Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

В протоколе описывается, как компенсационные шарики на основе порфирина для проточной цитометрии получают реакцией аминофункционализированных полистирольных шариков с порфирином TCPP и амидным связывающим реагентом EDC. Процедура фильтрации используется для уменьшения количества побочных продуктов твердых частиц.

Abstract

Проточная цитометрия может быстро охарактеризовать и количественно оценить различные клеточные популяции на основе измерений флуоресценции. Клетки сначала окрашивают одним или несколькими флуоресцентными реагентами, каждый из которых функционализируется другой флуоресцентной молекулой (флуорофором), которая избирательно связывается с клетками на основе их фенотипических характеристик, таких как экспрессия антигена на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции от каждого реагента, связанного с клетками, может быть измерена на проточном цитометре с использованием каналов, которые обнаруживают заданный диапазон длин волн. При использовании нескольких флуорофоров свет от отдельных флуорофоров часто перетекает в нежелательные каналы обнаружения, что требует коррекции данных об интенсивности флуоресценции в процессе, называемом компенсацией.

Компенсационные контрольные частицы, обычно полимерные шарики, связанные с одним флуорофором, необходимы для каждого флуорофора, используемого в эксперименте по маркировке клеток. Данные компенсационных частиц из проточного цитометра используются для внесения поправок в измерения интенсивности флуоресценции. В этом протоколе описывается приготовление и очистка полистирольных компенсационных шариков, ковалентно функционализированных флуоресцентным реагентом мезотетра(4-карбоксифенил)порфин (TCPP), и их применение для компенсации проточной цитометрии. В этой работе аминофункционализированные полистирольные шарики обрабатывали TCPP и амидным связывающим реагентом EDC (N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид) при рН 6 и при комнатной температуре в течение 16 ч с перемешиванием. Гранулы TCPP выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере pH 7 для хранения. В качестве побочного продукта наблюдались частицы, связанные с TCPP. Количество этих частиц может быть уменьшено с помощью дополнительного протокола фильтрации. Полученные гранулы TCPP были успешно использованы на проточном цитометре для компенсации в экспериментах с клетками мокроты человека, меченными несколькими флуорофорами. Бусины TCPP оказались стабильными после хранения в холодильнике в течение 300 дней.

Introduction

Порфирины уже много лет представляют интерес в области биомедицины из-за их флуоресцентных и опухолевых свойств 1,2,3. Терапевтические применения, такие как фотодинамическая терапия (ФДТ) и сонодинамическая терапия (СДТ), влекут за собой системное введение порфирина больному раком, накопление препарата в опухоли и локализованное воздействие на опухоль лазерным светом определенной длины волны или ультразвуком. Воздействие лазерного излучения или ультразвука приводит к образованию порфирином активных форм кислорода и последующей гибели клеток 4,5. В фотодинамической диагностике (PDD) флуоресценция порфирина используется для отличия раковых клеток от нормальныхклеток 6. В этом контексте протопорфирин IX, природный флуоресцентный порфирин, который накапливается в опухолях при системной или местной инъекции своего предшественника, 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), используется для выявления стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря и рака головного мозга 7,8. Совсем недавно лечение 5-АЛК было изучено как подход к выявлению минимального остаточного заболевания при множественной миеломе9. Наша лаборатория использует тетраарилпорфирин TCPP (5,10,15,20-тетракис-(4-карбоксифенил)-21,23H-порфин) из-за его способности селективно окрашивать клетки рака легких и связанные с раком клетки в образцах мокроты человека, что является свойством, которое было использовано в диагностических анализах на основе слайдов и проточных цитометрических диагностических анализах10.

Некоторые порфирины являются бифункциональными в том смысле, что их можно использовать в качестве терапевтических и диагностических средств 2,11. В биомедицинских исследованиях такие бифункциональные порфирины используются для оценки того, как их способность избирательно нацеливаться и убивать раковые клетки зависит от их структуры, а также как на нее влияет присутствие других соединений 12,13,14,15,16. Как клеточное поглощение порфиринов, так и их цитотоксичность могут быть измерены на проточной цитометрической платформе с высокой пропускной способностью. Спектры поглощения и излучения флуоресцентных порфиринов сложны, но большинство проточных цитометрических платформ оборудованы для их правильной идентификации. Спектр поглощения флуоресцентных порфиринов характеризуется сильной полосой поглощения в диапазоне 380-500 нм, известной как полоса Соре. В диапазоне 500–750 нм (Q-полосы) обычно наблюдаются от двух до четырех более слабых полос поглощения17. Синий лазер с длиной волны 488 нм, присутствующий в большинстве проточных цитометров, или фиолетовый лазер (405 нм) могут генерировать свет соответствующей длины волны для возбуждения порфиринов. Спектры излучения порфиринов обычно показывают пики в диапазоне 600-800 нм18, что приводит к очень небольшому спектральному перекрытию с флуоресцеин-изотиоцианатом или фикоэритриновыми (ПЭ) флуорофорами, но к значительному перекрытию с другими часто используемыми флуорофорами, такими как аллофикоцианин (APC), а также тандемные флуорофоры, такие как PE-Cy5 и другие. Следовательно, при использовании порфиринов в многоцветных анализах проточной цитометрии контроль одиночных флуорофоров необходим для адекватной коррекции распространения флуоресценции в каналах, отличных от того, который предназначен для измерения флуоресценции порфирина.

В идеале однофлуорофорные контрольные элементы, используемые для расчета матрицы побочных эффектов для панели флуорофоров (также называемые «компенсационными контролями»), должны состоять из того же типа (ов) клеток, что и образец. Однако использование выборки для этой цели не является оптимальным, если для начала очень мало выборки или если целевая популяция в выборке очень мала (например, если кто-то хочет посмотреть на минимальное остаточное заболевание или раковые клетки на ранних стадиях заболевания). Полезной альтернативой клеткам являются шарики в сочетании с тем же флуорофором, который используется для анализа образца. Многие такие бусины имеются в продаже; Эти шарики либо предварительно мечены желаемым флуорофором (предварительно меченные флуорофор-специфические шарики)19,20, либо к ним может быть прикреплено флуоресцентно меченное антитело (шарики захвата антител)20,21. В то время как коммерческие компенсационные шарики доступны для многих флуорофоров, такие шарики недоступны для порфиринов, несмотря на их растущее использование в фундаментальных и клинических исследованиях.

В дополнение к сохранению образцов и соответствующему размеру положительных и отрицательных популяций, другими преимуществами использования шариков в качестве компенсационных контролеров являются простота приготовления, низкая фоновая флуоресценция и превосходная стабильность во времени22. Потенциальным недостатком использования шариков в качестве компенсационного контроля является то, что спектр излучения флуоресцентного антитела, захваченного на шариках, может отличаться от спектра того же антитела, используемого для маркировки клеток. Это может иметь особое значение при использовании спектрального проточного цитометра20. Следовательно, разработка шариков в качестве компенсационного контроля должна быть выполнена на проточном цитометре, который будет использоваться для анализа, для которого разрабатываются шарики. Кроме того, разработка шариков должна включать сравнение с клетками, меченными тем же флуоресцентным окрашивающим реагентом.

Здесь мы описываем приготовление полистирольных компенсационных шариков, функционализированных амином TCPP, средняя интенсивность флуоресценции которых в канале детектирования была сопоставима с таковой у меченных TCPP клеток в мокроте, и их использование в качестве компенсационного контроля для проточной цитометрии. Автофлуоресценция эквивалентных нефункционализированных шариков была достаточно низкой для их использования в качестве контроля компенсации отрицательной флуоресценции. Кроме того, эти бусины продемонстрировали стабильность при хранении в течение почти 1 года.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры необходимо проводить с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.

1. Приготовление исходного раствора TCPP, 1,0 мг / мл

ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть подготовлено ежемесячно.

  1. С помощью аналитических весов, шпателя и бумаги для взвешивания взвесьте 49,0-50,9 мг TCPP. Округлите вес до 1/10 миллиграмма. Отложите измеренное количество TCPP в сторону, защищенное от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте статический пистолет, если показания веса нестабильны.
  2. Определите требуемые количества очищенной воды и изопропанола (IPA) из таблицы 1 на основе количества TCPP, взвешенного на шаге 1.1. Добавьте очищенную воду и изопропанол в стеклянный стакан объемом 100 мл и накройте парапленкой для защиты от испарения.
  3. Определите необходимое количество бикарбоната натрия из таблицы 1 на основе количества TCPP, взвешенного на шаге 1.1.
  4. Используя аналитические весы, шпатель и бумагу для взвешивания, взвесьте необходимое количество бикарбоната натрия, определенное на шаге 1.3. Округлите вес до 1/10 миллиграмма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте статический пистолет, если показания веса нестабильны.
  5. Добавьте бикарбонат натрия в стакан объемом 100 мл, содержащий очищенную воду и изопропанол. Накройте раствор парапленкой для защиты от испарения.
  6. Поместите раствор из шага 1,5 на мешалку и перемешайте до полного растворения (около 10 мин)
  7. Измерьте рН, чтобы убедиться, что раствор, содержащий бикарбонат натрия из шага 1.6, имеет рН от 9 до 10.
  8. Медленно добавьте взвешенный на шаге 1.1 TCPP в раствор с шага 1.7 и продолжайте помешивать до растворения (~ 30 мин). Защищайте от света во время этого шага.
  9. Хранить в стеклянной или полипропиленовой таре при комнатной температуре и в защищенном от света месте.

2. Приготовление 2-(N-морфолино)-этансульфоновой кислоты (MES) и буферного раствора геминатриевой соли, 0,1 М, рН 6,0-6,2 («MES-буфер »)

ПРИМЕЧАНИЕ: Он должен быть приготовлен в день использования и храниться при комнатной температуре.

  1. Взвесьте 2,50 г геминатриевой соли MES и добавьте ее в пластиковую бутылку объемом 150 мл.
  2. Добавьте 121 мл очищенной воды и растворите ручным встряхиванием до тех пор, пока не останется твердого вещества.
  3. Измерьте рН буфера MES, чтобы убедиться, что он находится в диапазоне от 6 до 6,2.
  4. Хранить при комнатной температуре для использования в тот же день.

3. Порошок N- (3-диметлиаминопропил) -N'-этилкарбодиимида (EDC)

  1. Достаньте порошок EDC из морозильной камеры и оставьте при комнатной температуре до использования на шаге 5.

4. Сочетание аминофункционализированных полистирольных шариков с раствором TCPP

  1. Добавьте 4,3 мл 0,1 М буферного раствора MES, приготовленного на этапе 2, в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл.
  2. Встряхните функционализированную амином суспензию полистирольных шариков (10 мкм, 2,5% мас./об.) в течение 60 с на максимальной скорости.
  3. Добавьте 288 мкл этой свежесуспензии вихревых шариков в буфер MES с шага 4.1.
  4. Вихревая раствор MES/шарика в течение 15 с на максимальной скорости.
  5. Встряхните раствор TCPP в дозе 1 мг/мл, приготовленный на этапе 1, в течение 60 с с максимальной скоростью.
  6. Добавьте 1,20 мл этого свежевихревого исходного раствора TCPP в суспензию MES / шариков из шага 4.4.
  7. Вихревая подвеска MES/бортов/TCPP в течение 15 с на максимальной скорости.
  8. Накройте трубку фольгой, пока готовится раствор EDC.

5. Приготовление исходного раствора N-(3-диметлиаминопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC) гидрохолорида (HCl)

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор EDC является скоропортящимся и должен использоваться сразу после приготовления.

  1. Добавьте 20,0 мл очищенной воды в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
  2. Взвесьте 200 мг EDC HCl из шага 3 и добавьте его в воду (шаг 5.1).
  3. Встряхните EDC HCL в течение 15 с на максимальной скорости, чтобы получить четкое решение.

6. Приготовление рабочего раствора EDC HCl/MES

ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор EDC HCl/MES является скоропортящимся и должен использоваться сразу после приготовления.

  1. Добавьте 54,0 мл буферного раствора MES (приготовленного на шаге 2) в пластиковую бутылку объемом 150 мл.
  2. Добавьте 6,0 мл исходного раствора EDC HCl (приготовленного на шаге 5) в буферный раствор MES и перемешайте, встряхивая в течение 10 с.

7. Маркировка бусин TCPP

  1. Добавьте 4,5 мл рабочего раствора EDC (из шага 6) в полипропиленовую пробирку объемом 15 мл, содержащую шарики и TCPP в буфере MES (этап 4.7).
  2. Поместите трубку в инвертирующий ротатор при 35 об/мин на 16 часов при комнатной температуре и в защищенном от света месте.
  3. Центрифугируют пробирку при комнатной температуре в течение 10 мин при 1 000 × г.
  4. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте шарики в 0,8 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS).
  5. Перелейте раствор шариков во флакон из полипропилена янтарного цвета с помощью пипетки объемом 1 мл и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент бусины стабильны не менее 3 месяцев.

8. Проверка качества (КК) шариков TCPP методом проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества должен быть сосредоточен на том, является ли средняя интенсивность флуоресценции (MFI) шариков TCPP достаточно яркой для их предполагаемого использования и количества частиц, образующихся в результате процедуры. Более подробную информацию см. в разделе репрезентативных результатов.

  1. Пометьте одну полистирольную трубку объемом 5 мл как «отрицательные шарики TCPP».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательные шарики отличаются от аминофункционализированных бусин, используемых для маркировки. Смотрите таблицу материалов.
  2. Пометьте другую трубку как «положительные бусины TCPP».
  3. Пометьте другой тюбик как «Радужные бусины».
  4. Aliquot 300 мкл ледяного HBSS в пробирки с маркировкой «TCPP-отрицательные шарики» и «TCPP-положительные шарики».
  5. Добавьте 500 мкл ледяного HBSS в пробирку с надписью «Радужные шарики».
  6. Кратковременно встряхните нефункционализированную суспензию шариков полистирола (без маркировки) на максимальной скорости (2-3 с) и добавьте 10 мкл ее в трубку с надписью «Отрицательные шарики TCPP».
  7. Кратковременно встряхните суспензию шарика с меткой TCPP (завершенную на шаге 7.5) на максимальной скорости и добавьте 3 мкл ее в пробирку «положительные шарики TCPP».
  8. Кратковременно встряхните суспензию радужных шариков на максимальной скорости и добавьте две капли в тюбик «Радужные бусины».
  9. Держите все трубки на льду, накрытыми крышками и защищенными от света.
  10. Инициируйте соответствующие ежедневные процедуры запуска проточного цитометра и выполняйте контроль качества для проверки оптимальных жидкостей и лазерного выравнивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой части протокола предполагается, что оператор обучен использованию доступного проточного цитометра, включая процедуры стандартизации рассеяния света и интенсивности флуоресценции, а также основные принципы расчета правильной матрицы компенсации.
  11. Запускайте бусины Rainbow и бусины TCPP, не изменяя настройки напряжения между различными прогонами.
    1. Бегите и соберите 10 000 событий Радужных бусин.
    2. Выполните ополаскивание водой и соберите 10 000 событий TCPP-отрицательных шариков.
    3. Выполните смывание водой и соберите 10 000 событий TCPP-положительных шариков.
    4. Выполните 1-минутное ополаскивание водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить промывку водой после запуска шариков TCPP. Если TCPP не промывается из линий в цитометре, существует вероятность того, что остаточный TCPP может помечать клетки в следующей пробирке, которая будет получена.
    5. Выполните соответствующие протоколы очистки и выключения, указанные в инструкциях производителя цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты см. на рисунке 1.

9. Фильтрация шариков

ПРИМЕЧАНИЕ: Если контроль качества шариков с помощью проточной цитометрии (шаг 8) показывает высокую долю твердых частиц (70% или выше), рассмотрите возможность фильтрации суспензии шариков с использованием приведенного ниже протокола (рис. 2).

  1. Добавьте 3,20 мл ледяного HBSS к 0,8 мл суспензии шариков TCPP, завершенной на этапе 7.5 (создание пятикратного разведения).
  2. Вихревая разбавленная суспензия разбавленного шарика на максимальной скорости в течение 15 с.
  3. Извлеките поршень из одноразового шприца объемом 5 мл.
  4. Установите на шприц фильтр с наконечником из стекловолокна (5 мкм, диаметр 13 мм).
  5. Добавьте 4 мл HBSS в шприц.
  6. Добавьте 0,5 мл вихревой разбавленной суспензии шариков (этап 9.2).
  7. Используйте поршень для фильтрации суспензии через шприц/фильтр со скоростью примерно 2 капли/с.
  8. Промойте шарики, набрав 5 мл свежего HBSS в шприц через фильтр со скоростью примерно 2 капли / с.
  9. Снова вытолкните HBSS в контейнер для отходов со скоростью примерно 2 капли в секунду.
  10. Чтобы удалить шарики из фильтра, наберите еще 5 мл свежего HBSS в шприц через фильтр.
  11. Аккуратно извлеките фильтр из шприца.
  12. Вытолкните суспензию шариков из шприца в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  13. Поместите фильтр обратно на шприц и повторите шаги 9.10-9.12 еще четыре раза. Затем выбросьте фильтр и шприц.
  14. Повторяйте шаги 9.2–9.13 до тех пор, пока не будут отфильтрованы все бусины из шага 9.1. Используйте свежий шприц и каждый раз фильтруйте.
  15. Центрифугируют отфильтрованные шарики суспензии в течение 10 мин при 1000 × г при комнатной температуре.
  16. Аспирируйте надосадочную жидкость каждой пробирки объемом 50 мл и осторожно ресуспендируйте шарики, объединив их в 0,5 мл свежего HBSS.
  17. Переложите шарики с помощью микропипетки p1,000 в новый янтарный, стеклянный или полипропиленовый флакон и храните при температуре 4 ° C.
  18. Повторите шаг 8, чтобы определить, уменьшилась ли доля твердых частиц, связанных с TCPP, в отфильтрованной суспензии шариков. Репрезентативные результаты см. на рисунке 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол для маркировки бусин TCPP является относительно быстрым и эффективным. На рисунке 1 показан репрезентативный результат процесса маркировки шариков TCPP, определенный с помощью проточной цитометрии. На рисунке 1A показан стандартизированный профиль шариков Rainbow, обнаруженный в соответствующем канале для обнаружения TCPP. Эти шарики служат в качестве контроля качества для стандартизации лазерных напряжений для обнаружения TCPP с помощью проточного цитометра. На рисунке 1B показан профиль светорассеяния аминофункционализированного полистирола, меченных TCPP. На рисунке 1С показан профиль рассеивания света нефункционализированных бусин (немаркированных бусин); Мы используем их в качестве отрицательного контроля бусин для расчета матрицы компенсации. Популяция, обозначенная красным прямоугольником, который отсутствует в немаркированной суспензии шариков, представляет собой частицы, связанные с TCPP, образующиеся, когда TCPP подвергается воздействию связывающего реагента EDC. Такие агрегаты должны быть исключены при определении интенсивности флуоресценции (FI) шариков. На рисунке 1D показано FI меченых бусин, выбранных черным затвором на рисунке 1B, который явно на несколько бревен выше, чем FI (немаркированных) немаркированных бусин (сравнение рисунка 1D с рисунком 1E).

Доля твердых частиц (т.е. события, обозначенные красным затвором на рисунке 1B) может варьироваться в зависимости от партии маркировки. Для большинства стандартных применений проточной цитометрии суспензия шариков с 50% или менее частиц позволяет правильно настроить компенсацию в многоцветном эксперименте по проточной цитометрии с использованием TCPP. Однако есть приложения, например, где используется автоматизированный анализ данных, для которых гораздо более высокое содержание твердых частиц может помешать правильным настройкам компенсации. В таких случаях рекомендуется фильтрация (шаг протокола 9 и рисунок 2). На рисунке 3 показано влияние фильтрации на суспензию шариков, содержащую ~ 65% твердых частиц (левые панели на рисунке 3A, B). После фильтрации содержание твердых частиц снизилось до ~12%. Неблагоприятными последствиями фильтрации являются некоторая потеря шариков (не показана) и небольшая потеря FI (рис. 3C). Эти эффекты следует учитывать при рассмотрении вопроса о фильтрации шариковой суспензии. Альтернативой шариковой фильтрации для снижения содержания твердых частиц является изменение соотношения между шариками, TCPP и связующим реагентом EDC. Однако изменения в этих соотношениях также влияют на FI бусин.

Взаимосвязь между образованием твердых частиц, MFI и соотношением шариков/TCPP/EDC проиллюстрирована на рисунках 4 и 5. На рисунках 4A и 5A показан MFI меченых шариков в зависимости от соотношения EDC/TCPP и соотношения TCPP/шарика, соответственно. С увеличением коэффициентов MFI увеличивается до тех пор, пока не выйдет на плато. Репрезентативные примеры на рисунках 4В и 5В показывают, что содержание твердых частиц увеличивается с соответствующим коэффициентом увеличения. Этот протокол маркировки TCPP был оптимизирован для максимального MFI, сохраняя при этом содержание твердых частиц как можно ниже (стрелки на рисунках 4A и 5A). Твердые частицы появляются только тогда, когда EDC используется в качестве связующего реагента во время процедуры маркировки. Используя только шарики и TCPP, частицы не образуются (не показаны), но маркировка шариков приводит к получению шариков с гораздо более низким FI (сравнение рисунка 6A с рисунком 6B). Мы попытались заменить этот метод связи на основе EDC методом, основанным на активированном эфире NHS (N-гидроксисукцинимида) TCPP23. Тем не менее, мы не обнаружили существенной разницы в FI с использованием этого альтернативного метода связи по сравнению с простым использованием шариков и TCPP вместе, предполагая, что существует незначительное ковалентное связывание TCPP с шариками с помощью этого метода (сравнение рисунка 6B с рисунком 6C).

Данные, представленные на всех рисунках до сих пор, были собраны с использованием шариков диаметром 10,6 мкм. Мы предположили, что более крупные шарики могут иметь больше сайтов связывания TCPP из-за увеличенной площади поверхности и, следовательно, могут отображать более высокие FI. И наоборот, мы предположили, что меньшие шарики с меньшей площадью поверхности и меньшим количеством сайтов связывания TCPP должны отображать более низкие FI. Используя тот же протокол маркировки, что и описанный здесь, но с шариками 8,6 мкм или 20 мкм (вместо бусин 10,6 мкм), мы обнаружили прогнозируемое снижение FI в шариках 8,6 мкм по сравнению с шариками 10,6 мкм (сравнение рисунка 6D с рисунком 6A). Шарики размером 20 мкм показали зашкаливание FI для проточного цитометра, который мы использовали (данные не показаны), но эти более крупные шарики быстро после этого оседали из раствора и не преследовались дальше.

Этот протокол для мечения шариков с помощью TCPP был разработан с целью получения надежного инструмента компенсации в экспериментах по проточной цитометрии, где TCPP используется для маркировки клеток. В прошлом мы использовали для этой целиячейки A549 24, но процедура маркировки не всегда приводила к высокому FI. Кроме того, клетки, даже после фиксации, нельзя было использовать более 1 месяца. Протокол маркировки (10,6 мкм) шариков с помощью TCPP, описанный в настоящем описании, последовательно приводил к получению ярко окрашенных шариков, как показано на рисунке 1. Более того, когда те же самые шарики, меченные TCPP, были протестированы с помощью проточной цитометрии через 300 дней, мы не наблюдали значительных изменений ни в MFI, ни в содержании твердых частиц (рис. 7). Связь TCPP с шариками мало влияла на спектр флуоресцентного излучения (рис. 8A; сравнение пунктирной черной линии со сплошной черной линией, которая представляет собой спектр флуоресцентного излучения TCPP в растворе). Спектр флуоресцентного излучения шариков, меченных TCPP, больше отличался от спектра TCPP, измеренного внутри клеток рака легких A549, особенно на длинах волн 700-725 нм (рис. 8A; пунктирная черная линия по сравнению с оранжевой линией, соответственно). Однако, обладая способностью компенсировать сигнал TCPP от других сигналов в образце мокроты, меченном несколькими флуорофорами, шарики, меченные TCPP, работали так же хорошо, как и окрашенные TCPP клетки A549 (сравнение рисунка 8B с рисунком 8C соответственно).

Тем. Файлы LMD можно найти в FlowRepository (https://flowrepository.org) под идентификаторами FR-FCM-Z6ZP (рис. 1); FR-FCM-Z5UJ (рис. 3B, C); FR-FCM-Z6ZR (рис. 4B); FR-FCM-Z6ZS (рис. 5B); FR-FCM-Z6ZB (рис. 6); FR-FCM-Z6Y5 (рис. 8B); и FR-FCM-Z6ZT (рис. 8C).

Figure 1
Рисунок 1: Проверка качества бусин с маркировкой TCPP. (A) Радужные бусины. Представлена гистограмма шариков Rainbow, обнаруженных в канале, специфичном для флуорофора APC. Этот канал также может быть использован для обнаружения флуоресценции TCPP. Бусины Rainbow служат в качестве контроля качества для лазера APC; Первая и четвертая вершины должны приходиться на область, обозначенную соответствующими скобками. (Б,Г) Бусины с маркировкой TCPP. (С,Е) Немаркированные бусины. Этот конкретный образец раствора шариков, меченных TCPP, включал 51,9% шариков (черный прямоугольный затвор в B). События в красном прямоугольнике представляют собой частицы, образовавшиеся во время маркировки TCPP. Такие частицы отсутствовали в немаркированном растворе шариков (сравнение красных прямоугольников в B и C). Интенсивности флуоресценции меченных TCPP и немеченых шариков представлены в D и E соответственно. Сокращения: SSC = боковой разброс; FSC = прямой разброс; APC = аллофикоцианин; TCPP = мезо-тетра (4-карбоксифенил) порфин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схематическое изображение метода фильтрации шариков, используемого на этапах протокола 9.3-9.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние фильтрации на твердые частицы и интенсивность флуоресценции. (A) Микроскопические изображения шариков размером 10 мкм, помеченных TCPP до (изображение слева) и после фильтрации (изображение справа). Изображения были сделаны с 20-кратным усилением. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Суспензия шариков TCPP перед фильтрацией (левый профиль) включала 25,6% шариков (черный прямоугольник) и 65,7% мусора или твердых частиц (красный прямоугольник). Доля шариков в суспензии после фильтрации увеличилась до 74,7% (правый профиль; черный прямоугольник), а мусора уменьшилась до 11,9%. (C) Гистограммы TCPP FI шариков, как указано в B. Гистограмма слева представляет собой шарики, помеченные TCPP до фильтрации, с FI немного выше, чем у шариков после фильтрации (гистограмма справа). Красные линии, расположенные на FI 1 × 103 на обоих рисунках, предназначены для облегчения сравнения обеих гистограмм. Сокращения: SSC = боковой разброс; FSC = прямой разброс; APC = аллофикоцианин; TCPP = мезо-тетра (4-карбоксифенил) порфин; FI = интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Взаимосвязь между соотношением EDC/TCPP, средней интенсивностью флуоресценции (MFI) и образованием твердых частиц. (A) Представлена взаимосвязь между соотношением EDC/TCPP, используемым в протоколе маркировки шариков, и MFI последующих шариков, меченных TCPP. Кривая показывает среднее значение MFI трех независимых экспериментов ± стандартным отклонением (SD). Красная стрелка (3,75) указывает объемное соотношение решений EDC и TCPP, используемых в этом протоколе. (B) Репрезентативные профили рассеивания света суспензий шариков, приготовленные с соотношением EDC/TCPP, как указано над каждым профилем. Все профили получены из одного и того же эксперимента. Бусины обозначены черным прямоугольником. Образование твердых частиц, обозначенных красными прямоугольниками, увеличивается с увеличением соотношения EDC/TCPP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Взаимосвязь между соотношением TCPP/шариков, MFI и образованием твердых частиц. (A) Представлена взаимосвязь между объемным соотношением TCPP/шариков, используемым в протоколе маркировки валиков, и MFI последующих бусин, меченных TCPP. MFI быстро увеличивается, достигая фазы плато после соотношения TCPP / шариков, равного 2. Кривая показывает среднее значение MFI трех независимых экспериментов ± стандартным отклонением (SD). Красная стрелка (4.17) указывает на соотношение, используемое в этом протоколе. (B) Репрезентативные профили рассеивания света суспензий валиков, приготовленных с соотношением TCCP/шариков, как указано над каждым профилем. Все профили получены из одного и того же эксперимента. Бусины обозначены черными прямоугольниками. Образование твердых частиц, обозначенное красными прямоугольниками, увеличивается с увеличением соотношения TCPP / шариков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Сравнение методов соединения и используемых размеров борта. Показаны гистограммы интенсивности флуоресценции шариков, меченных TCPP. (A) Шарики размером 10,6 мкм были маркированы в соответствии с предоставленным протоколом, включая использование связующего реагента EDC. (B) То же, что и (A), но EDC был опущен в протоколе маркировки. (C) Шарики размером 10,6 мкм были маркированы с использованием сложного эфира NHS в соответствии с методом, описанным Kabe et al.23. (D) То же, что и (A), но вместо бусин размером 10,6 мкм использовались шарики размером 8,6 мкм. Вертикальные красные линии в каждом профиле произвольно установлены на 1 × 103 для облегчения сравнения гистограмм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Стабильность валиков TCPP с течением времени. Бусины с меткой TCPP (10 мкм) маркировали в соответствии с протоколом, хранили в холодильнике при температуре 4 °C и хранили в темноте. День 0 - это день маркировки. В различные моменты времени после этого аликвоты сохраненных шариков повторно анализировались с помощью проточной цитометрии. Представлены результаты измерений процентного содержания твердых частиц (А) МФО и (В) по отношению к значению 0-го дня, которое было произвольно установлено на уровне 100%. Горизонтальные оранжевые линии представляют значения на 10% выше и на 10% ниже значений в день 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Шарики TCPP по сравнению с клетками, окрашенными TCPP, в качестве компенсационных инструментов. (A) Спектры флуоресцентного излучения TCCP в растворе, TCPP, связанного с шариками, и TCPP после окрашивания клеток рака легких A549 были измерены на считывателе микропланшетов. Спектры излучения растворимого и связанного с шариками TCPP очень похожи. Оба отличаются от меченых ячеек A549 на длине волны 700 нм. (Б,В). Образец мокроты был обработан в отдельные клетки и помечен несколькими флуорофорами: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) и TCPP (FL6). Для каждого флуорофора мы подготовили одноцветные контрольные трубки, содержащие шарики в сочетании с соответствующим флуорофором. Для TCPP были установлены две контрольные трубки: одна с шариками, меченными TCPP, и одна с фиксированными ячейками A549, помеченными TCPP. Это позволило нам создать две компенсационные матрицы: (B) одну, в которой меченные TCPP шарики использовались в качестве компенсационного контроля для TCPP (FL-6), и (C) одну, в которой использовались меченные TCPP ячейки A549. Эти две компенсационные матрицы очень похожи, с наибольшей разницей в компенсации, связанной с TCPP, между TCPP (FL6) и FL-3. Сопутствующие точечные графики, отображающие эти конкретные параметры, показывают почти идентичные профили. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Реагенты, необходимые для исходного раствора TCPP. Количество NaHCO3, очищенной воды и изопропанола (IPA) основано на количестве TCPP, взвешенном на этапе 1.1 (от 49,0 мг до 50,9 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на многочисленные применения порфиринов в диагностике и терапии рака2, существует ограниченная литература об их потенциальном использовании в качестве проточного цитометрического реагента для идентификации раковых и нераковых клеточных популяций в первичных тканях человека24,25,26. Наши исследования по проточно-цитометрическому анализу мокротычеловека 24,27 требуют окрашивания диссоциированных клеток мокроты TCPP и некоторыми другими флуорофорами. Однако распространение флуоресценции TCPP в каналах обнаружения, предназначенных для других флуорофоров, означало, что в качестве компенсационного контроля требовался шарик, меченный TCPP. Однако такой бусины не было коммерчески доступно, и ее пришлось разрабатывать. Сообщалось о присоединении тетраарилпорфиринов к молекулярным ситам на основе диоксида кремния28,29. Однако частицы на основе диоксида кремния оказались непригодными для приготовления стандартов проточной цитометрии (данные не показаны). Поэтому наши исследования были сосредоточены на полистирольных шариках.

Раствор TCPP в изопропанол-воде (1:1 об./об.) 30 мечал гранулы полистирола при рН 6, но MFI был слишком низким по сравнению с окрашенными клетками в нашем анализе. Мы исследовали модификацию ковалентных шариков как способ увеличения MFI. Ковалентная модификация аминофункционализированных латексных шариков с эфиром NHS TCPP путем амидирования была ранее описана Kabe et al.23 с использованием некоммерческих шариков диаметром 2 мкм31. В исследовании, проведенном Kabe et al.23, TCPP инкубировали в ДМФА с N-гидроксисукцинимидом (NHS)32 в течение 5 ч для получения активированного моноэфира NHS TCPP. Затем этот активированный раствор сложного эфира вступали в реакцию с шариками, содержащими концевой аминный линкер. Однако, когда мы применили этот протокол к коммерческим аминофункционализированным полистирольным шарикам, маркировка привела к тому, что шарики с MFI были недостаточно яркими для компенсации. Поэтому мы исследовали прямое амидирование аминополистирольных шариков без использования промежуточного эфира NHS.

В этой работе аминофункционализированные полистирольные шарики обрабатывали TCPP в присутствии реагента амидной связи EDC для создания амидных связей между аминогруппами на шариках и карбоксигруппами на TCPP. EDC был выбран из-за его растворимости в воде, доказанной полезности в реакциях водного амидирования в широком диапазоне pH, низкой стоимости и растворимости в воде продуктами33,34. Мы прореагировали аминополистирольными шариками диаметром 8,6 мкм, 10,6 мкм и 20 мкм с TCPP и EDC в воде при рН 6. Более ранние исследования показали, что TCPP остается растворимым при этом pH, и этот pH также совместим с EDC33. Маркированные шарики размером 8,6 мкм привели к тому, что MFI был слишком низким для нашего анализа. Шарики размером 20 мкм имели достаточно высокий MFI, но были склонны к оседанию из суспензии и засорению проточного цитометра (не показаны). Шарики размером 10,6 мкм имели адекватный MFI, оставались в суспензии достаточно долго для анализа проточной цитометрии и, таким образом, были оптимизированы в качестве компенсационных стандартов. Примечательно, что эквивалентные немаркированные шарики имели низкую фоновую флуоресценцию и могли использоваться в качестве отрицательных контрольных шариков для компенсации.

Увеличение объемного отношения реагентов EDC к TCPP при сохранении постоянного количества шариков увеличивало MFI шариков до тех пор, пока не было достигнуто плато в соотношении около 2. Также наблюдалось плато MFI, поскольку отношение TCPP к шарикам увеличивалось при сохранении постоянного отношения EDC к TCPP. Поскольку TCPP мечет шарики в отсутствие EDC, плато MFI может быть результатом насыщения ковалентных и нековалентных сайтов связывания на поверхности шарика. Побочный продукт твердых частиц, связанный с TCPP, наблюдался при объединении EDC и TCPP при pH 6. Эта частица имела спектр флуоресценции, сходный с TCPP, но не образовывалась в отсутствие EDC, что позволяет предположить, что это нерастворимый побочный продукт реакции EDC с TCPP. Частицы имели неправильную форму и, хотя обычно меньше 5 мкм, могли образовывать более крупные агрегаты, а также могли прилипать к поверхности шариков. Частицы, связанные с TCPP, также наблюдались при взаимодействии шариков аминополистирола с TCPP и EDC. Количество твердых частиц увеличивалось как при более высоком соотношении EDC к TCPP, так и при более высоком соотношении TCPP к шарикам. Соотношения реагентов, выбранные в окончательном протоколе, являются ключом к успеху процедуры маркировки шариков, поскольку они гарантируют, что полученная суспензия шариков имеет высокий MFI, в то время как уровень твердых частиц остается приемлемым. Уровень твердых частиц, образующихся в настоящем протоколе, не исключает использования шариков TCPP для компенсации, однако более высокие уровни твердых частиц могут препятствовать точности настроек компенсации35. Мы также разработали процедуру фильтрации, которая может значительно снизить уровень твердых частиц, если они будут присутствовать на высоком уровне.

Мы провели нашу реакцию с помощью вращающейся мешалки. Если не перемешивать реакцию, это приводит к более медленному окрашиванию (данные не показаны). Рекомендуется время реакции 16 часов. Более длительное время реакции (>24 ч) приводит к более высоким уровням частиц TCPP, в то время как более короткое время реакции (<8 ч) приводит к более низкому MFI шариков. Для контроля немеченых шариков мы не использовали аминофункционализированные шарики, которые не были помечены TCPP, потому что автофлуоресценция немеченых шариков мешала правильному расчету компенсационных матриц. Вместо этого мы использовали нефункционализированные полистирольные шарики, похожие по марке и размеру. Кроме того, мы хранили немаркированные бусины и бусины с маркировкой TCPP в отдельных тюбиках. С обоими наборами шариков в одной и той же трубке мы наблюдали некоторый перенос TCPP на немаркированные шарики (данные не показаны), что вызвало сдвиг вправо в MFI, что препятствовало правильному расчету компенсационной матрицы.

Таким образом, критическими точками для достижения высокого MFI шариков, меченных TCPP, являются соотношения реагентов, используемые во время реакции окрашивания, время реакции окрашивания и диаметр немеченных шариков. В этой работе протокол, описанный выше, предоставил окрашенные TCPP шарики, которые были соответствующего размера для использования в проточном цитометре и были достаточно флуоресцентными для компенсации. Шарики, окрашенные TCPP, не теряли значительного MFI при 4 ° C в течение 300 дней. Спектр флуоресценции шариков TCPP был сопоставим со спектром TCPP в растворе. Более того, компенсационные матрицы, рассчитанные с помощью шариков, меченных TCPP, и окрашенных клеток A549 генерировали практически идентичные профили мокроты в нашем анализе, демонстрируя полезность этих шариков.

В этом протоколе описывается приготовление компенсационных шариков TCPP, которые были полезны на приборе Navios EX, но эти же шарики могут не работать на другом приборе с другой чувствительностью36 и другой конфигурациейдетектора 20. Тем не менее, эта работа предлагает способы модуляции флуоресценции через размер шариков и соотношение реагентов. TCPP является лишь одним из нескольких флуоресцентных порфиринов, которые продемонстрировали селективность раковых клеток in vitro и in vivo2,37,38,39. Не все флуоресцентные порфирины могут связываться с аминофункционализированными полистирольными шариками, используемыми в этом протоколе. На самом деле, использование этих шариков ограничивается порфиринами, которые содержат карбоновую кислоту. Дифференциальное окрашивание различных клеточных популяций в образцах тканей человека порфиринами, измеренное с помощью проточной цитометрии, может дать представление о раннем развитии рака, его прогрессировании и прогнозе. Использование других порфиринов для окрашивания образцов тканей человека и их анализа методом проточной цитометрии с использованием соответствующих контрольных шариков в качестве компенсационных эталонов является привлекательным направлением для дальнейших исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все авторы являются сотрудниками компании bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Родригеса за помощь в подготовке фигуры и Precision Pathology Services (Сан-Антонио, Техас) за использование проточного цитометра Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
  2. Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
  3. Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
  4. Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
  5. Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
  6. Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
  7. Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
  8. Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis - The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
  9. Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
  10. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  11. Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
  12. Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
  13. Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
  14. Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
  15. Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
  16. Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
  17. Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
  18. Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
  19. Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
  20. Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
  21. Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
  22. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.14 (2002).
  23. Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
  24. Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
  25. Garwin, J. L. US6838248B2 - Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine. , Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005).
  26. Cole, D. A., Moody, D. C., Ellinwood, L. E., Klein, M. G. Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung. , Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992).
  27. Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
  28. Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
  29. Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
  30. Garwin, J. L. US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP. , Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023).
  31. Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
  32. Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
  33. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  34. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  35. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
  36. Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.3 (2005).
  37. Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
  38. Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
  39. El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193 Проточная цитометрия компенсационный контроль флуорофор маркировка аминофункционализированные шарики амидирование порфирин
Гранулы, модифицированные порфирином, для использования в качестве компенсационного контроля в проточной цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R.,… More

Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter