Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Akış sitometrisinde kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere porfirin modifiye edilmiş boncuklar

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

Protokol, akış sitometrisi için porfirin bazlı kompanzasyon boncuklarının, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncukların porfirin TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC ile reaksiyonu ile nasıl hazırlandığını açıklar. Partikül yan ürünlerini azaltmak için bir filtreleme prosedürü kullanılır.

Abstract

Akış sitometrisi, floresan ölçümlerine dayanarak çeşitli hücre popülasyonlarını hızla karakterize edebilir ve ölçebilir. Hücreler ilk önce bir veya daha fazla floresan reaktifi ile boyanır, her biri hücre yüzeyi antijen ekspresyonu gibi fenotipik özelliklerine göre hücrelere seçici olarak bağlanan farklı bir floresan molekülü (florofor) ile işlevselleştirilir. Hücrelere bağlı her reaktiften floresan yoğunluğu, belirli bir dalga boyu aralığını tespit eden kanallar kullanılarak akış sitometresinde ölçülebilir. Birden fazla florofor kullanıldığında, bireysel floroforlardan gelen ışık genellikle istenmeyen algılama kanallarına dökülür ve bu da kompanzasyon adı verilen bir işlemde floresan yoğunluğu verilerinde bir düzeltme gerektirir.

Kompanzasyon kontrol parçacıkları, tipik olarak tek bir florofora bağlı polimer boncuklar, bir hücre etiketleme deneyinde kullanılan her florofor için gereklidir. Akış sitometresinden gelen kompanzasyon parçacıklarından elde edilen veriler, floresan yoğunluğu ölçümlerine bir düzeltme uygulamak için kullanılır. Bu protokol, floresan reaktif mezo-tetra (4-karboksifenil) porfin (TCPP) ile kovalent olarak işlevselleştirilmiş polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanması ve saflaştırılmasını ve bunların akış sitometri kompanzasyonunda uygulanmasını açıklamaktadır. Bu çalışmada, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuklar, pH 6'da ve oda sıcaklığında 16 saat boyunca ajitasyon ile TCPP ve amid kuplajlı reaktif EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimid hidroklorür) ile muamele edilmiştir. TCPP boncukları santrifüjleme ile izole edildi ve depolama için bir pH 7 tamponunda yeniden askıya alındı. TCPP ile ilişkili partiküller bir yan ürün olarak gözlendi. Bu partiküllerin sayısı, isteğe bağlı bir filtreleme protokolü kullanılarak azaltılabilir. Elde edilen TCPP boncukları, çoklu floroforlarla etiketlenmiş insan balgam hücreleri ile yapılan deneylerde telafi için bir akış sitometresinde başarıyla kullanıldı. TCPP boncukları, 300 gün boyunca buzdolabında saklandıktan sonra stabil olduğunu kanıtladı.

Introduction

Porfirinler, floresan ve tümör hedefleme özellikleri nedeniyle biyomedikal alanda uzun yıllardır ilgi görmektedir 1,2,3. Fotodinamik terapi (PDT) ve sonodinamik terapi (SDT) gibi terapötik uygulamalar, bir kanser hastasına sistematik olarak porfirin uygulanmasını, ilacın tümörde birikmesini ve tümörün belirli bir dalga boyundaki veya ultrasonun lazer ışığına lokalize maruz kalmasını gerektirir. Lazer ışığına veya ultrasona maruz kalmak, porfirin tarafından reaktif oksijen türlerinin üretilmesine ve ardından hücre ölümüne yol açar 4,5. Fotodinamik tanıda (PDD), kanser hücrelerini normal hücrelerden ayırmak için porfirin floresan kullanılır6. Bu bağlamda, öncülü 5-aminolevülinik asidin (5-ALA) sistemik veya lokal enjeksiyonu üzerine tümörlerde biriken doğal bir floresan porfirin olan protoporfirin IX, gastrointestinal stromal tümörleri, mesane kanserini ve beyin kanserini tanımlamak için kullanılır 7,8. Daha yakın zamanlarda, 5-ALA tedavisi, multipl miyelom9'da minimal rezidüel hastalığı tespit etmek için bir yaklaşım olarak araştırılmıştır. Laboratuvarımız tetraaril porfirin TCPP'yi (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksifenil)-21,23 H-porfin) insan balgam örneklerinde akciğer kanseri hücrelerini ve kanserle ilişkili hücreleri seçici olarak boyama kabiliyeti için kullanmaktadır ve bu özellik slayt tabanlı ve akış sitometrik tanı tahlillerinde kullanılmaktadır10.

Bazı porfirinler, terapötik ve tanısal ajanlar olarak kullanılabilmeleri açısından iki işlevlidir 2,11. Biyomedikal araştırmalarda, bu tür iki işlevli porfirinler, kanser hücrelerini seçici olarak hedefleme ve öldürme yeteneklerinin yapılarının bir fonksiyonu olduğunu ve diğer bileşiklerin varlığından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için kullanılır 12,13,14,15,16. Porfirinlerin hem hücresel alımı hem de sitotoksisitesi, bir akış sitometrik platformunda yüksek verimli bir şekilde ölçülebilir. Floresan porfirinlerin absorpsiyon ve emisyon spektrumları karmaşıktır, ancak çoğu akış sitometrik platformu bunları doğru bir şekilde tanımlamak için donatılmıştır. Floresan porfirinlerin absorpsiyon spektrumu, Soret bandı olarak bilinen 380-500 nm aralığında güçlü bir absorpsiyon bandı ile karakterize edilir. İki ila dört zayıf absorpsiyon bandı genellikle 500-750 nm aralığında (Q bantları) gözlenir17. Çoğu akış sitometresinde bulunan mavi bir 488 nm lazer veya bir mor lazer (405 nm), porfirinleri uyarmak için uygun dalga boyunda ışık üretebilir. Porfirinlerin emisyon spektrumları tipik olarak 600-800 nm aralığında pikler gösterir18, bu da floresein izotiyosiyanat veya fikoeritrin (PE) floroforlarla çok az spektral örtüşme ile sonuçlanır, ancak allophycocyanin (APC) gibi diğer sık kullanılan floroforların yanı sıra PE-Cy5 ve diğerleri gibi tandem floroforlarla önemli ölçüde örtüşür. Bu nedenle, çok renkli akış sitometri tahlillerinde porfirinler kullanıldığında, porfirinin floresansını ölçmek için belirlenenden başka kanallarda floresan yayılımını yeterince düzeltmek için tek florofor kontrolleri gereklidir.

İdeal olarak, bir florofor paneli için yayılma matrisini hesaplamak için kullanılan tek florofor kontrolleri ("kompanzasyon kontrolleri" olarak da adlandırılır), numune ile aynı hücre tiplerinden oluşmalıdır. Bununla birlikte, numunenin bu amaçla kullanılması, başlamak için çok az örnek varsa veya numune içindeki hedef popülasyon çok küçükse (örneğin, hastalığın erken evrelerinde minimal kalıntı hastalığa veya kanser hücrelerine bakmak istiyorsa) optimal değildir. Hücrelere yararlı bir alternatif, numuneyi analiz etmek için kullanılan aynı florofor ile birleştirilmiş boncuklardır. Bu tür boncukların çoğu ticari olarak temin edilebilir; Bu boncuklar ya istenen florofor (önceden etiketlenmiş florofora özgü boncuklar)19,20 ile önceden etiketlenir ya da floresan olarak etiketlenmiş bir antikor bunlara bağlanabilir (antikor yakalama boncukları)20,21. Birçok florofor için ticari tazminat boncukları mevcut olsa da, bu tür boncuklar temel ve klinik araştırmalarda artan kullanımlarına rağmen porfirinler için mevcut değildir.

Numune koruma ve uygun büyüklükte pozitif ve negatif popülasyonlara ek olarak, boncukları kompanzasyon kontrolleri olarak kullanmanın diğer avantajları hazırlık kolaylığı, düşük arka plan floresansı ve zaman içinde mükemmel stabilitedir22. Boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak kullanılmasının potansiyel dezavantajı, boncuklar üzerinde yakalanan floresan antikorun emisyon spektrumunun, hücreleri etiketlemek için kullanılan aynı antikorunkinden farklı olabileceğidir. Bu, spektral akış sitometresi20 kullanıldığında özel bir öneme sahip olabilir. Bu nedenle, boncukların bir kompanzasyon kontrolü olarak geliştirilmesi, boncukların geliştirildiği tahlil için kullanılacak akış sitometresinde yapılmalıdır. Ayrıca, boncukların gelişimi, aynı floresan boyama reaktifi ile etiketlenmiş hücrelerle bir karşılaştırma içermelidir.

Burada, algılama kanalındaki medyan floresan yoğunluğu balgamdaki TCPP etiketli hücrelerinkiyle karşılaştırılabilir olan TCPP amin işlevli polistiren kompanzasyon boncuklarının hazırlanmasını ve akış sitometrisi için kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımlarını açıklıyoruz. Eşdeğer, işlevsel olmayan boncukların otofloresansı, negatif floresan kompanzasyon kontrolleri olarak kullanımları için yeterince düşüktü. Ek olarak, bu boncuklar yaklaşık 1 yıl boyunca depolamada stabilite gösterdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak yapılmalıdır.

1. TCPP stok çözeltisinin hazırlanması, 1.0 mg / mL

NOT: Bu aylık olarak hazırlanabilir.

  1. Analitik terazi, spatula ve tartım kağıdı kullanılarak 49,0-50,9 mg TCPP ağırlığındadır. Ağırlığı miligramın 1 / 10'una yuvarlayın. Ölçülen TCPP miktarını ışıktan korumalı olarak bir kenara koyun.
    NOT: Ağırlık okuması kararsızsa statik bir tabanca kullanın.
  2. Adım 1.1'de tartılan TCPP miktarına bağlı olarak Tablo 1'den gerekli arıtılmış su ve izopropanol (IPA) miktarlarını belirleyin. Arıtılmış suyu ve izopropanol'ü 100 mL'lik bir cam behere ekleyin ve buharlaşmadan korumak için parafilmle örtün.
  3. Adım 1.1'de tartılan TCPP miktarına bağlı olarak Tablo 1'den gerekli sodyum bikarbonat miktarını belirleyin.
  4. Analitik teraziyi, spatulayı ve tartım kağıdını kullanarak adım 1.3'te belirlenen gerekli sodyum bikarbonat miktarını tartın. Ağırlığı miligramın 1 / 10'una yuvarlayın.
    NOT: Ağırlık okuması kararsızsa statik bir tabanca kullanın.
  5. Sodyum bikarbonatı arıtılmış su ve izopropanol içeren 100 mL beher içine ekleyin. Buharlaşmadan korumak için çözeltiyi parafilmle örtün.
  6. Adım 1.5'teki çözeltiyi bir karıştırma plakasına yerleştirin ve eriyene kadar karıştırın (yaklaşık 10 dakika)
  7. Adım 1.6'daki sodyum bikarbonat içeren çözeltinin 9 ila 10 arasında bir pH'a sahip olduğundan emin olmak için pH'ı ölçün.
  8. Adım 1.1'de tartılan TCPP'yi adım 1.7'den itibaren çözeltiye yavaşça ekleyin ve çözünene kadar karıştırmaya devam edin (~ 30 dakika). Bu adımda ışıktan koruyun.
  9. Oda sıcaklığında bir cam veya polipropilen kapta saklayın ve ışıktan koruyun.

2. 2-(N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) ve hemisodyum tuzu tampon çözeltisi, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("MES tamponu") hazırlanması

NOT: Kullanım günü hazırlanmalı ve oda sıcaklığında tutulmalıdır.

  1. 2.50 g MES hemisodyum tuzunu tartın ve bunu 150 mL'lik plastik bir şişeye ekleyin.
  2. 121 mL arıtılmış su ekleyin ve katı görünmeyene kadar manuel çalkalama ile çözün.
  3. MES tamponunun pH'ını 6 ile 6,2 arasında olduğundan emin olmak için ölçün.
  4. Aynı gün kullanmak üzere oda sıcaklığında muhafaza edin.

3. N-(3-Dimetilamininopropil)-N'-etilkarbodiimid (EDC) tozu

  1. EDC tozunu dondurucudan çıkarın ve 5. adımda kullanana kadar oda sıcaklığında bekletin.

4. Amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncukların TCPP çözeltisi ile birleştirilmesi

  1. Adım 2'de hazırlanan 0,1 M MES tampon çözeltisinden 4,3 mL'sini 15 mL'lik bir polipropilen tüpe ekleyin.
  2. Amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuk süspansiyonunu (10 μm, %2,5 w/v) maksimum hızda 60 sn boyunca vorteks.
  3. Bu yeni girdaplı boncuk süspansiyonundan 288 μL'sini adım 4.1'den itibaren MES tamponuna ekleyin.
  4. MES/boncuk çözeltisini maksimum hızda 15 sn boyunca vorteks.
  5. Vorteks 1. adımda hazırlanan 1 mg/mL TCPP çözeltisini maksimum hızda 60 s boyunca yapın.
  6. Bu yeni girdaplı TCPP stok çözümünden 1,20 mL'sini adım 4.4'ten itibaren MES/boncuk süspansiyonuna ekleyin.
  7. MES / boncuk / TCPP süspansiyonunu maksimum hızda 15 s boyunca vorteks.
  8. EDC çözeltisi hazırlanırken tüpü folyo ile örtün.

5. N-(3-dimetilamininopropil)-N'-etilkarbodiimid (EDC) hidrokolorid (HCl) stok çözeltisinin hazırlanması

NOT: EDC çözeltisi bozulabilir ve hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır.

  1. Yeni bir 50 mL konik tüpe 20,0 mL arıtılmış su ekleyin.
  2. 3. adımdan itibaren 200 mg EDC HCl'yi tartın ve suya ekleyin (adım 5.1).
  3. Net bir çözüm üretmek için EDC HCL'yi maksimum hızda 15 sn boyunca vorteks.

6. EDC HCl/MES çalışma solüsyonunun hazırlanması

NOT: EDC HCl/MES çözeltisi bozulabilir özelliktedir ve hazırlandıktan hemen sonra kullanılmalıdır.

  1. 150 mL'lik plastik bir şişeye 54,0 mL MES tampon çözeltisi (adım 2'de hazırlanan) ekleyin.
  2. MES tampon çözeltisine 6,0 mL EDC HCl stok çözeltisi (5. adımda hazırlanan) ekleyin ve 10 sn çalkalayarak karıştırın.

7. Boncukların TCPP ile etiketlenmesi

  1. MES tamponundaki boncukları ve TCPP'yi içeren 15 mL polipropilen tüpe 4,5 mL EDC çalışma çözeltisi (adım 6'dan itibaren) ekleyin (adım 4.7).
  2. Tüpü oda sıcaklığında 16 saat boyunca 35 rpm'de bir ters çevirici rotatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun.
  3. Tüpü oda sıcaklığında 1.000 × g'da 10 dakika santrifüj edin.
  4. Süpernatanı aspire edin ve boncukları 0.8 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) yeniden askıya alın.
  5. Boncuk çözeltisini 1 mL pipet ile kehribar renkli bir polipropilen şişeye aktarın ve bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Boncuklar bu noktada en az 3 ay boyunca stabildir.

8. TCPP boncuklarının akış sitometrisi ile kalite kontrolü (QC)

NOT: QC, TCPP boncuklarının medyan floresan yoğunluğunun (MFI) kullanım amaçları için yeterince parlak olup olmadığına ve prosedür tarafından üretilen partikül miktarına odaklanmalıdır. Daha fazla ayrıntı için temsili sonuçlar bölümüne bakın.

  1. Bir adet 5 mL polistiren tüpü "TCPP negatif boncuklar" olarak etiketleyin.
    NOT: Negatif boncuklar, etiketleme için kullanılan amin fonksiyonelleştirilmiş boncuklardan farklıdır. Malzeme tablosuna bakın.
  2. Başka bir tüpü "TCPP pozitif boncuklar" olarak etiketleyin.
  3. Başka bir tüpü "Gökkuşağı boncukları" olarak etiketleyin.
  4. Aliquot 300 μL buz gibi HBSS, "TCPP negatif boncuklar" ve "TCPP pozitif boncuklar" ile etiketlenmiş tüplere yerleştirilmiştir.
  5. "Gökkuşağı boncukları" olarak etiketlenmiş tüpe 500 μL buz gibi HBSS ekleyin.
  6. İşlevsel olmayan polistiren (etiketsiz) boncuk süspansiyonunu maksimum hızda (2-3 s) kısaca vorteks edin ve "TCPP negatif boncuklar" etiketli tüpe 10 μL ekleyin.
  7. TCPP etiketli boncuk süspansiyonunu (adım 7.5'te sonlandırılmış) kısaca maksimum hızda vorteks edin ve "TCPP pozitif boncuklar" tüpüne 3 μL ekleyin.
  8. Gökkuşağı boncuk süspansiyonunu maksimum hızda kısaca vorteksleyin ve "Gökkuşağı boncukları" tüpüne iki damla ekleyin.
  9. Tüm tüpleri buz üzerinde, kapalı ve ışıktan koruyun.
  10. Akış sitometresinin uygun günlük başlatma prosedürlerini başlatın ve optimum sıvıları ve lazer hizalamasını doğrulamak için bir QC gerçekleştirin.
    NOT: Protokolün bu bölümünde, operatörün, ışık saçılımını ve floresan yoğunluğunu standartlaştırma prosedürlerinin yanı sıra doğru kompanzasyon matrisini hesaplamanın temel prensipleri de dahil olmak üzere mevcut akış sitometresinin kullanımı konusunda eğitildiği varsayılmaktadır.
  11. Farklı koşular arasında voltaj ayarlarını değiştirmeden Rainbow boncuklarını ve TCPP boncuklarını çalıştırın.
    1. Koş ve Gökkuşağı boncuklarının 10.000 etkinliğini topla.
    2. Su ile durulayın ve TCPP negatif boncukların 10.000 olayını toplayın.
    3. Su ile durulayın ve TCPP pozitif boncukların 10.000 olayını toplayın.
    4. 1 dakika suyla durulama yapın.
      NOT: TCPP boncuklarını çalıştırdıktan sonra su ile durulama yapmak önemlidir. TCPP sitometredeki çizgilerden durulanmazsa, artık TCPP'nin elde edilecek bir sonraki tüpteki hücreleri etiketleyebilme olasılığı vardır.
    5. Sitometre için üreticinin talimatlarına özgü uygun temizleme ve kapatma protokollerini uygulayın.
      NOT: Temsili sonuçlar için bkz: Şekil 1.

9. Boncuk filtrasyonu

NOT: Boncukların akış sitometrisine göre QC'si (adım 8) yüksek oranda partikül gösteriyorsa (% 70 veya daha yüksek), boncuk süspansiyonunu aşağıdaki protokolü kullanarak filtrelemeyi düşünün (Şekil 2).

  1. Adım 7.5'te tamamlanan TCPP boncuk süspansiyonunun 0,8 mL'sine 3,20 mL buz gibi soğuk HBSS ekleyin (beş kat seyreltme oluşturur).
  2. Seyreltilmiş boncuk süspansiyonunu 15 s boyunca maksimum hızda vorteks.
  3. Pistonu tek kullanımlık 5 mL'lik bir şırıngadan çıkarın.
  4. Şırıngayı cam elyaf uçlu bir filtreyle (5 μm, 13 mm çap) takın.
  5. Şırıngaya 4 mL HBSS ekleyin.
  6. Vorteksli seyreltilmiş boncuk süspansiyonundan 0,5 mL ekleyin (adım 9.2).
  7. Süspansiyonu şırınga/filtre düzeneğinden yaklaşık 2 damla/sn hızında filtrelemek için pistonu kullanın.
  8. Boncukları, filtreden geçirerek şırıngaya 5 mL taze HBSS çekerek yaklaşık 2 damla / s'de yıkayın.
  9. HBSS'yi yaklaşık 2 damla/sn hızla atık konteynerine tekrar itin.
  10. Boncukları filtreden çıkarmak için, filtreden şırıngaya 5 mL daha taze HBSS çekin.
  11. Filtreyi şırıngadan dikkatlice çıkarın.
  12. Boncuk süspansiyonunu şırıngadan 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne çıkarın.
  13. Filtreyi tekrar şırıngaya yerleştirin ve 9.10-9.12 arasındaki adımları dört kez daha tekrarlayın. Ardından filtreyi ve şırıngayı atın.
  14. Adım 9.1'deki tüm boncuklar filtrelenene kadar 9.2-9.13 arasındaki adımları yineleyin. Her seferinde taze bir şırınga kullanın ve filtreleyin.
  15. Filtrelenmiş boncuk süspansiyonlarını oda sıcaklığında 1.000 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  16. Her 50 mL'lik tüpün süpernatantını aspire edin ve boncukları 0,5 mL taze HBSS'de birleştirerek yavaşça askıya alın.
  17. Boncukları p1.000 mikropipetle yeni bir kehribar, cam veya polipropilen şişeye aktarın ve 4 °C'de saklayın.
  18. Filtrelenmiş boncuk süspansiyonundaki TCPP ile ilişkili partiküllerin oranının azalıp azalmadığını belirlemek için 8. adımı tekrarlayın. Temsili sonuçlar için bkz: Şekil 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Boncukların TCPP etiketlemesi için bu protokol nispeten hızlı ve verimlidir. Şekil 1, akış sitometrisi ile belirlenen TCPP boncuk etiketleme işleminin temsili bir sonucunu göstermektedir. Şekil 1A, TCPP'yi tespit etmek için uygun kanalda tespit edildiği gibi Gökkuşağı boncuklarının standartlaştırılmış profilini göstermektedir. Bu boncuklar, TCPP'nin akış sitometresi tarafından tespiti için lazer voltajlarının standardizasyonu için bir QC görevi görür. Şekil 1B, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren, TCPP etiketli boncukların ışık saçılma profilini göstermektedir. Şekil 1C, işlevselleştirilmemiş boncukların (etiketsiz boncuklar) ışık saçılma profilini göstermektedir; Bunları kompanzasyon matrisini hesaplamak için negatif boncuk kontrolü olarak kullanıyoruz. Etiketsiz boncuk süspansiyonunda bulunmayan kırmızı dikdörtgenle gösterilen popülasyon, TCPP kaplin reaktifi EDC'ye maruz kaldığında oluşan TCPP ile ilgili partikülleri temsil eder. Bu tür agregalar, boncukların floresan yoğunluğu (FI) belirlendiğinde hariç tutulmalıdır. Şekil 1D, Şekil 1B'deki siyah kapı tarafından seçilen etiketli boncukların FI'sini göstermektedir; bu, (unated) etiketlenmemiş boncukların FI'sinden açıkça birkaç kütük daha yüksektir (Şekil 1D ile Şekil 1E'yi karşılaştırarak).

Partiküllerin oranı (yani, Şekil 1B'de kırmızı kapı ile gösterilen olaylar) etiketleme partisine göre değişebilir. Çoğu standart akış sitometrisi uygulaması için,% 50 veya daha az partikül içeren bir boncuk süspansiyonu, TCPP kullanarak çok renkli bir akış sitometri deneyinde kompanzasyonun doğru şekilde ayarlanmasını sağlar. Bununla birlikte, örneğin, otomatik veri analizinin kullanıldığı, çok daha yüksek partikül içeriğinin uygun telafi ayarlarına müdahale edebileceği uygulamalar vardır. Bu gibi durumlarda, filtreleme önerilir (protokol adım 9 ve Şekil 2). Şekil 3 , filtrasyonun ~% 65 partikül içeren boncuk süspansiyonu üzerindeki etkisini göstermektedir ( Şekil 3A, B'nin sol panelleri). Filtrasyondan sonra, partikül içeriği ~% 12'ye düştü. Filtrasyonun olumsuz etkileri bazı boncuk kaybı (gösterilmemiştir) ve hafif bir FI kaybıdır (Şekil 3C). Boncuk süspansiyonunun filtrasyonu düşünülürken bu etkiler dikkate alınmalıdır. Partikül içeriğini azaltmak için boncuk filtrasyonuna bir alternatif, boncuklar, TCPP ve bağlantı reaktifi EDC arasındaki oranı değiştirmektir. Bununla birlikte, bu oranlardaki değişiklikler boncukların FI'sini de etkiler.

Partikül oluşumu, MFI ve boncuk/TCPP/EDC oranı arasındaki ilişki Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterilmiştir. Şekil 4A ve Şekil 5A, etiketli boncukların MFI'sini sırasıyla EDC / TCPP oranının ve TCPP / boncuk oranının bir fonksiyonu olarak göstermektedir. Artan oranlarla, MFI platolara kadar artar. Şekil 4B ve Şekil 5B'deki temsili örnekler, partikül içeriğinin ilgili artan oranla birlikte arttığını göstermektedir. Bu TCPP etiketleme protokolü, partikül içeriğini mümkün olduğunca düşük tutarken maksimum MFI için optimize edilmiştir (Şekil 4A ve Şekil 5A'daki oklar). Partiküller yalnızca etiketleme prosedürü sırasında EDC bir bağlantı reaktifi olarak kullanıldığında ortaya çıkar. Sadece boncuklar ve TCPP kullanılarak, partiküller oluşmaz (gösterilmez), ancak boncukların etiketlenmesi çok daha düşük FI'li boncuklarla sonuçlanır (Şekil 6A ile Şekil 6B'nin karşılaştırılması). Bu EDC bazlı kuplajlama yöntemini, TCPP23'ün aktif NHS (N-hidroksisüksinimid) esterine dayanan bir yöntemle değiştirmeye çalıştık. Bununla birlikte, bu alternatif kuplajlama yöntemini kullanarak FI'da sadece boncuk ve TCPP'yi birlikte kullanmaya kıyasla anlamlı bir fark bulamadık, bu da TCPP'nin bu yöntemle boncuklara ihmal edilebilir kovalent bağlanması olduğunu düşündürmektedir (Şekil 6B ile Şekil 6C karşılaştırıldığında).

Şimdiye kadar tüm şekillerde sunulan veriler 10.6 μm çapında boncuklar kullanılarak toplanmıştır. Daha büyük boncukların, artan yüzey alanı nedeniyle daha fazla TCPP bağlama bölgesine sahip olabileceğini ve bu nedenle daha yüksek FI gösterebileceğini varsaydık. tersine, daha küçük yüzey alanlarına ve daha az TCPP bağlama bölgesine sahip daha küçük boncukların daha düşük FI göstermesi gerektiğini varsaydık. burada açıklandığı gibi aynı etiketleme protokolünü kullanarak, ancak 8.6 μm boncuk veya 20 μm boncuk (10.6 μm boncuk yerine), 10.6 μm boncuklara kıyasla 8.6 μm boncuklarda FI'da öngörülen azalmayı bulduk (Şekil 6D ile Şekil 6A'yı karşılaştırarak). 20 μm boncuklar, kullandığımız akış sitometresi için ölçeğin dışında bir FI gösterdi (veriler gösterilmedi), ancak bu daha büyük boncuklar daha sonra hızlı bir şekilde çözeltiden çıktı ve daha fazla takip edilmedi.

Boncukları TCPP ile etiketlemek için kullanılan bu protokol, TCPP'nin hücreleri etiketlemek için kullanıldığı akış sitometri deneylerinde güvenilir bir telafi aracına sahip olmak amacıyla geliştirilmiştir. Geçmişte, bu amaçla A549 hücrelerini kullandık24, ancak etiketleme prosedürü her zaman yüksek bir FI ile sonuçlanmadı. Ayrıca, hücreler, fiksasyondan sonra bile, 1 aydan fazla kullanılamadı. Burada açıklanan TCPP ile boncukları etiketleme protokolü (10,6 μm), Şekil 1'de gösterildiği gibi sürekli olarak parlak lekeli boncuklarla sonuçlanmıştır. Ayrıca, aynı TCPP etiketli boncuklar 300 gün sonra akış sitometrisi ile test edildiğinde, MFI'da veya partikül içeriğinde önemli bir değişiklik gözlemlemedik (Şekil 7). TCPP'nin boncuklara bağlanması, floresan emisyon spektrumu üzerinde çok az etkiye sahipti (Şekil 8A; kesikli siyah çizgiyi, çözeltideki TCPP'nin floresan emisyon spektrumunu temsil eden katı siyah çizgiyle karşılaştırmak). TCPP etiketli boncukların floresan emisyon spektrumu, A549 akciğer kanseri hücreleri içinde, özellikle 700-725 nm dalga boyları civarında ölçülen TCPP spektrumundan daha farklıydı (Şekil 8A; sırasıyla turuncu çizgiye kıyasla kesikli siyah çizgi). Bununla birlikte, TCPP sinyalini çok florofor etiketli bir balgam örneğindeki diğer sinyallerden telafi etme yeteneği ile, TCPP etiketli boncuklar, TCPP boyalı A549 hücreleri ile eşit derecede iyi çalıştı (sırasıyla Şekil 8B ile Şekil 8C karşılaştırıldığında).

Bu . LMD dosyaları FlowRepository'de (https://flowrepository.org), FR-FCM-Z6ZP ID'leri altında bulunabilir (Şekil 1); FR-FCM-Z5UJ (Şekil 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (Şekil 4B); FR-FCM-Z6ZS (Şekil 5B); FR-FCM-Z6ZB (Şekil 6); FR-FCM-Z6Y5 (Şekil 8B); ve FR-FCM-Z6ZT (Şekil 8C).

Figure 1
Şekil 1: TCPP ile etiketlenmiş boncukların kalite kontrolü. (A) Gökkuşağı boncukları. APC florofora özgü kanalda tespit edilen Gökkuşağı boncuklarının histogramı sunulmuştur. Bu kanal TCPP floresansını tespit etmek için de kullanılabilir. Gökkuşağı boncukları, APC lazer için bir QC görevi görür; Birinci ve dördüncü zirveler, ilgili parantezlerle belirtilen bölgeye düşmelidir. (B,D) TCPP etiketli boncuklar. (C,E) Etiketsiz boncuklar. TCPP etiketli boncuk çözeltisinin bu özel örneği% 51.9 boncuk (B'de siyah dikdörtgen kapı) içeriyordu. Kırmızı dikdörtgendeki olaylar, TCPP etiketlemesi sırasında oluşan parçacıkları temsil eder. Bu tür partiküller etiketlenmemiş boncuk çözeltisinde yoktu (B ve C'deki kırmızı dikdörtgenleri karşılaştırarak). TCPP etiketli ve etiketsiz boncukların floresan yoğunlukları sırasıyla D ve E olarak sunulur. Kısaltmalar: SSC = yan saçılma; FSC = ileri saçılma; APC = allofikosiyanin; TCPP = mezo-tetra(4-karboksifenil) porfin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 9.3-9.12 protokol adımlarında kullanılan boncuk filtreleme yönteminin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Filtrasyonun partiküller ve floresan yoğunluğu üzerindeki etkileri . (A) Filtrelemeden önce (soldaki resim) ve filtrelemeden sonra (sağ resim) TCPP ile etiketlenmiş 10 μm boncukların mikroskopi görüntüleri. Görüntüler 20x amplifikasyonda çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Filtrelemeden önceki TCPP boncuk süspansiyonu (sol profil) %25,6 boncuk (siyah dikdörtgen) ve %65,7 döküntü veya partikül (kırmızı dikdörtgen) içeriyordu. Süspansiyondaki boncukların oranı filtrasyondan sonra (sağ profil; siyah dikdörtgen) %74,7'ye yükseldi ve döküntüler %11,9'a düştü. (C) B'de tanımlanan boncukların TCPP FI'sının histogramları. Soldaki histogram, filtrelemeden önce TCPP etiketli boncukları temsil eder ve FI, filtrasyondan sonraki boncuklarınkinden biraz daha yüksektir (sağdaki histogram). Her iki şekilde de 1 × 103 FI'ye yerleştirilen kırmızı çizgiler, her iki histogramın karşılaştırılmasını kolaylaştırmak içindir. Kısaltmalar: SSC = yan saçılma; FSC = ileri saçılma; APC = allofikosiyanin; TCPP = mezo-tetra(4-karboksifenil) porfin; FI = floresan yoğunluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: EDC/TCPP oranı, medyan floresan yoğunluğu (MFI) ve partikül oluşumu arasındaki ilişki. (A) Boncuk etiketleme protokolünde kullanılan EDC/TCPP oranı ile takip eden TCPP etiketli boncukların MFI'si arasındaki ilişki sunulmaktadır. Eğri, standart sapma (SD) ± üç bağımsız deneyin ortalama MFI'sini gösterir. Kırmızı ok (3.75), bu protokolde kullanılan EDC ve TCPP çözümlerinin hacimsel oranını gösterir. (B) Her profilin üzerinde belirtilen EDC/TCPP oranları ile hazırlanan boncuk süspansiyonlarının temsili ışık saçılma profilleri. Tüm profiller aynı deneyden türetilmiştir. Boncuklar siyah dikdörtgen ile gösterilir. Kırmızı dikdörtgenlerle gösterilen partikül oluşumu, EDC / TCPP oranlarının artmasıyla artar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. TCPP/boncuk oranı, MFI ve partikül oluşumu arasındaki ilişki. (A) Boncuk etiketleme protokolünde kullanılan TCPP/boncuk hacimsel oranı ile takip eden TCPP etiketli boncukların MFI'si arasındaki ilişki sunulmaktadır. MFI hızla artar ve 2 TCPP / boncuk oranından sonra bir plato aşamasına ulaşır. Eğri, standart sapma (SD) ± üç bağımsız deneyin ortalama MFI'sini gösterir. Kırmızı ok (4.17) bu protokolde kullanılan oranı gösterir. (B) Her profilin üzerinde belirtilen TCCP/boncuk oranları ile hazırlanan boncuk süspansiyonlarının temsili ışık saçılma profilleri. Tüm profiller aynı deneyden türetilmiştir. Boncuklar siyah dikdörtgenlerle gösterilir. Kırmızı dikdörtgenlerle gösterilen partikül oluşumu, artan TCPP / boncuk oranları ile artar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kullanılan bağlama yöntemleri ile boncuk boyutlarının karşılaştırılması. TCPP ile etiketlenmiş boncukların floresan yoğunluğunun histogramları gösterilmiştir. (A) 10,6 μm boncuklar, kaplin reaktifi EDC'nin kullanımı da dahil olmak üzere sağlanan protokole göre etiketlenmiştir. (B) (A) ile aynıdır, ancak etiketleme protokolü sırasında EDC atlanmıştır. (C) 10.6 μm boncuklar, Kabe ve ark.23 tarafından açıklanan yönteme göre NHS esteri kullanılarak etiketlenmiştir. (D) (A) ile aynı, ancak 10.6 μm boncuk yerine 8.6 μm boncuk kullanıldı. Her profildeki dikey kırmızı çizgiler, histogramlar arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırmak için isteğe bağlı olarak 1 × 103 olarak ayarlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: TCPP boncuklarının zaman içindeki kararlılığı. TCPP etiketli boncuklar (10 μm) protokole göre etiketlendi, buzdolabında 4 ° C'de saklandı ve karanlıkta saklandı. 0. Gün etiketleme günüdür. Bundan sonra çeşitli zaman noktalarında, depolanan boncukların alikotları akış sitometrisi ile yeniden analiz edildi. Sunulan (A) MFI ve (B) yüzde partiküllerinin gün 0 değerine göre ölçümleridir ve keyfi olarak% 100 olarak ayarlanmıştır. Yatay turuncu çizgiler, 0. gündekilerin %10 üstünde ve %10 altındaki değerleri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Kompanzasyon araçları olarak TCPP boyalı hücrelere kıyasla TCPP boncukları. (A) Çözelti içindeki TCCP'nin floresan emisyon spektrumları, boncuklara bağlanmış TCPP ve A549 akciğer kanseri hücrelerinin boyanmasından sonra TCPP bir mikroplaka okuyucu üzerinde ölçülmüştür. Çözünür ve boncuk bağlı TCPP'nin emisyon spektrumları çok benzerdir. Her ikisi de 700 nm dalga boyu etrafındaki etiketli A549 hücrelerinden farklıdır. (B,C). Bir balgam örneği tek hücrelere işlendi ve birden fazla floroforla etiketlendi: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) ve TCPP (FL6). Her florofor için, ilgili florofor ile birleştirilmiş boncuklar içeren tek renkli kontrol tüpleri hazırladık. TCPP için iki kontrol tüpü kuruldu: biri TCPP etiketli boncuklara ve diğeri TCPP ile etiketlenmiş sabit A549 hücrelerine sahip. Bu, iki kompanzasyon matrisi oluşturmamıza izin verdi: (B) biri TCPP etiketli boncukların TCPP (FL-6) için kompanzasyon kontrolü olarak kullanıldığı ve (C) TCPP etiketli A549 hücrelerinin kullanıldığı bir matris. Bu iki kompanzasyon matrisi, TCPP (FL6) ve FL-3 arasındaki TCPP ile ilgili tazminattaki en büyük farkla çok benzerdir. Bu belirli parametreleri görüntüleyen beraberindeki nokta grafikleri neredeyse aynı profilleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: TCPP stok çözümü için gerekli reaktifler. NaHCO3, arıtılmış su ve izopropanol (IPA) miktarları, adım 1.1'de (49.0 mg ile 50.9 mg arasında) tartılan TCPP miktarına dayanmaktadır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Porfirinlerin kanser tanı ve terapötiklerinde birçok uygulamasına rağmen2, primer insan dokularında kanserli ve kanserli olmayan hücre popülasyonlarının tanımlanmasında akış sitometrik reaktifi olarak potansiyel kullanımları hakkında sınırlı literatür vardır24,25,26. İnsan balgamının akış sitometrik analizi üzerine yaptığımızaraştırma 24,27, ayrışmış balgam hücrelerinin TCPP ve diğer bazı floroforlarla boyanmasını gerektirir. Bununla birlikte, TCPP'nin diğer floroforlar için belirlenen algılama kanallarında floresan yayılması, telafi kontrolü olarak TCPP etiketli bir boncuğa ihtiyaç duyulduğu anlamına geliyordu. Bununla birlikte, böyle bir boncuk ticari olarak mevcut değildi ve geliştirilmesi gerekiyordu. Tetraaril porfirinlerin silisyum dioksit bazlı moleküler eleklere bağlanması28,29 bildirilmiştir. Bununla birlikte, silikon dioksit bazlı parçacıkların, akış sitometri standartlarını hazırlama amacı için uygun olmadığı kanıtlanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle çalışmalarımız polistiren boncuklar üzerinde yoğunlaşmıştır.

İzopropanol sudaki (1: 1 v / v) 30'daki bir TCPP çözeltisi, polistiren boncukları pH 6'da etiketledi, ancak MFI, tahlilimizdeki lekeli hücrelere göre çok düşüktü. MFI'yi arttırmanın bir yolu olarak kovalent boncuk modifikasyonunu araştırdık. Amin fonksiyonelleştirilmiş lateks boncukların TCPP'nin NHS esteri ile amidasyon yoluyla kovalent modifikasyonu daha önce ticari olmayan 2 μm çapında boncuklar31 kullanılarak Kabe ve ark.23 tarafından tanımlanmıştır. Kabe ve ark.23 tarafından yapılan çalışmada, TCPP, aktive edilmiş bir NHS mono-esteri hazırlamak için 5 saat boyunca N-hidroksisüksinamid (NHS) 32 ile DMF'de inkübe edildi. Bu aktif ester çözeltisi daha sonra bir terminal amin bağlayıcı içeren boncuklarla reaksiyona sokuldu. Bununla birlikte, bu protokolü ticari amin işlevli polistiren boncuklara uyguladığımızda, etiketleme, telafi için yeterince parlak olmayan bir MFI'ya sahip boncuklarla sonuçlandı. Bu nedenle, bir NHS ester ara maddesi kullanmadan amin polistiren boncuklarının doğrudan amidasyonunu araştırdık.

Bu çalışmada, amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuklar, boncuklar üzerindeki amino grupları ile TCPP üzerindeki karboksi grupları arasında amid bağları oluşturmak için amid kuplaj reaktifi EDC'nin varlığında TCPP ile muamele edilmiştir. EDC, sulu çözünürlüğü, geniş bir pH aralığında sulu amidasyon reaksiyonlarında kanıtlanmış faydası, düşük maliyeti ve33,34 ürünleri tarafından suda çözünür olması nedeniyle seçilmiştir. 8.6 μm, 10.6 μm ve 20 μm çaplarındaki amin polistiren boncukları, pH 6'da suda TCPP ve EDC ile reaksiyona soktuk. Daha önceki çalışmalar, TCPP'nin bu pH'da çözünür kaldığını ve bu pH'ın EDC33 ile de uyumlu olduğunu göstermiştir. Etiketli 8.6 μm boncuklar, tahlilimiz için çok düşük bir MFI ile sonuçlandı. 20 μm boncuklar yeterince yüksek bir MFI'ye sahipti, ancak süspansiyondan çıkmaya ve akış sitometresini tıkamaya eğilimliydi (gösterilmemiştir). 10.6 μm boncuklar yeterli bir MFI'ya sahipti, akış sitometri analizi için yeterince uzun süre süspansiyonda kaldı ve böylece kompanzasyon standartları olarak optimize edildi. Özellikle, eşdeğer etiketsiz boncuklar düşük arka plan floresansına sahipti ve tazminat için negatif kontrol boncukları olarak kullanılabilir.

Boncuk miktarını sabit tutarken EDC'nin TCPP'ye hacimsel reaktif oranının arttırılması, yaklaşık 2 oranında bir platoya ulaşılana kadar boncuk MFI'yi arttırdı. EDC'nin TCPP oranını sabit tutarken TCPP'nin boncuklara oranı arttığı için bir MFI platosu da gözlendi. TCPP, EDC yokluğunda boncukları etiketlediğinden, MFI platosu, boncuk yüzeyinde doymuş olan kovalent ve kovalent olmayan bağlanma bölgelerinin bir sonucu olabilir. EDC ve TCPP pH 6'da birleştirildiğinde TCPP ile ilişkili bir partikül yan ürünü gözlendi. Bu partikül, TCPP'ye benzer bir floresan spektrumuna sahipti, ancak EDC'nin yokluğunda oluşmadı, bu da EDC'nin TCPP ile reaksiyonundan çözünmez bir yan ürün olduğunu düşündürdü. Partiküller düzensiz şekilliydi ve genellikle 5 μm'den küçük olsa da, daha büyük agregalar oluşturabilir ve ayrıca boncukların yüzeyine yapışabilirdi. TCPP ile ilişkili partiküller, amin polistiren boncukları TCPP ve EDC ile reaksiyona girdiğinde de gözlenmiştir. Partikül miktarı hem daha yüksek EDC - TCPP oranı hem de daha yüksek bir TCPP - boncuk oranı ile artmıştır. Son protokolde seçilen reaktif oranları, boncuk etiketleme prosedürünün başarısının anahtarıdır, çünkü partikül seviyesi kabul edilebilir kalırken ortaya çıkan boncuk süspansiyonunun yüksek bir MFI'ya sahip olmasını sağlarlar. Bu protokolde üretilen partiküllerin seviyesi, kompanzasyon için TCPP boncuklarının kullanılmasını engellemez, ancak daha yüksek partikül seviyeleri, kompanzasyon ayarlarının doğruluğunu engelleyebilir35. Ayrıca, yüksek seviyede mevcut olmaları durumunda partikül seviyesini önemli ölçüde azaltabilecek bir filtreleme prosedürü geliştirdik.

Reaksiyonumuzu dönen bir karıştırıcı kullanarak gerçekleştirdik. Reaksiyonun ajite edilmemesi daha yavaş lekelenmeye neden olur (veriler gösterilmemiştir). 16 saatlik bir reaksiyon süresi önerilir. Daha uzun reaksiyon süreleri (>24 saat) daha yüksek seviyelerde TCPP partikülleri ile sonuçlanırken, daha kısa reaksiyon süreleri (<8 saat) daha düşük boncuk MFI ile sonuçlanır. Etiketsiz boncuk kontrolü için, TCPP ile etiketlenmemiş amin işlevli boncuklar kullanmadık, çünkü etiketlenmemiş boncukların otofloresansı, kompanzasyon matrislerinin doğru hesaplanmasını engelliyordu. Bunun yerine, marka ve boyut olarak benzer işlevsel olmayan polistiren boncuklar kullandık. Ek olarak, etiketsiz ve TCPP etiketli boncukları ayrı tüplerde tuttuk. Aynı tüpteki her iki boncuk seti ile, TCPP'nin etiketsiz boncuklara (veriler gösterilmemiştir) bir miktar aktarıldığını gözlemledik, bu da MFI'da tazminat matrisinin doğru hesaplanmasını yasaklayan bir sağa kaymaya neden oldu.

Özetle, TCPP etiketli boncukların yüksek MFI'sini elde etmek için kritik noktalar, boyama reaksiyonu sırasında kullanılan reaktif oranları, boyama reaksiyonunun zamanı ve etiketlenmemiş boncukların çapıdır. Bu çalışmada, yukarıda açıklanan protokol, bir akış sitometresinde kullanım için uygun boyutta olan ve telafi için yeterince floresan olan TCPP boyalı boncuklar sağlamıştır. TCPP boyalı boncuklar 300 gün boyunca 4 ° C'de önemli MFI kaybetmedi. TCPP boncuklarının floresan spektrumu, çözeltideki TCPP'ninkiyle karşılaştırılabilirdi. Dahası, TCPP etiketli boncuklar ve boyanmış A549 hücreleri ile hesaplanan kompanzasyon matrisleri, tahlilimizde neredeyse aynı balgam profillerini üretti ve bu boncukların faydasını gösterdi.

Bu protokol, Navios EX cihazında yararlı olan TCPP kompanzasyon boncuklarının hazırlanmasını açıklar, ancak aynı boncuklar farklı hassasiyet36 ve farklı bir dedektör konfigürasyonu20 ile farklı bir cihazda çalışmayabilir. Bununla birlikte, bu çalışma, floresanı boncuk boyutu ve reaktif oranı ile modüle etmenin yollarını önermektedir. TCPP, in vitro ve in vivo2,37,38,39 kanser hücresi seçiciliği gösteren birkaç floresan porfirinden sadece biridir. Tüm floresan porfirinler, bu protokolde kullanılan amin fonksiyonelleştirilmiş polistiren boncuklara bağlanmayabilir. Aslında, bu boncukların kullanımı karboksilik asit içeren porfirinlerle sınırlıdır. İnsan doku örneklerinde çeşitli hücre popülasyonlarının porfirinlerle diferansiyel boyanması, akış sitometrisi ile ölçüldüğü gibi, kanserin erken gelişimi, ilerlemesi ve prognozu hakkında fikir verebilir. İnsan doku örneklerini boyamak için diğer porfirinlerin kullanılması ve bunların kompanzasyon standartları olarak uygun kontrol boncukları kullanılarak akış sitometrisi ile analizi, daha ileri araştırmalar için cazip bir yöndür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in çalışanlarıdır.

Acknowledgments

David Rodriguez'e, Navios EX akış sitometresinin kullanımı için şekil hazırlama ve Hassas Patoloji Hizmetleri (San Antonio, TX) ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 193 Akış sitometrisi kompanzasyon kontrolü florofor etiketleme amin işlevli boncuklar amidasyon porfirin
Akış sitometrisinde kompanzasyon kontrolleri olarak kullanılmak üzere porfirin modifiye edilmiş boncuklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter