar im Allgemeinen kleiner als 5 μm sein, aber größere Aggregate bilden und auch an der Oberfläche der Kügelchen haften. TCPP-verwandte Partikel wurden auch beobachtet, wenn Amin-Polystyrol-Kügelchen mit TCPP und EDC reagiert wurden. Die Partikelmenge nahm sowohl mit einem höheren EDC-zu-TCPP-Verhältnis als auch mit einem höheren TCPP-zu-Perlen-Verhältnis zu. Die im endgültigen Protokoll ausgewählten Reagenzienverhältnisse sind der Schlüssel zum Erfolg des Bead-Labeling-Verfahrens, da sie sicherstellen, dass die resultierende Bead-Suspension einen hohen MFI aufweist, während der Partikelgehalt akzeptabel bleibt. Der in diesem Protokoll erzeugte Partikelgehalt schließt die Verwendung von TCPP-Kügelchen zur Kompensation nicht aus, aber höhere Partikelwerte können die Genauigkeit der Kompensationseinstellungenbeeinträchtigen 35. Außerdem haben wir ein Filtrationsverfahren entwickelt, das den Feinstaubgehalt deutlich senken kann, wenn dieser in hohem Maße vorhanden ist.

Wir haben unsere Reaktion mit einem rotierenden Rührwerk durchgeführt. Wenn die Reaktion nicht gerührt wird, führt dies zu einer langsameren Färbung (Daten nicht gezeigt). Empfohlen wird eine Reaktionszeit von 16 Stunden. Längere Reaktionszeiten (>24 h) führen zu höheren Konzentrationen von TCPP-Partikeln, während kürzere Reaktionszeiten (<8 h) zu einem niedrigeren Bead-MFI führen. Für die unmarkierte Bead-Kontrolle wurden keine aminfunktionalisierten Beads verwendet, die nicht mit TCPP markiert waren, da die Autofluoreszenz der unmarkierten Beads die korrekte Berechnung der Kompensationsmatrizen beeinträchtigte. Stattdessen haben wir nicht funktionalisierte Polystyrolperlen verwendet, die in Fabrikat und Größe ähnlich sind. Darüber hinaus haben wir die unbeschrifteten und TCPP-markierten Perlen in getrennten Röhrchen aufbewahrt. Da sich beide Beads im selben Röhrchen befanden, beobachteten wir eine gewisse Übertragung von TCPP auf die unmarkierten Beads (Daten nicht gezeigt), was zu einer Rechtsverschiebung im MFI führte, die die korrekte Berechnung der Kompensationsmatrix verhinderte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kritischen Punkte für das Erreichen eines hohen MFI der TCPP-markierten Beads die während der Färbereaktion verwendeten Reagenzienverhältnisse, der Zeitpunkt der Färbereaktion und der Durchmesser der unmarkierten Beads sind. In dieser Arbeit lieferte das oben beschriebene Protokoll TCPP-gefärbte Beads, die für die Verwendung in einem Durchflusszytometer geeignet waren und ausreichend fluoreszierend für die Kompensation waren. Die TCPP-gefärbten Kügelchen verloren 300 Tage lang bei 4 °C keinen signifikanten MFI-Wert. Das Fluoreszenzspektrum der TCPP-Beads war vergleichbar mit dem von TCPP in Lösung. Darüber hinaus erzeugten die Kompensationsmatrizen, die mit TCPP-markierten Beads und gefärbten A549-Zellen berechnet wurden, in unserem Assay praktisch identische Sputumprofile, was den Nutzen dieser Beads demonstriert.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von TCPP-Kompensationsbeads, die auf dem Navios EX-Instrument nützlich waren, aber dieselben Beads funktionieren möglicherweise nicht auf einem anderen Instrument mit einer anderen Empfindlichkeit36 und einer anderen Detektorkonfiguration20. Diese Arbeit schlägt jedoch Wege vor, die Fluoreszenz durch die Bead-Größe und das Reagenzverhältnis zu modulieren. TCPP ist nur eines von mehreren fluoreszierenden Porphyrinen, die in vitro und in vivo eine Selektivität von Krebszellen gezeigt haben 2,37,38,39. Nicht alle fluoreszierenden Porphyrine binden möglicherweise an die in diesem Protokoll verwendeten aminfunktionalisierten Polystyrolkügelchen. Tatsächlich ist die Verwendung dieser Kügelchen auf Porphyrine beschränkt, die eine Carbonsäure enthalten. Die mittels Durchflusszytometrie gemessene differentielle Färbung verschiedener Zellpopulationen in menschlichen Gewebeproben mit Porphyrinen könnte Aufschluss über die frühe Entwicklung von Krebs, seinen Verlauf und seine Prognose geben. Die Verwendung anderer Porphyrine zur Färbung menschlicher Gewebeproben und deren Analyse mittels Durchflusszytometrie, wobei geeignete Kontrollperlen als Kompensationsstandards verwendet werden, ist eine attraktive Richtung für die weitere Forschung.

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Disclosures

Alle Autoren sind Mitarbeiter von bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei David Rodriguez für die Unterstützung bei der Präparation der Figur und bei Precision Pathology Services (San Antonio, TX) für den Einsatz des Durchflusszytometers Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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Diesen Monat in JoVE Ausgabe 193 Durchflusszytometrie Kompensationskontrolle Fluorophor Markierung Amin-funktionalisierte Beads Amidierung Porphyrin
Porphyrin-modifizierte Beads zur Verwendung als Kompensationskontrollen in der Durchflusszytometrie
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Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

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