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Chemistry

Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Il protocollo descrive come le sfere di compensazione a base di porfirina per la citometria a flusso vengono preparate dalla reazione di perle di polistirene funzionalizzato con la porfirina TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC. Una procedura di filtrazione viene utilizzata per ridurre i sottoprodotti del particolato.

Abstract

La citometria a flusso può rapidamente caratterizzare e quantificare diverse popolazioni cellulari sulla base di misurazioni di fluorescenza. Le cellule vengono prima colorate con uno o più reagenti fluorescenti, ciascuno funzionalizzato con una diversa molecola fluorescente (fluoroforo) che si lega alle cellule selettivamente in base alle loro caratteristiche fenotipiche, come l'espressione dell'antigene della superficie cellulare. L'intensità della fluorescenza da ciascun reagente legato alle cellule può essere misurata sul citometro a flusso utilizzando canali che rilevano una gamma specifica di lunghezze d'onda. Quando vengono utilizzati più fluorofori, la luce dei singoli fluorofori spesso si riversa in canali di rilevamento indesiderati, il che richiede una correzione dei dati di intensità della fluorescenza in un processo chiamato compensazione.

Le particelle di controllo della compensazione, tipicamente perle polimeriche legate a un singolo fluoroforo, sono necessarie per ogni fluoroforo utilizzato in un esperimento di etichettatura cellulare. I dati delle particelle di compensazione del citometro a flusso vengono utilizzati per applicare una correzione alle misurazioni dell'intensità di fluorescenza. Questo protocollo descrive la preparazione e la purificazione di perle di compensazione del polistirene funzionanti covalentemente con il reagente fluorescente meso-tetra(4-carbossifenil) porfina (TCPP) e la loro applicazione nella compensazione della citometria a flusso. In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzate con ammina sono state trattate con TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC (N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) a pH 6 e a temperatura ambiente per 16 ore con agitazione. Le perle TCPP sono state isolate mediante centrifugazione e risospese in un tampone pH 7 per lo stoccaggio. Il particolato correlato al TCPP è stato osservato come sottoprodotto. Il numero di questi particolati potrebbe essere ridotto utilizzando un protocollo di filtrazione opzionale. Le perle TCPP risultanti sono state utilizzate con successo su un citometro a flusso per la compensazione in esperimenti con cellule di espettorato umano etichettate con più fluorofori. Le perle TCPP si sono dimostrate stabili dopo la conservazione in frigorifero per 300 giorni.

Introduction

Le porfirine sono di interesse da molti anni in campo biomedico grazie alla loro fluorescenza e alle proprietà tumorali 1,2,3. Le applicazioni terapeutiche come la terapia fotodinamica (PDT) e la terapia sonodinamica (SDT) comportano la somministrazione sistemica di una porfirina a un paziente oncologico, l'accumulo del farmaco nel tumore e l'esposizione localizzata del tumore a una luce laser di una specifica lunghezza d'onda o ultrasuoni. L'esposizione alla luce laser o agli ultrasuoni porta alla generazione di specie reattive dell'ossigeno da parte della porfirina e alla successiva morte cellulare 4,5. Nella diagnosi fotodinamica (PDD), la fluorescenza della porfirina viene utilizzata per distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali6. In questo contesto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente naturale che si accumula nei tumori dopo l'iniezione sistemica o locale del suo precursore, l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA), viene utilizzata per identificare i tumori stromali gastrointestinali, il cancro della vescica e il cancro al cervello 7,8. Più recentemente, il trattamento con 5-ALA è stato esplorato come approccio per rilevare la malattia residua minima nel mieloma multiplo9. Il nostro laboratorio ha utilizzato la porfirina tetraarilica TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carbossifenil)-21,23 H-porfina) per la sua capacità di colorare selettivamente le cellule tumorali polmonari e le cellule associate al cancro in campioni di espettorato umano, che è una proprietà che è stata sfruttata in saggi diagnostici citometrici basati su vetrini e a flusso10.

Alcune porfirine sono bifunzionali in quanto possono essere utilizzate come agenti terapeutici e diagnostici 2,11. Nella ricerca biomedica, tali porfirine bifunzionali sono utilizzate per valutare come la loro capacità di colpire selettivamente e uccidere le cellule tumorali sia una funzione della loro struttura e come sia influenzata dalla presenza di altri composti 12,13,14,15,16. Sia l'assorbimento cellulare delle porfirine che la loro citotossicità possono essere misurati su una piattaforma citometrica a flusso in modo ad alto rendimento. Gli spettri di assorbimento ed emissione delle porfirine fluorescenti sono complessi, ma la maggior parte delle piattaforme citometriche a flusso sono attrezzate per identificarle correttamente. Lo spettro di assorbimento delle porfirine fluorescenti è caratterizzato da una forte banda di assorbimento nell'intervallo 380-500 nm, nota come banda Soret. Da due a quattro bande di assorbimento più deboli sono generalmente osservate nell'intervallo 500-750 nm (bande Q)17. Un laser blu da 488 nm, presente nella maggior parte dei citometri a flusso, o un laser viola (405 nm) possono generare luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare le porfirine. Gli spettri di emissione delle porfirine mostrano tipicamente picchi nell'intervallo 600-800 nm18, il che si traduce in una sovrapposizione spettrale molto piccola con i fluorofori di isotiocianato di fluoresceina o ficoeritrina (PE), ma una notevole sovrapposizione con altri fluorofori spesso usati, come l'alloficocianina (APC), così come i fluorofori tandem, come PE-Cy5 e altri. Pertanto, quando si utilizzano le porfirine in saggi di citometria a flusso multicolore, i controlli a singolo fluoroforo sono essenziali per correggere adeguatamente lo spillover della fluorescenza in canali diversi da quello designato per misurare la fluorescenza della porfirina.

Idealmente, i controlli a singolo fluoroforo utilizzati per calcolare la matrice di spillover per un pannello di fluorofori (chiamati anche "controlli di compensazione") dovrebbero essere costituiti dallo stesso tipo di cella del campione. Tuttavia, l'utilizzo del campione per questo scopo non è ottimale se c'è pochissimo campione per iniziare o se la popolazione target all'interno del campione è molto piccola (ad esempio, se si vuole guardare alla malattia residua minima o alle cellule tumorali nelle prime fasi della malattia). Un'alternativa utile alle cellule sono le perle accoppiate con lo stesso fluoroforo che viene utilizzato per analizzare il campione. Molte di queste perle sono disponibili in commercio; Queste perle sono premarcate con il fluoroforo desiderato (perle premarcate specifiche per fluorofori)19,20, oppure un anticorpo marcato con fluorescenza può essere attaccato ad esse (perle di cattura degli anticorpi)20,21. Mentre le perle di compensazione commerciali sono disponibili per molti fluorofori, tali perle non sono disponibili per le porfirine, nonostante il loro crescente uso nella ricerca di base e clinica.

Oltre alla conservazione del campione e alle popolazioni positive rispetto a quelle negative opportunamente dimensionate, gli altri vantaggi dell'uso delle perle come controlli di compensazione sono la facilità di preparazione, la bassa fluorescenza di fondo e l'eccellente stabilità nel tempo22. Il potenziale svantaggio dell'uso delle perle come controllo di compensazione è che lo spettro di emissione dell'anticorpo fluorescente catturato sulle perle può differire da quello dello stesso anticorpo utilizzato per etichettare le cellule. Questo può essere di particolare importanza quando si utilizza un citometro a flusso spettrale20. Pertanto, lo sviluppo di perle come controllo di compensazione deve essere eseguito sul citometro a flusso che verrà utilizzato per il test per il quale vengono sviluppate le perle. Inoltre, lo sviluppo delle perle deve includere un confronto con le cellule etichettate con lo stesso reagente colorante fluorescente.

Qui, descriviamo la preparazione di perle di compensazione in polistirene funzionalizzato con ammina TCPP, la cui intensità mediana di fluorescenza nel canale di rilevamento era paragonabile a quella delle cellule marcate con TCPP nell'espettorato e il loro uso come controlli di compensazione per la citometria a flusso. L'autofluorescenza di sfere equivalenti e non funzionalizzate era sufficientemente bassa per il loro uso come controlli di compensazione della fluorescenza negativa. Inoltre, queste perle hanno dimostrato stabilità nello stoccaggio per quasi 1 anno.

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Protocol

Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati.

1. Preparazione della soluzione madre TCPP, 1,0 mg / ml

NOTA: Questo può essere preparato mensilmente.

  1. Utilizzando una bilancia analitica, una spatola e una carta da pesata, pesare 49,0-50,9 mg di TCPP. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. Mettere da parte la quantità misurata di TCPP al riparo dalla luce.
    NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.
  2. Determinare le quantità richieste di acqua purificata e isopropanolo (IPA) dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 . Aggiungere l'acqua purificata e l'isopropanolo in un becher di vetro da 100 ml e coprire con parafilm per proteggere dall'evaporazione.
  3. Determinare la quantità richiesta di bicarbonato di sodio dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 .
  4. Utilizzando la bilancia analitica, la spatola e la carta da lavoro, pesare la quantità necessaria di bicarbonato di sodio determinata al punto 1.3. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo.
    NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.
  5. Aggiungere il bicarbonato di sodio al becher da 100 mL contenente acqua purificata e isopropanolo. Coprire la soluzione con parafilm per proteggere dall'evaporazione.
  6. Porre la soluzione dal punto 1.5 su una piastra di agitazione e mescolare fino a quando non si scioglie (circa 10 min)
  7. Misurare il pH per assicurarsi che la soluzione contenente bicarbonato di sodio del punto 1.6 abbia un pH compreso tra 9 e 10.
  8. Aggiungere lentamente il TCPP pesato al punto 1.1 alla soluzione dal punto 1.7 e continuare a mescolare fino a quando non si è sciolto (~30 min). Proteggere dalla luce durante questa fase.
  9. Conservare in un contenitore di vetro o polipropilene a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.

2. Preparazione di acido 2-(N-morfolino)-etanosolfonico (MES) e soluzione tampone di sali semisodici, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampone MES")

NOTA: Questo deve essere preparato il giorno dell'uso e conservato a temperatura ambiente.

  1. Pesare 2,50 g di sale semisodico MES e aggiungerlo a un flacone di plastica da 150 ml.
  2. Aggiungere 121 ml di acqua purificata e sciogliere agitando manualmente fino a quando non è visibile alcun solido.
  3. Misurare il pH del tampone MES per assicurarsi che sia compreso tra 6 e 6,2.
  4. Mantenere a temperatura ambiente per l'uso nello stesso giorno.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-etilcarbodiimmide (EDC) polvere

  1. Estrarre la polvere EDC dal congelatore e lasciarla riposare a temperatura ambiente fino all'uso nella fase 5.

4. Combinazione di perle di polistirene funzionalizzate con ammina con soluzione TCPP

  1. Aggiungere 4,3 mL della soluzione tampone MES da 0,1 M preparata nella fase 2 in un tubo di polipropilene da 15 ml.
  2. Vortex la sospensione di perline di polistirene funzionalizzata all'ammina (10 μm, 2,5% p/v) per 60 s alla massima velocità.
  3. Aggiungere 288 μL di questa sospensione di perline appena vortexed al tampone MES dal punto 4.1.
  4. Vortex la soluzione MES/bead per 15 s alla massima velocità.
  5. Vortex la soluzione TCPP da 1 mg/mL preparata al punto 1 per 60 s alla massima velocità.
  6. Aggiungere 1,20 mL di questa soluzione madre TCPP appena vortexed alla sospensione MES/bead dal punto 4.4.
  7. Vortex la sospensione MES/bead/TCPP per 15 s alla massima velocità.
  8. Coprire il tubo con un foglio mentre la soluzione EDC è preparata.

5. Preparazione della soluzione madre di idrocoloride (HCl) di N-(3-dimetlyaminopropil)-N'-etilcarbodiimmide (EDC)

NOTA: La soluzione EDC è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.

  1. Aggiungere 20,0 ml di acqua purificata in un nuovo tubo conico da 50 ml.
  2. Pesare 200 mg di EDC HCl dal punto 3 e aggiungerlo all'acqua (punto 5.1).
  3. Vortice l'EDC HCL per 15 s alla massima velocità per generare una soluzione chiara.

6. Preparazione della soluzione di lavoro EDC HCl/MES

NOTA: La soluzione EDC HCl/MES è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.

  1. Aggiungere 54,0 mL di soluzione tampone MES (preparata al punto 2) in un flacone di plastica da 150 ml.
  2. Aggiungere 6,0 mL della soluzione madre EDC HCl (preparata al punto 5) alla soluzione tampone MES e mescolare agitando per 10 s.

7. Etichettatura delle perline con TCPP

  1. Aggiungere 4,5 mL di soluzione di lavoro EDC (dal punto 6) al tubo di polipropilene da 15 mL contenente le perline e TCPP nel tampone MES (punto 4.7).
  2. Posizionare il tubo in un rotatore invertente a 35 giri / min per 16 ore a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.
  3. Centrifugare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti a 1.000 × g.
  4. Aspirare il surnatante e risospendere le perle in 0,8 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS).
  5. Trasferire la soluzione di perline in un flaconcino di polipropilene ambrato con una pipetta da 1 mL e conservare a 4 °C fino a ulteriore utilizzo.
    NOTA: Le perle sono stabili per almeno 3 mesi a questo punto.

8. Controllo di qualità (QC) delle sfere TCPP mediante citometria a flusso

NOTA: il QC deve essere centrato sul fatto che l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) delle sfere TCPP sia sufficientemente luminosa per l'uso previsto e la quantità di particolato generato dalla procedura. Per ulteriori dettagli, consulta la sezione dei risultati rappresentativi.

  1. Etichettare un tubo di polistirene da 5 ml come "perline negative TCPP".
    NOTA: Le perle negative sono diverse dalle perle funzionalizzate dall'ammina utilizzate per l'etichettatura. Vedere la tabella dei materiali.
  2. Etichetta un altro tubo come "perline positive TCPP".
  3. Etichetta un altro tubo come "Perline arcobaleno".
  4. Aliquot 300 μL di HBSS ghiacciato nei tubi etichettati con "perline negative TCPP" e "perline positive TCPP".
  5. Aggiungere 500 μL di HBSS ghiacciato nel tubo etichettato come "perline arcobaleno".
  6. Vortice la sospensione del cordone in polistirene non funzionalizzato (non etichettato) brevemente alla massima velocità (2-3 s) e aggiungerne 10 μL al tubo etichettato "perline negative TCPP".
  7. Vortice la sospensione del tallone marcata TCPP (finalizzata al punto 7.5) brevemente alla massima velocità e aggiungerne 3 μL al tubo "perline positive TCPP".
  8. Vortice la sospensione del tallone arcobaleno brevemente alla massima velocità e aggiungine due gocce nel tubo "Perline arcobaleno".
  9. Tenere tutti i tubi sul ghiaccio, coperti e protetti dalla luce.
  10. Avviare le procedure di avvio giornaliere appropriate del citometro a flusso ed eseguire un controllo qualità per verificare i fluidi ottimali e l'allineamento laser.
    NOTA: Per questa parte del protocollo, si presume che l'operatore sia addestrato nell'uso del citometro a flusso disponibile, comprese le procedure di standardizzazione della diffusione della luce e dell'intensità della fluorescenza, nonché i principi di base del calcolo della corretta matrice di compensazione.
  11. Eseguire le perline arcobaleno e le perline TCPP senza modificare le impostazioni di tensione tra le diverse esecuzioni.
    1. Corri e raccogli 10.000 eventi delle perline arcobaleno.
    2. Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perle TCPP-negative.
    3. Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perline TCPP-positive.
    4. Eseguire un risciacquo con acqua di 1 minuto.
      NOTA: è importante eseguire un risciacquo con acqua dopo aver eseguito le perline TCPP. Se il TCPP non viene risciacquato dalle linee nel citometro, esiste la possibilità che il TCPP residuo possa etichettare le cellule nella provetta successiva da acquisire.
    5. Eseguire i protocolli di pulizia e spegnimento appropriati specifici per le istruzioni del produttore per il citometro.
      NOTA: per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 1.

9. Filtrazione delle perle

NOTA: Se il controllo qualità delle sfere mediante citometria a flusso (fase 8) mostra un'alta percentuale di particolato (70% o superiore), considerare il filtraggio della sospensione del tallone utilizzando il protocollo riportato di seguito (Figura 2).

  1. Aggiungere 3,20 ml di HBSS ghiacciato a 0,8 ml della sospensione a cordone TCPP finalizzata al passaggio 7.5 (creazione di una diluizione di cinque volte).
  2. Vortex la sospensione del tallone diluito alla massima velocità per 15 s.
  3. Rimuovere lo stantuffo da una siringa monouso da 5 ml.
  4. Montare la siringa con un filtro a punta in fibra di vetro (5 μm, diametro 13 mm).
  5. Aggiungere 4 mL di HBSS alla siringa.
  6. Aggiungere 0,5 mL della sospensione a sfere diluite a vortice (punto 9.2).
  7. Utilizzare lo stantuffo per filtrare la sospensione attraverso la configurazione della siringa/filtro a circa 2 gocce/s.
  8. Lavare le perle aspirando 5 mL di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro a circa 2 gocce/s.
  9. Spingere nuovamente l'HBSS nel contenitore dei rifiuti a circa 2 gocce/s.
  10. Per rimuovere le sfere dal filtro, aspirare altri 5 ml di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro.
  11. Rimuovere con cautela il filtro dalla siringa.
  12. Espellere la sospensione del tallone dalla siringa in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.
  13. Riposizionare il filtro sulla siringa e ripetere i passaggi 9.10-9.12 altre quattro volte. Quindi gettare il filtro e la siringa.
  14. Ripetere i passaggi 9.2-9.13 fino a filtrare tutte le perline del passaggio 9.1. Utilizzare una siringa nuova e filtrare ogni volta.
  15. Centrifugare le sospensioni di sfere filtrate per 10 minuti a 1.000 × g a temperatura ambiente.
  16. Aspirare il surnatante di ogni tubo da 50 mL e risospendere delicatamente le perle, combinandole in 0,5 mL di HBSS fresco.
  17. Trasferire le perle con una micropipetta p1.000 in un nuovo flaconcino di ambra, vetro o polipropilene e conservare a 4 °C.
  18. Ripetere il passaggio 8 per determinare se la percentuale di particolato correlato al TCPP nella sospensione del tallone filtrato è diminuita. Per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 3.

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Representative Results

Questo protocollo per l'etichettatura TCPP delle perline è relativamente veloce ed efficiente. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del processo di marcatura delle perline TCPP determinato dalla citometria a flusso. La Figura 1A mostra il profilo standardizzato delle perline arcobaleno, come rilevato nel canale appropriato per il rilevamento di TCPP. Queste perle servono come QC per la standardizzazione delle tensioni laser per il rilevamento di TCPP da parte del citometro a flusso. La figura 1B mostra il profilo di dispersione della luce del polistirene funzionalizzato con ammina, perline etichettate con TCPP. La figura 1C mostra il profilo di diffusione della luce delle perle non funzionalizzate (perline non etichettate); Li usiamo come controllo negativo delle perline per calcolare la matrice di compensazione. La popolazione indicata dal rettangolo rosso, che è assente nella sospensione di perline non etichettata, rappresenta il particolato correlato al TCPP formato quando TCPP è esposto al reagente di accoppiamento EDC. Tali aggregati devono essere esclusi quando viene determinata l'intensità di fluorescenza (FI) delle perle. La Figura 1D mostra il FI delle perle etichettate, selezionate dal cancello nero nella Figura 1B, che è chiaramente diversi tronchi più alto del FI delle perline (non etichettate) (confrontando la Figura 1D con la Figura 1E).

La proporzione di particolato (cioè gli eventi indicati dal cancello rosso nella Figura 1B) può variare a seconda del lotto di etichettatura. Per la maggior parte delle applicazioni di citometria a flusso standard, una sospensione a perline con il 50% di particolato o meno consente di impostare correttamente la compensazione in un esperimento di citometria a flusso multicolore utilizzando TCPP. Tuttavia, ci sono applicazioni, ad esempio, in cui viene utilizzata l'analisi automatizzata dei dati, per la quale un contenuto di particolato molto più elevato può interferire con le impostazioni di compensazione appropriate. In questi casi, si consiglia la filtrazione (fase 9 del protocollo e Figura 2). La Figura 3 mostra l'effetto della filtrazione sulla sospensione del tallone che comprendeva ~ 65% di particolato (pannelli di sinistra della Figura 3A, B). Dopo la filtrazione, il contenuto di particolato è diminuito a ~ 12%. Gli effetti negativi della filtrazione sono una certa perdita di perline (non mostrata) e una leggera perdita di FI (Figura 3C). Questi effetti devono essere presi in considerazione quando si prende in considerazione la filtrazione della sospensione del tallone. Un'alternativa alla filtrazione delle sfere per ridurre il contenuto di particolato consiste nel modificare il rapporto tra le perle, il TCPP e il reagente di accoppiamento EDC. Tuttavia, le alterazioni di questi rapporti influenzano anche il FI delle perline.

La relazione tra la formazione del particolato, l'MFI e il rapporto tallone/TCPP/EDC è illustrata nella Figura 4 e nella Figura 5. La Figura 4A e la Figura 5A mostrano l'MFI delle perle etichettate in funzione rispettivamente del rapporto EDC/TCPP e del rapporto TCPP/tallone. Con l'aumentare dei rapporti, l'IFM aumenta fino a stabilizzarsi. Gli esempi rappresentativi nelle figure 4B e 5B mostrano che il contenuto di particolato aumenta con il rispettivo rapporto crescente. Questo protocollo di etichettatura TCPP è stato ottimizzato per la massima MFI mantenendo il contenuto di particolato il più basso possibile (frecce nella Figura 4A e nella Figura 5A). Il particolato appare solo quando l'EDC viene utilizzato come reagente di accoppiamento durante la procedura di etichettatura. Utilizzando solo perline e TCPP, il particolato non si forma (non mostrato), ma l'etichettatura delle perline si traduce in perline con FI molto più basso (confrontando la Figura 6A con la Figura 6B). Abbiamo cercato di sostituire questo metodo di accoppiamento basato su EDC con un metodo basato su un estere NHS (N-idrossisuccinimide) attivato di TCPP23. Tuttavia, non abbiamo trovato alcuna differenza significativa nell'utilizzo di FI utilizzando questo metodo di accoppiamento alternativo rispetto al semplice utilizzo di perline e TCPP insieme, suggerendo che vi è un legame covalente trascurabile di TCPP alle perline con questo metodo (confrontando la Figura 6B con la Figura 6C).

I dati presentati in tutte le figure finora sono stati raccolti utilizzando perle di diametro 10,6 μm. Abbiamo ipotizzato che le perle più grandi possano avere più siti di legame TCPP a causa della maggiore area superficiale e potrebbero, quindi, visualizzare FI più elevati. Al contrario, abbiamo ipotizzato che le perle più piccole con aree di superficie più piccole e meno siti di associazione TCPP dovrebbero mostrare FI più bassi. Utilizzando lo stesso protocollo di etichettatura descritto qui, ma con perline da 8,6 μm o perline da 20 μm (invece di perline da 10,6 μm), abbiamo trovato la riduzione prevista di FI nelle perle da 8,6 μm rispetto alle perle da 10,6 μm (confrontando la Figura 6D con la Figura 6A). Le perle da 20 μm mostravano un FI fuori scala per il citometro a flusso che abbiamo usato (dati non mostrati), ma queste perle più grandi si sono depositate rapidamente dalla soluzione e non sono state perseguite ulteriormente.

Questo protocollo per etichettare le perle con TCPP è stato sviluppato allo scopo di avere uno strumento di compensazione affidabile negli esperimenti di citometria a flusso in cui TCPP viene utilizzato per etichettare le cellule. In passato, abbiamo utilizzato celle A549 per questo scopo24, ma la procedura di etichettatura non ha sempre portato a un FI elevato. Inoltre, le cellule, anche dopo la fissazione, non potevano essere utilizzate per più di 1 mese. Il protocollo per l'etichettatura (10,6 μm) delle perle con TCPP descritto nel presente documento ha portato costantemente a perline colorate di luce, come mostrato nella Figura 1. Inoltre, quando le stesse sfere marcate con TCPP sono state testate mediante citometria a flusso dopo 300 giorni, non abbiamo osservato un cambiamento significativo nell'IFM né nel contenuto di particolato (Figura 7). L'accoppiamento di TCPP alle perle ha avuto scarso effetto sul suo spettro di emissione di fluorescenza (Figura 8A; confrontando la linea nera tratteggiata con la linea nera continua, che rappresenta lo spettro di emissione di fluorescenza di TCPP in soluzione). Lo spettro di emissione di fluorescenza delle perle marcate con TCPP differiva maggiormente dallo spettro del TCPP misurato all'interno delle cellule tumorali polmonari A549, specialmente intorno alle lunghezze d'onda 700-725 nm (Figura 8A; linea nera tratteggiata rispetto alla linea arancione, rispettivamente). Tuttavia, con la capacità di compensare il segnale TCPP dagli altri segnali in un campione di espettorato marcato con fluoroforo, le perle marcate con TCPP hanno funzionato altrettanto bene delle celle A549 colorate con TCPP (confrontando rispettivamente la Figura 8B con la Figura 8C).

Le. I file LMD si trovano nel FlowRepository (https://flowrepository.org), sotto gli ID FR-FCM-Z6ZP (Figura 1); FR-FCM-Z5UJ (Figura 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (Figura 4B); FR-FCM-Z6ZS (Figura 5B); FR-FCM-Z6ZB (Figura 6); FR-FCM-Z6Y5 (Figura 8B); e FR-FCM-Z6ZT (Figura 8C).

Figure 1
Figura 1: Controllo di qualità delle perle etichettate con TCPP. (A) Perle arcobaleno. Viene presentato l'istogramma delle perle arcobaleno come rilevato nel canale specifico per il fluoroforo APC. Questo canale può essere utilizzato anche per rilevare la fluorescenza TCPP. Le perle arcobaleno fungono da controllo qualità per il laser APC; Il primo e il quarto picco dovrebbero cadere nella regione indicata dalle rispettive parentesi. (B,D) Perline con etichetta TCPP. (C,E) Perline senza etichetta. Questo particolare campione di soluzione di perline etichettata TCPP includeva il 51,9% di perline (porta rettangolare nera in B). Gli eventi nel rettangolo rosso rappresentano il particolato che si è formato durante l'etichettatura TCPP. Tali particelle erano assenti nella soluzione di perline non etichettata (confrontando i rettangoli rossi in B e C). Le intensità di fluorescenza delle perle marcate TCPP e non etichettate sono presentate rispettivamente in D ed E. Abbreviazioni: SSC = side scatter; FSC = forward scatter; APC = alloficocianina; TCPP = porfina meso-tetra(4-carbossifenil). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentazione schematica del metodo di filtraggio dei talloni utilizzato nei passaggi di protocollo 9.3-9.12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Effetti della filtrazione sul particolato e sull'intensità della fluorescenza. (A) Immagini al microscopio di perline da 10 μm marcate con TCPP prima (immagine a sinistra) e dopo la filtrazione (immagine a destra). Le immagini sono state scattate con un'amplificazione 20x. Barra scala = 20 μm. (B) La sospensione del tallone TCPP prima della filtrazione (profilo sinistro) includeva il 25,6% di perline (rettangolo nero) e il 65,7% di detriti o particelle (rettangolo rosso). La percentuale di perline nella sospensione è aumentata al 74,7% dopo la filtrazione (profilo destro; rettangolo nero) e i detriti sono diminuiti all'11,9%. (C) Istogrammi del TCPP FI delle perle identificate in B. L'istogramma a sinistra rappresenta le perle marcate TCPP prima della filtrazione, con un FI leggermente superiore a quello delle perle dopo la filtrazione (istogramma a destra). Le linee rosse, poste a un FI di 1 × 103 in entrambe le cifre, servono a facilitare il confronto di entrambi gli istogrammi. Abbreviazioni: SSC = side scatter; FSC = forward scatter; APC = alloficocianina; TCPP = porfina meso-tetra(4-carbossifenil); FI = intensità di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Relazione tra il rapporto EDC/TCPP, l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) e la formazione di particolato. (A) Viene presentata la relazione tra il rapporto EDC/TCPP utilizzato nel protocollo di etichettatura delle perline e l'MFI delle perline etichettate TCPP che ne derivano. La curva mostra l'IFM medio di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard (SD). La freccia rossa (3.75) indica il rapporto volumetrico delle soluzioni EDC e TCPP utilizzate in questo protocollo. (B) Profili rappresentativi di dispersione della luce delle sospensioni a tallone preparati con i rapporti EDC/TCPP indicati sopra ciascun profilo. Tutti i profili derivano dallo stesso esperimento. Le perline sono indicate dal rettangolo nero. La formazione di particolato, indicata dai rettangoli rossi, aumenta con l'aumentare dei rapporti EDC/TCPP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Relazione tra il rapporto TCPP/beads, MFI e formazione di particolato. (A) Viene presentata la relazione tra il rapporto volumetrico TCPP/perline utilizzato nel protocollo di etichettatura delle perline e l'MFI delle perle etichettate TCPP che ne derivano. L'IFM aumenta rapidamente, raggiungendo una fase di plateau dopo un rapporto TCPP/beads di 2. La curva mostra l'IFM medio di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard (SD). La freccia rossa (4.17) indica il rapporto utilizzato in questo protocollo. (B) Profili rappresentativi di dispersione della luce delle sospensioni dei talloni preparati con i rapporti TCCP/perline indicati sopra ciascun profilo. Tutti i profili derivano dallo stesso esperimento. Le perline sono indicate dai rettangoli neri. La formazione di particolato, indicata dai rettangoli rossi, aumenta con l'aumentare dei rapporti TCPP/tallone. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Un confronto tra i metodi di accoppiamento e le dimensioni dei talloni utilizzati. Sono mostrati istogrammi dell'intensità di fluorescenza delle perle etichettate con TCPP. (A) Le perle da 10,6 μm sono state etichettate secondo il protocollo fornito, compreso l'uso del reagente di accoppiamento EDC. (B) Lo stesso di (A), ma EDC è stato omesso durante il protocollo di etichettatura. (C) Le perle da 10,6 μm sono state etichettate utilizzando l'estere NHS, secondo il metodo descritto da Kabe et al.23. (D) Come (A), ma invece di perle da 10,6 μm, sono state utilizzate perle da 8,6 μm. Le linee rosse verticali in ciascun profilo sono arbitrariamente impostate a 1 × 103 per facilitare il confronto tra gli istogrammi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Stabilità dei talloni TCPP nel tempo. Le perle marcate TCPP (10 μm) sono state etichettate secondo il protocollo, conservate in frigorifero a 4 °C e conservate al buio. Il giorno 0 è il giorno dell'etichettatura. In vari momenti successivi, le aliquote delle perle immagazzinate sono state rianalizzate mediante citometria a flusso. Vengono presentate le misurazioni del particolato percentuale (A) MFI e (B) rispetto al valore del giorno 0, che è stato arbitrariamente fissato al 100%. Le linee arancioni orizzontali rappresentano i valori 10% sopra e 10% sotto quelli al giorno 0. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Perle TCPP confrontate con celle colorate con TCPP come strumenti di compensazione. (A) Gli spettri di emissione di fluorescenza di TCCP in soluzione, TCPP accoppiato a perline e TCPP dopo la colorazione delle cellule tumorali polmonari A549 sono stati misurati su un lettore di micropiastre. Gli spettri di emissione del TCPP solubile e legato alle perline sono molto simili. Entrambi differiscono da quelli delle celle A549 marcate intorno alla lunghezza d'onda di 700 nm. (B,C). Un campione di espettorato è stato elaborato in singole cellule ed etichettato con più fluorofori: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) e TCPP (FL6). Per ogni fluoroforo, abbiamo preparato tubi di controllo monocolore contenenti perline accoppiate con il relativo fluoroforo. Per TCPP, sono stati installati due tubi di controllo: uno con perline etichettate TCPP e uno con celle A549 fisse etichettate con TCPP. Questo ci ha permesso di creare due matrici di compensazione: (B) una in cui le perle etichettate TCPP sono state utilizzate come controllo di compensazione per TCPP (FL-6) e (C) una in cui sono state utilizzate celle A549 etichettate TCPP. Queste due matrici di compensazione sono molto simili, con la più grande differenza nella compensazione correlata a TCPP tra TCPP (FL6) e FL-3. I grafici a punti di accompagnamento che visualizzano questi particolari parametri mostrano profili quasi identici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Reagenti necessari per la soluzione madre TCPP. Le quantità di NaHCO3, acqua purificata e isopropanolo (IPA) si basano sulla quantità di TCPP pesata nella fase 1.1 (tra 49,0 mg e 50,9 mg). Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Nonostante le numerose applicazioni delle porfirine nella diagnosi e nella terapia del cancro2, esiste una letteratura limitata sul loro potenziale uso come reagente citometrico a flusso per l'identificazione di popolazioni cellulari cancerose e non cancerose nei tessuti umani primari24,25,26. La nostra ricerca sull'analisi citometrica a flusso dell'espettorato umano24,27 richiede la colorazione delle cellule dell'espettorato dissociate con TCPP e diversi altri fluorofori. Tuttavia, lo spillover di fluorescenza di TCPP nei canali di rilevamento designati per altri fluorofori significava che era necessario un tallone marcato TCPP come controllo di compensazione. Tuttavia, tale perlina non era disponibile in commercio e doveva essere sviluppata. È stato riportato l'attaccamento di porfirine tetraariliche a setacci molecolari a base di biossido di silicio28,29. Tuttavia, le particelle a base di biossido di silicio si sono dimostrate inadatte allo scopo di preparare standard di citometria a flusso (dati non mostrati). Pertanto, i nostri studi si sono concentrati sulle perle di polistirolo.

Una soluzione di TCPP in acqua isopropanolo (1: 1 v / v) 30 ha etichettato le perle di polistirene a pH 6, ma l'MFI era troppo basso rispetto alle cellule colorate nel nostro test. Abbiamo esplorato la modifica covalente delle perline come un modo per aumentare l'IFM. La modifica covalente delle perle di lattice funzionalizzate con l'estere NHS di TCPP attraverso l'amidazione è stata precedentemente descritta da Kabe et al.23 utilizzando perle non commerciali di diametro 2 μm31. Nello studio di Kabe et al.23, TCPP è stato incubato in DMF con N-idrossisuccinimide (NHS)32 per 5 ore per preparare un mono-estere NHS attivato di TCPP. Questa soluzione di estere attivato è stata quindi fatta reagire con perline contenenti un linker amminico terminale. Tuttavia, quando abbiamo applicato questo protocollo alle perle di polistirene funzionalizzate con ammine commerciali, l'etichettatura ha prodotto perline con un MFI non sufficientemente luminoso per la compensazione. Pertanto, abbiamo esplorato l'amidazione diretta delle perle di polistirene amminico senza utilizzare un intermedio estere NHS.

In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzato con ammina sono state trattate con TCPP in presenza del reagente di accoppiamento ammidico EDC per generare legami ammidici tra i gruppi amminici sulle perle e i gruppi carbossi sul TCPP. L'EDC è stato scelto per la sua solubilità acquosa, la sua comprovata utilità nelle reazioni di amidazione acquosa in un ampio intervallo di pH, il basso costo e l'idrosolubile dei sottoprodotti33,34. Abbiamo fatto reagire perle di polistirene amminico con diametri di 8,6 μm, 10,6 μm e 20 μm con TCPP ed EDC in acqua a pH 6. Studi precedenti hanno indicato che TCPP rimane solubile a questo pH e questo pH è anche compatibile con EDC33. Le perle etichettate da 8,6 μm hanno prodotto un MFI troppo basso per il nostro test. Le sfere da 20 μm avevano un MFI sufficientemente alto, ma erano inclini a depositarsi dalla sospensione e intasare il citometro a flusso (non mostrato). Le sfere da 10,6 μm avevano una MFI adeguata, rimanevano in sospensione abbastanza a lungo per l'analisi della citometria a flusso e quindi erano ottimizzate come standard di compensazione. In particolare, le perle equivalenti non etichettate avevano una bassa fluorescenza di fondo e potevano essere utilizzate come perle di controllo negativo per la compensazione.

L'aumento del rapporto volumetrico del reagente EDC rispetto a TCPP mantenendo costante la quantità di perline ha aumentato l'IFM delle perline fino a raggiungere un plateau con un rapporto di circa 2. È stato anche osservato un plateau MFI poiché il rapporto tra TCPP e perline è stato aumentato mantenendo costante il rapporto EDC / TCPP. Poiché il TCPP ha etichettato le perle in assenza di EDC, il plateau MFI può essere il risultato di siti di legame covalenti e non covalenti saturi sulla superficie del tallone. Un sottoprodotto di particolato correlato a TCPP è stato osservato quando EDC e TCPP sono stati combinati a pH 6. Questo particolato aveva uno spettro di fluorescenza simile al TCPP ma non si è formato in assenza di EDC, suggerendo che è un sottoprodotto insolubile dalla reazione di EDC con TCPP. Il particolato era di forma irregolare e, sebbene generalmente più piccolo di 5 μm, poteva formare aggregati più grandi e poteva anche aderire alla superficie delle perle. Le particelle correlate al TCPP sono state osservate anche quando le perle di polistirene amminico sono state fatte reagire con TCPP ed EDC. La quantità di particolato è aumentata sia con un rapporto EDC / TCPP più elevato che con un rapporto TCPP / perline più elevato. I rapporti di reagente selezionati nel protocollo finale sono fondamentali per il successo della procedura di etichettatura dei talloni perché assicurano che la sospensione del tallone risultante abbia un elevato MFI mentre il livello di particolato rimane accettabile. Il livello di particolato prodotto in questo protocollo non preclude l'uso di perline TCPP per la compensazione, ma livelli più elevati di particolato possono ostacolare l'accuratezza delle impostazioni di compensazione35. Abbiamo anche sviluppato una procedura di filtrazione in grado di ridurre significativamente il livello di particolato se questi sono presenti ad un livello elevato.

Abbiamo condotto la nostra reazione usando un agitatore rotante. Non agitando la reazione si ottiene una colorazione più lenta (dati non mostrati). Si raccomanda un tempo di reazione di 16 ore. Tempi di reazione più lunghi (>24 h) comportano livelli più elevati di particolato TCPP, mentre tempi di reazione più brevi (<8 ore) determinano una minore IFM del tallone. Per il controllo delle perle non etichettate, non abbiamo utilizzato perline funzionalizzate con ammine che non erano etichettate con TCPP perché l'autofluorescenza delle perle non etichettate interferiva con il calcolo corretto delle matrici di compensazione. Invece, abbiamo usato perle di polistirene non funzionalizzate simili per marca e dimensioni. Inoltre, abbiamo conservato le perle senza etichetta e con etichetta TCPP in tubi separati. Con entrambe le serie di perle nello stesso tubo, abbiamo osservato un certo trasferimento di TCPP alle perle non etichettate (dati non mostrati), che ha causato uno spostamento a destra nell'IFM che ha impedito il calcolo corretto della matrice di compensazione.

In sintesi, i punti critici per ottenere un elevato MFI delle perle marcate TCPP sono i rapporti di reagente utilizzati durante la reazione di colorazione, il tempo della reazione di colorazione e il diametro delle perle non etichettate. In questo lavoro, il protocollo sopra descritto ha fornito perline colorate con TCPP che sono state opportunamente dimensionate per l'uso in un citometro a flusso ed erano sufficientemente fluorescenti per la compensazione. Le perle colorate con TCPP non hanno perso MFI significative a 4 °C per 300 giorni. Lo spettro di fluorescenza delle perle TCPP era paragonabile a quello di TCPP in soluzione. Inoltre, le matrici di compensazione calcolate con perline marcate TCPP e celle A549 colorate hanno generato profili di espettorato praticamente identici nel nostro test, dimostrando l'utilità di queste perle.

Questo protocollo descrive la preparazione delle sfere di compensazione TCPP utili sullo strumento Navios EX, ma queste stesse perle potrebbero non funzionare su uno strumento diverso con sensibilità diversa36 e una diversa configurazione del rilevatore20. Tuttavia, questo lavoro suggerisce modi per modulare la fluorescenza attraverso la dimensione delle sfere e il rapporto del reagente. TCPP è solo una delle numerose porfirine fluorescenti che hanno dimostrato la selettività delle cellule tumorali in vitro e in vivo 2,37,38,39. Non tutte le porfirine fluorescenti possono legarsi alle perle di polistirene funzionalizzate con ammine utilizzate in questo protocollo. Infatti, l'uso di queste perle è limitato alle porfirine che contengono un acido carbossilico. La colorazione differenziale di diverse popolazioni cellulari in campioni di tessuto umano con porfirine, misurata mediante citometria a flusso, potrebbe fornire informazioni sullo sviluppo precoce del cancro, sulla sua progressione e sulla sua prognosi. L'uso di altre porfirine per colorare campioni di tessuto umano e la loro analisi mediante citometria a flusso, utilizzando appropriate sfere di controllo come standard di compensazione, è una direzione interessante per ulteriori ricerche.

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Disclosures

Tutti gli autori sono dipendenti di bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare David Rodriguez per l'assistenza con la preparazione della figura e Precision Pathology Services (San Antonio, TX) per l'uso del suo citometro a flusso Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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Questo mese in JoVE Numero 193 Citometria a flusso controllo della compensazione fluoroforo etichettatura perline funzionalizzate con ammina amidazione porfirina
Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso
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Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

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