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Chemistry

Pérolas Modificadas com Porfirina para Uso como Controle de Compensação em Citometria de Fluxo

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

O protocolo descreve como esferas de compensação à base de porfirina para citometria de fluxo são preparadas pela reação de esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com a porfirina TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC. Um procedimento de filtração é usado para reduzir os subprodutos particulados.

Abstract

A citometria de fluxo pode caracterizar e quantificar rapidamente diversas populações celulares com base em medidas de fluorescência. As células são primeiramente coradas com um ou mais reagentes fluorescentes, cada um funcionalizado com uma molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se liga às células seletivamente com base em suas características fenotípicas, como a expressão de antígenos de superfície celular. A intensidade de fluorescência de cada reagente ligado às células pode ser medida no citômetro de fluxo usando canais que detectam uma faixa especificada de comprimentos de onda. Quando múltiplos fluoróforos são usados, a luz de fluoróforos individuais geralmente transborda para canais de detecção indesejados, o que requer uma correção nos dados de intensidade de fluorescência em um processo chamado compensação.

Partículas de controle de compensação, tipicamente esferas de polímero ligadas a um único fluoróforo, são necessárias para cada fluoróforo usado em um experimento de marcação celular. Os dados das partículas de compensação do citômetro de fluxo são usados para aplicar uma correção nas medidas de intensidade de fluorescência. Este protocolo descreve a preparação e purificação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas covalentemente com o reagente fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) e sua aplicação na compensação por citometria de fluxo. Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP e o reagente de acoplamento amida EDC (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) em pH 6 e à temperatura ambiente por 16 h com agitação. As esferas de TCPP foram isoladas por centrifugação e ressuspensas em tampão pH 7 para armazenamento. Partículas relacionadas ao TCPP foram observadas como subproduto. O número dessas partículas poderia ser reduzido usando um protocolo de filtração opcional. As esferas TCPP resultantes foram usadas com sucesso em um citômetro de fluxo para compensação em experimentos com células de escarro humano marcadas com múltiplos fluoróforos. As esferas de TCPP mostraram-se estáveis após armazenamento em geladeira por 300 dias.

Introduction

As porfirinas têm sido de interesse há muitos anos na área biomédica devido às suas propriedades fluorescentes e de direcionamento tumoral 1,2,3. Aplicações terapêuticas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia sonodinâmica (TSD) envolvem a administração sistêmica de uma porfirina a um paciente com câncer, o acúmulo da droga no tumor e a exposição localizada do tumor a uma luz laser de um comprimento de onda específico ou ultrassom. A exposição à luz laser ou ao ultrassom leva à geração de espécies reativas de oxigênio pela porfirina e subsequente morte celular 4,5. No diagnóstico fotodinâmico (TID), a fluorescência da porfirina é usada para distinguir células cancerosas de células normais6. Nesse contexto, a protoporfirina IX, uma porfirina fluorescente natural que se acumula nos tumores após a injeção sistêmica ou local de seu precursor, o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), é utilizada para identificar tumores estromais gastrointestinais, câncer de bexiga e câncercerebral7,8. Mais recentemente, o tratamento com 5-ALA foi explorado como uma abordagem para detectar doença residual mínima no mielomamúltiplo9. Nosso laboratório vem utilizando a tetraarila porfirina TCPP (5,10,15,20-tetraquis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por sua capacidade de corar seletivamente células de câncer de pulmão e células associadas ao câncer em amostras de escarro humano, propriedade que tem sido explorada em ensaios diagnósticos baseados em lâminas e citometria de fluxo10.

Algumas porfirinas são bifuncionais, podendo ser utilizadas como agentes terapêuticos ediagnósticos 2,11. Em pesquisas biomédicas, tais porfirinas bifuncionais são utilizadas para avaliar como sua capacidade de atingir e matar seletivamente células cancerosas é função de sua estrutura, bem como é afetada pela presença de outros compostos 12,13,14,15,16. Tanto a captação celular de porfirinas quanto sua citotoxicidade podem ser medidas em uma plataforma de citometria de fluxo de maneira de alto rendimento. Os espectros de absorção e emissão de porfirinas fluorescentes são complexos, mas a maioria das plataformas de citometria de fluxo está equipada para identificá-los corretamente. O espectro de absorção das porfirinas fluorescentes é caracterizado por uma forte banda de absorção na faixa de 380-500 nm, conhecida como banda de Soret. Duas a quatro bandas de absorção mais fracas são geralmente observadas na faixa de 500-750 nm (bandas Q)17. Um laser azul de 488 nm, presente na maioria dos citômetros de fluxo, ou um laser violeta (405 nm) podem gerar luz do comprimento de onda apropriado para excitar porfirinas. Os espectros de emissão das porfirinas tipicamente exibem picos na faixa de 600-800 nm18, o que resulta em muito pouca sobreposição espectral com fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína ou ficoeritrina (PE), mas considerável sobreposição com outros fluoróforos frequentemente usados, como aloficocianina (APC), bem como fluoróforos tandem, como PE-Cy5 e outros. Portanto, ao usar porfirinas em ensaios de citometria de fluxo multicolorida, controles de fluoróforo único são essenciais para corrigir adequadamente o transbordamento da fluorescência em canais diferentes daquele designado para medir a fluorescência da porfirina.

Idealmente, os controles de fluoróforo único usados para calcular a matriz de transbordamento para um painel de fluoróforos (também chamados de "controles de compensação") devem consistir no(s) mesmo(s) tipo(s) de célula que a amostra. No entanto, usar a amostra para esse propósito não é ideal se houver muito pouca amostra para começar ou se a população-alvo dentro da amostra for muito pequena (por exemplo, se quisermos olhar para doença residual mínima ou células cancerosas nos estágios iniciais da doença). Uma alternativa útil às células são as esferas acopladas ao mesmo fluoróforo que é usado para analisar a amostra. Muitas dessas contas estão disponíveis comercialmente; Essas esferas são pré-marcadas com o fluoróforo desejado (esferas específicas de fluoróforo pré-marcadas)19,20, ou um anticorpo fluorescentemente marcado pode ser anexado a elas (esferas de captura de anticorpos)20,21. Enquanto esferas de compensação comercial estão disponíveis para muitos fluoróforos, tais contas não estão disponíveis para porfirinas, apesar de seu uso crescente em pesquisa básica e clínica.

Além da preservação da amostra e do dimensionamento adequado das populações positivas versus negativas, as outras vantagens do uso de esferas como controles de compensação são a facilidade de preparo, a baixa fluorescência de fundo e a excelente estabilidade ao longo do tempo22. A desvantagem potencial do uso de contas como um controle de compensação é que o espectro de emissão do anticorpo fluorescente capturado em esferas pode diferir daquele do mesmo anticorpo usado para marcar as células. Isso pode ser de importância específica quando se utiliza um citômetro de fluxo espectral20. Portanto, o desenvolvimento de contas como controle de compensação precisa ser realizado no citômetro de fluxo que será utilizado para o ensaio para o qual as contas são desenvolvidas. Além disso, o desenvolvimento das esferas precisa incluir uma comparação com células marcadas com o mesmo reagente de coloração fluorescente.

Aqui, descrevemos a preparação de esferas de compensação de poliestireno funcionalizadas com amina TCPP, cuja intensidade mediana de fluorescência no canal de detecção foi comparável à das células marcadas com TCPP no escarro, e seu uso como controles de compensação para citometria de fluxo. A autofluorescência de esferas equivalentes não funcionalizadas foi suficientemente baixa para seu uso como controles de compensação de fluorescência negativa. Além disso, essas contas demonstraram estabilidade no armazenamento por quase 1 ano.

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Protocol

Todos os procedimentos precisam ser feitos com equipamentos de proteção individual adequados.

1. Preparo da solução-estoque de TCPP, 1,0 mg/mL

NOTA: Isso pode ser preparado mensalmente.

  1. Usando uma balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar 49,0-50,9 mg de TCPP. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama. Separe a quantidade medida de TCPP protegida da luz.
    Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é instável.
  2. Determinar as quantidades necessárias de água purificada e isopropanol (IPA) da Tabela 1 com base na quantidade de TCPP pesada na etapa 1.1. Adicione a água purificada e o isopropanol a um copo de vidro de 100 mL e cubra com parafilme para proteger da evaporação.
  3. Determinar a quantidade necessária de bicarbonato de sódio na Tabela 1 com base na quantidade de TCPP pesada na etapa 1.1 .
  4. Usando a balança analítica, espátula e papel de pesagem, pesar a quantidade necessária de bicarbonato de sódio determinada na etapa 1.3. Arredondar o peso para 1/10 de miligrama.
    Observação : use uma arma estática se a leitura de peso é instável.
  5. Adicionar o bicarbonato de sódio ao copo de 100 mL contendo água purificada e isopropanol. Cubra a solução com parafilme para proteger da evaporação.
  6. Coloque a solução do passo 1.5 num prato agitado e mexa até dissolver (aprox. 10 min)
  7. Medir o pH para garantir que a solução contendo bicarbonato de sódio do passo 1.6 tem um pH entre 9 e 10.
  8. Adicione lentamente o TCPP pesado no passo 1.1 à solução do passo 1.7 e continue a mexer até dissolver (~30 min). Proteja da luz durante esta etapa.
  9. Conservar num recipiente de vidro ou polipropileno à temperatura ambiente e protegido da luz.

2. Preparação de ácido 2-(N-morfolino)-etanossulfónico (MES) e solução tampão de sal hemissódico, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampão MES")

NOTA: Este deve ser preparado no dia da utilização e mantido à temperatura ambiente.

  1. Pesar 2,50 g de sal hemissódico MES e adicioná-lo a um frasco plástico de 150 ml.
  2. Adicionar 121 mL de água purificada e dissolver por agitação manual até que nenhum sólido seja visível.
  3. Medir o pH do tampão MES para garantir que está entre 6 e 6.2.
  4. Manter em temperatura ambiente para uso no mesmo dia.

3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) pó

  1. Retire o pó de EDC do congelador e deixe descansar à temperatura ambiente até ser utilizado no passo 5.

4. Combinando esferas de poliestireno funcionalizadas com amina com solução TCPP

  1. Adicionar 4,3 ml da solução tampão 0,1 M MES preparada no passo 2 a um tubo de polipropileno de 15 ml.
  2. Vortex a suspensão de esferas de poliestireno funcionalizado com amina (10 μm, 2,5% p/v) por 60 s na velocidade máxima.
  3. Adicionar 288 μL desta suspensão de contas recém-vórtice ao tampão MES a partir do passo 4.1.
  4. Vórtice a solução MES/grânulos por 15 s na velocidade máxima.
  5. Vórtice a solução de TCPP 1 mg/mL preparada na etapa 1 por 60 s na velocidade máxima.
  6. Adicionar 1,20 ml desta solução-mãe TCPP recém-vórtice à suspensão MES/grânulos do passo 4.4.
  7. Vórtice a suspensão MES/bead/TCPP por 15 s na velocidade máxima.
  8. Cubra o tubo com papel alumínio enquanto a solução de EDC é preparada.

5. Preparação da solução-mãe de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) hidrocolédeo (HCl)

NOTA: A solução de EDC é perecível e deve ser usada imediatamente após a preparação.

  1. Adicionar 20,0 mL de água purificada a um novo tubo cônico de 50 mL.
  2. Pesar 200 mg de EDC HCl a partir do passo 3 e adicioná-lo à água (passo 5.1).
  3. Vortex o EDC HCL por 15 s na velocidade máxima para gerar uma solução clara.

6. Preparação da solução de trabalho EDC HCl/MES

NOTA: A solução EDC HCl/MES é perecível e deve ser utilizada imediatamente após a preparação.

  1. Adicionar 54,0 ml de solução tampão MES (preparada no passo 2) a um frasco de plástico de 150 ml.
  2. Adicionar 6,0 ml da solução-mãe EDC HCl (preparada no passo 5) à solução-tampão MES e misturar agitando durante 10 s.

7. Rotulando as contas com TCPP

  1. Adicionar 4,5 ml de solução de trabalho EDC (a partir do passo 6) ao tubo de polipropileno de 15 ml que contém as esferas e o TCPP no tampão MES (passo 4.7).
  2. Coloque o tubo num rotador inversor a 35 rpm durante 16 h à temperatura ambiente e protegido da luz.
  3. Centrifugar o tubo à temperatura ambiente durante 10 min a 1.000 × g.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as esferas em 0,8 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS).
  5. Transferir a solução de esferas para um frasco para injetáveis de polipropileno âmbar com uma pipeta de 1 ml e conservar a 4 °C até nova utilização.
    NOTA: As contas são estáveis por pelo menos 3 meses neste momento.

8. Verificação da qualidade (QC) das esferas de TCPP por citometria de fluxo

NOTA: O CQ deve centrar-se em saber se a intensidade média de fluorescência (MFI) das esferas TCPP é suficientemente brilhante para a sua utilização pretendida e a quantidade de partículas geradas pelo procedimento. Consulte a seção de resultados representativos para obter mais detalhes.

  1. Rotule um tubo de poliestireno de 5 mL como "contas TCPP negativas".
    NOTA: As contas negativas são diferentes das contas funcionalizadas com amina usadas para rotulagem. Veja a Tabela de Materiais.
  2. Rotule outro tubo como "contas TCPP positivas".
  3. Rotule outro tubo como "contas do arco-íris".
  4. Alíquota 300 μL de HBSS gelado nos tubos marcados com "contas TCPP negativas" e "contas TCPP positivas".
  5. Adicione 500 μL de HBSS gelado no tubo rotulado como "Contas do arco-íris".
  6. Vórtice a suspensão de esferas de poliestireno não funcionalizado (não rotulado) brevemente à velocidade máxima (2-3 s) e adicione 10 μL dela ao tubo rotulado como "contas negativas TCPP".
  7. Vórtice a suspensão de contas marcada com TCPP (finalizada na etapa 7.5) brevemente na velocidade máxima e adicione 3 μL dela ao tubo "contas positivas TCPP".
  8. Vortex a suspensão de contas Rainbow brevemente na velocidade máxima, e adicione duas gotas dela no tubo "Rainbow beads".
  9. Mantenha todos os tubos no gelo, cobertos e protegidos da luz.
  10. Inicie os procedimentos de inicialização diários apropriados do citômetro de fluxo e execute um CQ para verificar os fluidos ideais e o alinhamento do laser.
    OBS: Para esta parte do protocolo, presume-se que o operador seja treinado no uso do citômetro de fluxo disponível, incluindo os procedimentos de padronização da dispersão de luz e intensidade de fluorescência, bem como os princípios básicos de cálculo da matriz de compensação correta.
  11. Execute as contas Rainbow e as contas TCPP sem alterar as configurações de tensão entre as diferentes corridas.
    1. Corra e colete 10.000 eventos das contas do arco-íris.
    2. Realize um enxágue com água e colete 10.000 eventos das contas TCPP-negativas.
    3. Realize um enxágue com água e colete 10.000 eventos das contas TCPP-positivas.
    4. Realize um enxágue com água de 1 min.
      OBS: É importante realizar um enxágue com água após passar as contas TCPP. Se o TCPP não for enxaguado das linhas no citômetro, existe a possibilidade de que o TCPP residual possa marcar as células no próximo tubo a ser adquirido.
    5. Executar os protocolos de limpeza e desligamento apropriados específicos para as instruções do fabricante para o citômetro.
      NOTA: Para obter resultados representativos, consulte a Figura 1.

9. Filtração de contas

NOTA: Se o CQ das esferas por citometria de fluxo (passo 8) mostrar uma alta proporção de partículas (70% ou mais), considere filtrar a suspensão do cordão usando o protocolo abaixo (Figura 2).

  1. Adicionar 3,20 mL de HBSS gelado a 0,8 mL da suspensão do cordão TCPP finalizada na etapa 7.5 (criando uma diluição de cinco vezes).
  2. Vórtice a suspensão de esferas diluídas à velocidade máxima durante 15 s.
  3. Retire o êmbolo de uma seringa descartável de 5 mL.
  4. Encaixe a seringa com um filtro de ponta de fibra de vidro (5 μm, 13 mm de diâmetro).
  5. Adicionar 4 ml de HBSS à seringa.
  6. Adicionar 0,5 ml da suspensão de grânulos diluídos em vórtice (passo 9.2).
  7. Use o êmbolo para filtrar a suspensão através da configuração da seringa/filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  8. Lave as contas retirando 5 mL de HBSS fresco para a seringa através do filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  9. Empurre o HBSS novamente para o recipiente de resíduos a aproximadamente 2 gotas/s.
  10. Para remover as contas do filtro, introduza mais 5 ml de HBSS fresco na seringa através do filtro.
  11. Retire cuidadosamente o filtro da seringa.
  12. Ejetar a suspensão do talão da seringa para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL.
  13. Coloque o filtro novamente na seringa e repita as etapas 9.10-9.12 mais quatro vezes. Em seguida, descarte o filtro e a seringa.
  14. Repita as etapas 9.2-9.13 até que todas as contas da etapa 9.1 tenham sido filtradas. Use uma seringa fresca e filtre cada vez.
  15. Centrifugar as suspensões de esferas filtradas por 10 min a 1.000 × g à temperatura ambiente.
  16. Aspirar o sobrenadante de cada tubo de 50 mL e ressuspender suavemente as contas, combinando-as em 0,5 mL de HBSS fresco.
  17. Transfira as contas com uma micropipeta p1.000 para um novo frasco para injetáveis de âmbar, vidro ou polipropileno e armazene a 4 °C.
  18. Repita a etapa 8 para determinar se a proporção de partículas relacionadas ao TCPP na suspensão do cordão filtrado diminuiu. Para obter resultados representativos, consulte a Figura 3.

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Representative Results

Este protocolo para a marcação TCPP de contas é relativamente rápido e eficiente. A Figura 1 mostra um resultado representativo do processo de marcação de esferas TCPP determinado por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra o perfil padronizado das contas Rainbow, conforme detectado no canal apropriado para detecção de TCPP. Essas esferas servem como um QC para a padronização das tensões do laser para a detecção de TCPP pelo citômetro de fluxo. A Figura 1B mostra o perfil de dispersão de luz de esferas de poliestireno funcionalizado com amina, marcadas com TCPP. A Figura 1C mostra o perfil de dispersão de luz de contas não funcionalizadas (contas não rotuladas); Nós os usamos como um controle de contas negativo para calcular a matriz de compensação. A população indicada pelo retângulo vermelho, que está ausente na suspensão de esferas não marcadas, representa as partículas relacionadas ao TCPP formadas quando o TCPP é exposto ao reagente de acoplamento EDC. Tais agregados devem ser excluídos quando a intensidade de fluorescência (FI) das esferas for determinada. A Figura 1D mostra o FI das contas marcadas, selecionadas pelo portão preto na Figura 1B, que é claramente vários logs mais alto do que o FI das contas (unguiadas) não rotuladas (comparando a Figura 1D com a Figura 1E).

A proporção de partículas (ou seja, os eventos indicados pelo portão vermelho na Figura 1B) pode variar por lote de rotulagem. Para a maioria das aplicações de citometria de fluxo padrão, uma suspensão de esferas com 50% de partículas ou menos permite configurar corretamente a compensação em um experimento de citometria de fluxo multicolorido usando TCPP. No entanto, há aplicações, por exemplo, em que a análise automatizada de dados é usada, para a qual um conteúdo de partículas muito maior pode interferir nas configurações de compensação adequadas. Nesses casos, recomenda-se a filtração (protocolo passo 9 e Figura 2). A Figura 3 mostra o efeito da filtração sobre a suspensão do cordão que compreendia ~65% de particulados (painéis à esquerda da Figura 3A,B). Após a filtração, o teor de partículas diminuiu para ~12%. Os efeitos adversos da filtração são alguma perda de contas (não mostrada) e uma leve perda de FI (Figura 3C). Estes efeitos devem ser tidos em conta quando se pondera a filtração da suspensão do cordão. Uma alternativa à filtração de esferas para diminuir o conteúdo de partículas é alterar a relação entre as contas, o TCPP e o reagente de acoplamento EDC. No entanto, alterações nessas proporções também afetam a IA das contas.

A relação entre a formação de partículas, MFI e a relação cordão/TCPP/EDC é ilustrada na Figura 4 e na Figura 5. A Figura 4A e a Figura 5A mostram a MFI das contas marcadas em função da razão EDC/TCPP e da razão TCPP/talão, respectivamente. Com o aumento dos rácios, o IFM aumenta até estabilizar. Os exemplos representativos da Figura 4B e da Figura 5B mostram que o teor de partículas aumenta com a respectiva razão crescente. Esse protocolo de marcação TCPP foi otimizado para máxima MFI, mantendo o conteúdo de partículas o mais baixo possível (setas na Figura 4A e Figura 5A). As partículas só aparecem quando o EDC é usado como reagente de acoplamento durante o procedimento de rotulagem. Usando apenas contas e TCPP, as partículas não são formadas (não mostradas), mas a marcação das contas resulta em contas com FI muito menor (comparando a Figura 6A com a Figura 6B). Tentamos substituir este método de acoplamento baseado em EDC por um método baseado em um éster NHS (N-hidroxisuccinimida) ativado de TCPP23. No entanto, não encontramos diferença significativa no FI usando este método alternativo de acoplamento em comparação com apenas o uso de contas e TCPP juntos, sugerindo que há uma ligação covalente insignificante de TCPP às esferas com este método (comparando a Figura 6B com a Figura 6C).

Os dados apresentados em todas as figuras até o momento foram coletados utilizando-se esferas de 10,6 μm de diâmetro. Nós hipotetizamos que contas maiores podem ter mais sítios de ligação TCPP devido à maior área de superfície e, portanto, poderiam exibir maior FI. Por outro lado, levantamos a hipótese de que contas menores com áreas de superfície menores e menos sítios de ligação TCPP deveriam exibir FI mais baixo. Usando o mesmo protocolo de marcação descrito aqui, mas com contas de 8,6 μm ou contas de 20 μm (em vez de contas de 10,6 μm), encontramos a redução prevista na IA nas esferas de 8,6 μm em comparação com as esferas de 10,6 μm (comparando a Figura 6D com a Figura 6A). As esferas de 20 μm exibiram um FI fora da escala para o citômetro de fluxo que usamos (dados não mostrados), mas essas esferas maiores se estabeleceram fora da solução rapidamente depois e não foram mais desenvolvidas.

Este protocolo para marcação de esferas com TCPP foi desenvolvido com o propósito de ter uma ferramenta de compensação confiável em experimentos de citometria de fluxo onde TCPP é usado para marcar células. No passado, usamos células A549 para esse fim24, mas o procedimento de marcação nem sempre resultou em um alto FI. Além disso, as células, mesmo após a fixação, não puderam ser utilizadas por mais de 1 mês. O protocolo de marcação (10,6 μm) de contas com TCPP descrito aqui resultou consistentemente em contas coradas brilhantemente, como mostrado na Figura 1. Além disso, quando as mesmas esferas marcadas com TCPP foram testadas por citometria de fluxo após 300 dias, não observamos alteração significativa no IFM nem no conteúdo particulado (Figura 7). O acoplamento do TCPP às esferas teve pouco efeito sobre seu espectro de emissão de fluorescência (Figura 8A; comparando a linha preta tracejada com a linha preta sólida, que representa o espectro de emissão de fluorescência do TCPP em solução). O espectro de emissão de fluorescência de esferas marcadas com TCPP diferiu mais do espectro de TCPP medido dentro de células de câncer de pulmão A549, especialmente em torno dos comprimentos de onda de 700-725 nm (Figura 8A; linha preta tracejada em comparação com a linha laranja, respectivamente). No entanto, com a capacidade de compensar o sinal TCPP dos outros sinais em uma amostra de escarro marcada com múltiplos fluoróforos, as esferas marcadas com TCPP funcionaram igualmente bem que as células A549 coradas com TCPP (comparando a Figura 8B com a Figura 8C, respectivamente).

O. Os arquivos LMD podem ser encontrados no FlowRepository (https://flowrepository.org), sob os IDs FR-FCM-Z6ZP (Figura 1); FR-FCM-Z5UJ (Figura 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (Figura 4B); FR-FCM-Z6ZS (Figura 5B); FR-FCM-Z6ZB (Figura 6); FR-FCM-Z6Y5 (Figura 8B); e FR-FCM-Z6ZT (Figura 8C).

Figure 1
Figura 1: Verificação de qualidade das contas rotuladas com TCPP. (A) Contas arco-íris. Apresenta-se o histograma das contas de Rainbow detectadas no canal específico para o fluoróforo APC. Este canal também pode ser usado para detectar fluorescência TCPP. As contas do arco-íris servem como um QC para o laser APC; O primeiro e o quarto picos devem cair na região indicada pelos respectivos parênteses. (B,D) Contas rotuladas com TCPP. (C,E) Contas sem rótulo. Esta amostra particular de solução de contas marcada com TCPP incluiu 51,9% de contas (porta retangular preta em B). Os eventos no retângulo vermelho representam as partículas que se formaram durante a marcação TCPP. Tais partículas estavam ausentes na solução do grânulo não marcado (comparando os retângulos vermelhos em B e C). As intensidades de fluorescência das esferas marcadas e não marcadas com TCPP são apresentadas em D e E, respectivamente. Abreviações: SSC = dispersão lateral; FSC = dispersão para frente; APC = aloficocianina; TCPP = meso-tetra(4-carboxifenil) porfina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Representação esquemática do método de filtragem de contas usado nas etapas de protocolo 9.3-9.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Efeitos da filtração sobre as partículas e a intensidade da fluorescência. (A) Imagens microscópicas de esferas de 10 μm marcadas com TCPP antes (foto à esquerda) e após a filtração (imagem à direita). As imagens foram obtidas em amplificação de 20x. Barra de escala = 20 μm. (B) A suspensão do cordão TCPP antes da filtração (perfil esquerdo) incluiu 25,6% de contas (retângulo preto) e 65,7% de detritos ou particulados (retângulo vermelho). A proporção de contas na suspensão aumentou para 74,7% após a filtração (perfil direito; retângulo preto), e os detritos diminuíram para 11,9%. (C) Histogramas do TCPP FI das contas identificadas em B. O histograma à esquerda representa as esferas marcadas com TCPP antes da filtração, com um FI ligeiramente maior do que o das contas após a filtração (histograma à direita). As linhas vermelhas, colocadas em um FI de 1 × 103 em ambas as figuras, são para facilitar a comparação de ambos os histogramas. Abreviações: SSC = dispersão lateral; FSC = dispersão para frente; APC = aloficocianina; TCPP = meso-tetra(4-carboxifenil) porfina; FI = intensidade de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Relação entre a relação EDC/TCPP, a intensidade mediana da fluorescência (MFI) e a formação de partículas. (A) Apresenta-se a relação entre a relação EDC/TCPP utilizada no protocolo de marcação de contas e a IFM das esferas marcadas com TCPP subsequentes. A curva mostra a média do IFM de três experimentos independentes ± desvio padrão (DP). A seta vermelha (3,75) indica a razão volumétrica das soluções EDC e TCPP utilizadas neste protocolo. (B) Perfis representativos de dispersão leve das suspensões de talões preparadas com as relações EDC/TCPP indicadas acima de cada perfil. Todos os perfis são derivados do mesmo experimento. As contas são indicadas pelo retângulo preto. A formação de partículas, indicada pelos retângulos vermelhos, aumenta com o aumento das relações EDC/TCPP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Gráfico 5. Relação entre a razão TCPP/grânulos, MFI e formação de partículas. (A) Apresenta-se a relação entre a razão volumétrica TCPP/contas usada no protocolo de marcação de contas e a MFI das contas marcadas com TCPP subsequentes. A MFI aumenta rapidamente, atingindo uma fase de platô após uma relação TCPP/contas de 2. A curva mostra a média do IFM de três experimentos independentes ± desvio padrão (DP). A seta vermelha (4,17) indica a razão utilizada neste protocolo. (B) Perfis representativos de dispersão luminosa das suspensões de contas preparadas com as relações TCCP/contas indicadas acima de cada perfil. Todos os perfis são derivados do mesmo experimento. As contas são indicadas pelos retângulos pretos. A formação de partículas, indicada pelos retângulos vermelhos, aumenta com o aumento da relação TCPP/cordão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Comparação dos métodos de acoplamento e tamanhos de talões utilizados. São mostrados histogramas da intensidade de fluorescência das esferas marcadas com TCPP. (A) As esferas de 10,6 μm foram marcadas de acordo com o protocolo fornecido, incluindo o uso do reagente de acoplamento EDC. (B) O mesmo que (A), mas o EDC foi omitido durante o protocolo de rotulagem. (C) As esferas de 10,6 μm foram marcadas com o éster da NHS, de acordo com o método descrito por Kabe et al.23. (D) O mesmo que (A), mas em vez de contas de 10,6 μm, foram usadas contas de 8,6 μm. As linhas vermelhas verticais em cada perfil são arbitrariamente definidas em 1 × 103 para facilitar as comparações entre os histogramas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Estabilidade das esferas TCPP ao longo do tempo. As esferas marcadas com TCPP (10 μm) foram rotuladas de acordo com o protocolo, armazenadas em geladeira a 4 °C e mantidas no escuro. Dia 0 é o dia da rotulagem. Em vários momentos, as alíquotas das esferas armazenadas foram reanalisadas por citometria de fluxo. São apresentadas medidas da (A) IFM e (B) porcentagem de partículas em relação ao valor do dia 0, que foi arbitrariamente fixado em 100%. As linhas horizontais laranjas representam os valores 10% acima e 10% abaixo daqueles do dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Contas de TCPP comparadas às células coradas com TCPP como ferramentas de compensação. (A) Os espectros de emissão de fluorescência de TCCP em solução, TCPP acoplado a esferas e TCPP após a coloração de células de câncer de pulmão A549 foram medidos em um leitor de microplacas. Os espectros de emissão de TCPP solúvel e ligado a esferas são muito semelhantes. Ambos diferem das células A549 marcadas em torno do comprimento de onda de 700 nm. (B,C). Uma amostra de escarro foi processada em células únicas e marcada com fluoróforos múltiplos: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) e TCPP (FL6). Para cada fluoróforo, foram preparados tubos controle de cor única contendo esferas acopladas ao fluoróforo relevante. Para o TCPP, dois tubos controle foram configurados: um com esferas marcadas com TCPP e outro com células A549 fixas marcadas com TCPP. Isso nos permitiu criar duas matrizes de compensação: (B) uma em que as esferas marcadas com TCPP foram usadas como controle de compensação para TCPP (FL-6) e (C) uma em que células A549 marcadas com TCPP foram usadas. Essas duas matrizes de compensação são muito semelhantes, com a maior diferença na compensação relacionada ao TCPP entre TCPP (FL6) e FL-3. Os gráficos de pontos que acompanham esses parâmetros específicos mostram perfis quase idênticos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Reagentes necessários para a solução-mãe TCPP. As quantidades de NaHCO3, água purificada e isopropanol (IPA) são baseadas na quantidade de TCPP pesada na etapa 1.1 (entre 49,0 mg e 50,9 mg). Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Apesar das inúmeras aplicações das porfirinas no diagnóstico e terapêutica docâncer2, há pouca literatura sobre seu potencial uso como reagente de citometria de fluxo para a identificação de populações de células cancerosas versus não cancerosas em tecidos humanos primários24,25,26. Nossa pesquisa na análise por citometria de fluxo do escarro humano24,27 requer a coloração de células dissociadas do escarro com TCPP e vários outros fluoróforos. No entanto, o transbordamento de fluorescência de TCPP nos canais de detecção designados para outros fluoróforos significava que um cordão marcado com TCPP era necessário como um controle de compensação. No entanto, tal grânulo não estava disponível comercialmente e teve que ser desenvolvido. A ligação de tetraaril porfirinas a peneiras moleculares à base de dióxido de silício28,29 tem sido relatada. No entanto, as partículas à base de dióxido de silício mostraram-se inadequadas para a preparação de padrões de citometria de fluxo (dados não mostrados). Portanto, nossos estudos se concentraram em esferas de poliestireno.

Uma solução de TCPP em água isopropanol (1:1 v/v)30 marcou as esferas de poliestireno em pH 6, mas o IFM foi muito baixo em relação às células coradas em nosso ensaio. Exploramos a modificação de esferas covalentes como forma de aumentar a MFI. A modificação covalente das esferas de látex funcionalizadas com amina com o éster NHS de TCPP através da amidação foi previamente descrita por Kabe et al.23 usando esferas não comerciais de 2 μm de diâmetro31. No estudo de Kabe et al.23 , o TCPP foi incubado em DMF com N-hidroxisuccinimida (NHS)32 por 5 h para preparar um monoéster ativado do NHS de TCPP. Esta solução de éster ativado foi então reagida com esferas contendo um ligante de amina terminal. No entanto, quando aplicamos este protocolo a esferas comerciais de poliestireno funcionalizado com amina, a marcação resultou em esferas com MFI insuficientemente brilhantes para compensação. Portanto, exploramos a amidação direta de esferas de poliestireno de amina sem o uso de um intermediário éster NHS.

Neste trabalho, esferas de poliestireno funcionalizadas com amina foram tratadas com TCPP na presença do reagente de acoplamento amida EDC para gerar ligações amidas entre os grupos amino nas esferas e os grupos carboxi no TCPP. O EDC foi selecionado devido à sua solubilidade aquosa, utilidade comprovada em reações de amidação aquosa em uma ampla faixa de pH, baixo custo e solúvel em água por produtos33,34. Reagimos esferas de poliestireno amina com diâmetros de 8,6 μm, 10,6 μm e 20 μm com TCPP e EDC em água em pH 6. Estudos anteriores indicaram que o TCPP permanece solúvel nesse pH, e esse pH também é compatível com EDC33. As esferas marcadas de 8,6 μm resultaram em uma MFI muito baixa para o nosso ensaio. As esferas de 20 μm tinham uma MFI suficientemente alta, mas eram propensas a se estabelecer fora da suspensão e entupir o citômetro de fluxo (não mostrado). As esferas de 10,6 μm apresentaram IFM adequada, permaneceram em suspensão por tempo suficiente para análise por citometria de fluxo e, portanto, foram otimizadas como padrões de compensação. Notavelmente, as contas não rotuladas equivalentes tinham baixa fluorescência de fundo e podiam ser usadas como contas de controle negativo para compensação.

O aumento da razão de reagentes volumétricos de EDC para TCPP, mantendo a quantidade de contas constante, aumentou a MFI do cordão até atingir um platô na proporção de cerca de 2. Um platô de MFI também foi observado quando a razão TCPP para contas foi aumentada mantendo a razão EDC para TCPP constante. Uma vez que o TCPP marcou as esferas na ausência de EDC, o platô de MFI pode ser resultado de sítios de ligação covalentes e não covalentes estarem saturados na superfície do talão. Um subproduto particulado relacionado ao TCPP foi observado quando EDC e TCPP foram combinados em pH 6. Este particulado tinha um espectro de fluorescência semelhante ao TCPP, mas não se formou na ausência de EDC, sugerindo que é um subproduto insolúvel da reação do EDC com o TCPP. As partículas tinham forma irregular e, embora geralmente menores que 5 μm, podiam formar agregados maiores e também podiam aderir à superfície das contas. Particulados relacionados a TCPP também foram observados quando esferas de poliestireno de amina foram reagidas com TCPP e EDC. A quantidade de partículas aumentou com uma maior relação EDC/TCPP e uma maior relação TCPP/grânulos. As proporções de reagentes selecionadas no protocolo final são fundamentais para o sucesso do procedimento de marcação de cordões, pois garantem que a suspensão resultante do cordão tenha uma alta IFM, enquanto o nível de partículas permanece aceitável. O nível de partículas produzido nesse protocolo não impede o uso de esferas de TCPP para compensação, mas níveis mais elevados de particulados podem dificultar a acurácia dos ajustes de compensação35. Também desenvolvemos um procedimento de filtração que pode reduzir significativamente o nível de partículas, caso estas estejam presentes em um nível elevado.

Realizamos nossa reação usando um agitador rotativo. Não agitar a reação resulta em coloração mais lenta (dados não mostrados). Recomenda-se um tempo de reação de 16 horas. Tempos de reação mais longos (>24 h) resultam em níveis mais altos de partículas de TCPP, enquanto tempos de reação mais curtos (<8 h) resultam em menor MFI do talão. Para o controle de contas não marcadas, não usamos contas funcionalizadas com amina que não foram marcadas com TCPP porque a autofluorescência das contas não marcadas estava interferindo no cálculo correto das matrizes de compensação. Em vez disso, usamos esferas de poliestireno não funcionalizadas semelhantes em marca e tamanho. Além disso, mantivemos as esferas não rotuladas e marcadas com TCPP em tubos separados. Com ambos os conjuntos de contas no mesmo tubo, observamos alguma transferência de TCPP para as contas não rotuladas (dados não mostrados), o que causou um desvio à direita na IFM que proibiu o cálculo correto da matriz de compensação.

Em resumo, os pontos críticos para alcançar uma alta MFI das esferas marcadas com TCPP são as razões de reagentes usadas durante a reação de coloração, o tempo da reação de coloração e o diâmetro das esferas não marcadas. Neste trabalho, o protocolo descrito acima forneceu esferas coradas com TCPP que foram dimensionadas adequadamente para uso em citômetro de fluxo e fluorescentes suficientes para compensação. As esferas coradas com TCPP não perderam MFI significativa a 4 °C por 300 dias. O espectro de fluorescência das esferas de TCPP foi comparável ao de TCPP em solução. Além disso, as matrizes de compensação calculadas com esferas marcadas com TCPP e células A549 coradas geraram perfis de escarro virtualmente idênticos em nosso ensaio, demonstrando a utilidade dessas contas.

Este protocolo descreve a preparação de esferas de compensação TCPP que foram úteis no instrumento Navios EX, mas essas mesmas esferas podem não funcionar em um instrumento diferente, com sensibilidade diferente36 e uma configuração de detector diferente20. No entanto, este trabalho sugere formas de modular a fluorescência através do tamanho do cordão e da razão reagente. O TCPP é apenas uma das várias porfirinas fluorescentes que têm demonstrado seletividade de células cancerígenas in vitro e invivo2,37,38,39. Nem todas as porfirinas fluorescentes podem se ligar às esferas de poliestireno funcionalizadas com amina usadas neste protocolo. Na verdade, o uso dessas contas é limitado a porfirinas que contêm um ácido carboxílico. A coloração diferencial de diversas populações celulares em amostras de tecido humano com porfirinas, medida por citometria de fluxo, pode fornecer informações sobre o desenvolvimento inicial do câncer, sua progressão e seu prognóstico. O uso de outras porfirinas para corar amostras de tecido humano e sua análise por citometria de fluxo, usando esferas de controle apropriadas como padrões de compensação, é uma direção atraente para futuras pesquisas.

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Disclosures

Todos os autores são funcionários da bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a David Rodriguez pela assistência com a preparação da figura e Serviços de Patologia de Precisão (San Antonio, TX) pelo uso de seu citômetro de fluxo Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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References

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Pérolas Modificadas com Porfirina para Uso como Controle de Compensação em Citometria de Fluxo
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Bauta, W., Grayson, M., Titone, R., Rebeles, J., Rebel, V. I. Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (193), e65294, doi:10.3791/65294 (2023).

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