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Chemistry

Perlas modificadas con porfirina para uso como controles de compensación en citometría de flujo

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65294
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1bioAffinity Technologies

Summary

El protocolo describe cómo se preparan las perlas de compensación basadas en porfirina para la citometría de flujo mediante la reacción de perlas de poliestireno funcionalizadas con amina con la porfirina TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC. Se utiliza un procedimiento de filtración para reducir los subproductos de partículas.

Abstract

La citometría de flujo puede caracterizar y cuantificar rápidamente diversas poblaciones celulares basadas en mediciones de fluorescencia. Las células se tiñen primero con uno o más reactivos fluorescentes, cada uno funcionalizado con una molécula fluorescente diferente (fluoróforo) que se une a las células selectivamente en función de sus características fenotípicas, como la expresión de antígenos de superficie celular. La intensidad de la fluorescencia de cada reactivo unido a las células se puede medir en el citómetro de flujo utilizando canales que detectan un rango específico de longitudes de onda. Cuando se utilizan múltiples fluoróforos, la luz de fluoróforos individuales a menudo se derrama en canales de detección no deseados, lo que requiere una corrección de los datos de intensidad de fluorescencia en un proceso llamado compensación.

Las partículas de control de compensación, típicamente perlas de polímero unidas a un solo fluoróforo, son necesarias para cada fluoróforo utilizado en un experimento de etiquetado celular. Los datos de las partículas de compensación del citómetro de flujo se utilizan para aplicar una corrección a las mediciones de intensidad de fluorescencia. Este protocolo describe la preparación y purificación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas covalentemente con el reactivo fluorescente meso-tetra(4-carboxifenil) porfina (TCPP) y su aplicación en compensación por citometría de flujo. En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP y el reactivo de acoplamiento de amida EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) a pH 6 y a temperatura ambiente durante 16 h con agitación. Las perlas TCPP se aislaron por centrifugación y se resuspendieron en un tampón de pH 7 para su almacenamiento. Las partículas relacionadas con TCPP se observaron como un subproducto. El número de estas partículas podría reducirse utilizando un protocolo de filtración opcional. Las perlas TCPP resultantes se utilizaron con éxito en un citómetro de flujo para la compensación en experimentos con células de esputo humano marcadas con múltiples fluoróforos. Las perlas TCPP demostraron ser estables después del almacenamiento en un refrigerador durante 300 días.

Introduction

Las porfirinas han sido de interés durante muchos años en el campo biomédico debido a sus propiedades fluorescentes y dirigidas a tumores 1,2,3. Las aplicaciones terapéuticas como la terapia fotodinámica (TFD) y la terapia sonodinámica (SDT) implican la administración sistémica de una porfirina a un paciente con cáncer, la acumulación del fármaco en el tumor y la exposición localizada del tumor a una luz láser de una longitud de onda específica o ultrasonido. La exposición a la luz láser o ultrasonido conduce a la generación de especies reactivas de oxígeno por la porfirina y la posterior muerte celular 4,5. En el diagnóstico fotodinámico (PDD), la fluorescencia de porfirina se utiliza para distinguir las células cancerosas de las células normales6. En este contexto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente natural que se acumula en los tumores tras la inyección sistémica o local de su precursor, el ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), se utiliza para identificar tumores del estroma gastrointestinal, cáncer de vejiga y cáncer cerebral 7,8. Más recientemente, se exploró el tratamiento con 5-ALA como un enfoque para detectar la enfermedad residual mínima en el mieloma múltiple9. Nuestro laboratorio ha estado utilizando la tetraarilo porfirina TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxifenil)-21,23H-porfina) por su capacidad para teñir selectivamente células de cáncer de pulmón y células asociadas al cáncer en muestras de esputo humano, que es una propiedad que ha sido explotada en ensayos diagnósticos basados en portaobjetos y citométricos de flujo10.

Algunas porfirinas son bifuncionales en el sentido de que pueden ser utilizadas como agentes terapéuticos y diagnósticos 2,11. En la investigación biomédica, tales porfirinas bifuncionales se utilizan para evaluar cómo su capacidad para atacar selectivamente y matar las células cancerosas es una función de su estructura, así como la forma en que se ve afectada por la presencia de otros compuestos 12,13,14,15,16. Tanto la absorción celular de porfirinas como su citotoxicidad se pueden medir en una plataforma citométrica de flujo de una manera de alto rendimiento. Los espectros de absorción y emisión de las porfirinas fluorescentes son complejos, pero la mayoría de las plataformas citométricas de flujo están equipadas para identificarlas correctamente. El espectro de absorción de las porfirinas fluorescentes se caracteriza por una fuerte banda de absorción en el rango de 380-500 nm, conocida como la banda de Soret. De dos a cuatro bandas de absorción más débiles se observan generalmente en el rango de 500-750 nm (bandas Q)17. Un láser azul de 488 nm, presente en la mayoría de los citómetros de flujo, o un láser violeta (405 nm) pueden generar luz de la longitud de onda apropiada para excitar las porfirinas. Los espectros de emisión de las porfirinas suelen mostrar picos en el rango de 600-800 nm18, lo que resulta en muy poca superposición espectral con fluoróforos de isotiocianato de fluoresceína o ficoeritrina (PE), pero una superposición considerable con otros fluoróforos de uso frecuente, como la aloficocianina (APC), así como fluoróforos en tándem, como PE-Cy5 y otros. Por lo tanto, cuando se usan porfirinas en ensayos de citometría de flujo multicolor, los controles de fluoróforo único son esenciales para corregir adecuadamente el derrame de fluorescencia en canales distintos del designado para medir la fluorescencia de la porfirina.

Idealmente, los controles de fluoróforo único utilizados para calcular la matriz de derrame para un panel de fluoróforos (también llamados "controles de compensación") deberían consistir en el mismo tipo de célula que la muestra. Sin embargo, el uso de la muestra para este propósito no es óptimo si hay muy poca muestra para empezar o si la población objetivo dentro de la muestra es muy pequeña (por ejemplo, si se quiere observar la enfermedad residual mínima o las células cancerosas en las primeras etapas de la enfermedad). Una alternativa útil a las células son las perlas acopladas con el mismo fluoróforo que se utiliza para analizar la muestra. Muchas de estas cuentas están disponibles comercialmente; Estas perlas están premarcadas con el fluoróforo deseado (perlas específicas de fluoróforos preetiquetadas)19,20, o se les puede unir un anticuerpo marcado con fluorescencia (perlas de captura de anticuerpos)20,21. Si bien las perlas de compensación comerciales están disponibles para muchos fluoróforos, tales perlas no están disponibles para las porfirinas, a pesar de su creciente uso en la investigación básica y clínica.

Además de la preservación de la muestra y las poblaciones positivas versus negativas de tamaño adecuado, las otras ventajas de usar perlas como controles de compensación son la facilidad de preparación, la baja fluorescencia de fondo y la excelente estabilidad en el tiempo22. La desventaja potencial de usar perlas como control de compensación es que el espectro de emisión del anticuerpo fluorescente capturado en las perlas puede diferir del del mismo anticuerpo utilizado para etiquetar las células. Esto puede ser de importancia específica cuando se utiliza un citómetro de flujo espectral20. Por lo tanto, el desarrollo de perlas como control de compensación debe realizarse en el citómetro de flujo que se utilizará para el ensayo para el que se desarrollan las perlas. Además, el desarrollo de las perlas debe incluir una comparación con las células marcadas con el mismo reactivo de tinción fluorescente.

Aquí, describimos la preparación de perlas de compensación de poliestireno funcionalizadas con amina TCPP, cuya intensidad de fluorescencia mediana en el canal de detección fue comparable a la de las células marcadas con TCPP en esputo, y su uso como controles de compensación para la citometría de flujo. La autofluorescencia de perlas equivalentes no funcionalizadas fue lo suficientemente baja para su uso como controles de compensación de fluorescencia negativa. Además, estas perlas demostraron estabilidad en el almacenamiento durante casi 1 año.

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Protocol

Todos los procedimientos deben realizarse utilizando el equipo de protección personal adecuado.

1. Preparación de la solución madre TCPP, 1,0 mg/ml

NOTA: Esto se puede preparar mensualmente.

  1. Usando una balanza analítica, espátula y papel de pesaje, pesa 49.0-50.9 mg de TCPP. Redondee el peso a 1/10 de miligramo. Establezca la cantidad medida de TCPP protegida de la luz.
    NOTA: Use una pistola estática si la lectura de peso es inestable.
  2. Determine las cantidades requeridas de agua purificada e isopropanol (IPA) de la Tabla 1 en función de la cantidad de TCPP pesada en el paso 1.1 . Agregue el agua purificada y el isopropanol a un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml y cubra con parafilm para protegerlo de la evaporación.
  3. Determine la cantidad requerida de bicarbonato de sodio de la Tabla 1 en función de la cantidad de TCPP pesada en el paso 1.1 .
  4. Con la balanza analítica, la espátula y el papel de pesaje, pesar la cantidad necesaria de bicarbonato de sodio determinada en el paso 1.3. Redondee el peso a 1/10 de miligramo.
    NOTA: Use una pistola estática si la lectura de peso es inestable.
  5. Agregue el bicarbonato de sodio al vaso de precipitados de 100 ml que contiene agua purificada e isopropanol. Cubra la solución con parafilm para protegerla de la evaporación.
  6. Coloque la solución del paso 1.5 en una placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva (aprox. 10 min)
  7. Mida el pH para asegurarse de que la solución que contiene bicarbonato de sodio del paso 1.6 tiene un pH entre 9 y 10.
  8. Agregue lentamente el TCPP pesado en el paso 1.1 a la solución del paso 1.7, y continúe agitando hasta que se disuelva (~ 30 min). Protéjase de la luz durante este paso.
  9. Almacenar en un recipiente de vidrio o polipropileno a temperatura ambiente y protegido de la luz.

2. Preparación de ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES) y solución tampón de sal hemisódica, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampón MES")

NOTA: Debe prepararse el día de su uso y mantenerse a temperatura ambiente.

  1. Pesar 2,50 g de sal hemisódica MES y añadirla a una botella de plástico de 150 ml.
  2. Agregue 121 ml de agua purificada y disuelva agitando manualmente hasta que no se vea ningún sólido.
  3. Mida el pH del tampón MES para asegurarse de que esté entre 6 y 6.2.
  4. Mantener a temperatura ambiente para su uso el mismo día.

3. N-(3-dimetlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) polvo

  1. Saque el polvo EDC del congelador y déjelo reposar a temperatura ambiente hasta que lo use en el paso 5.

4. Combinación de perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas con solución TCPP

  1. Añadir 4,3 ml de la solución tampón MES 0,1 M preparada en la etapa 2 a un tubo de polipropileno de 15 ml.
  2. Vortex la suspensión de perlas de poliestireno funcionalizado con aminas (10 μm, 2,5% p/v) durante 60 s a velocidad máxima.
  3. Añadir 288 μL de esta suspensión de perlas recién vortexed al tampón MES del paso 4.1.
  4. Vortex la solución MES/bead durante 15 s a velocidad máxima.
  5. Vortex la solución TCPP de 1 mg/ml preparada en el paso 1 durante 60 s a velocidad máxima.
  6. Agregue 1,20 ml de esta solución madre TCPP recién vorteada a la suspensión MES/talón del paso 4.4.
  7. Vortex la suspensión MES/bead/TCPP durante 15 s a velocidad máxima.
  8. Cubra el tubo con papel de aluminio mientras se prepara la solución EDC.

5. Preparación de la solución madre de hidrocloruro (HCl) de N-(3-dimetlyaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC)

NOTA: La solución EDC es perecedera y debe usarse inmediatamente después de la preparación.

  1. Agregue 20.0 ml de agua purificada a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  2. Pesar 200 mg de EDC HCl del paso 3 y añadirlo al agua (paso 5.1).
  3. Vórtice el EDC HCL durante 15 s a velocidad máxima para generar una solución clara.

6. Preparación de la solución de trabajo EDC HCl/MES

NOTA: La solución EDC HCl/MES es perecedera y debe usarse inmediatamente después de la preparación.

  1. Agregue 54.0 ml de solución tampón MES (preparada en el paso 2) a una botella de plástico de 150 ml.
  2. Añadir 6,0 ml de la solución madre de EDC HCl (preparada en el paso 5) a la solución tampón MES y mezclar agitando durante 10 s.

7. Etiquetado de las perlas con TCPP

  1. Añadir 4,5 ml de solución de trabajo EDC (a partir del paso 6) al tubo de polipropileno de 15 ml que contiene las perlas y el TCPP en el tampón MES (paso 4.7).
  2. Coloque el tubo en un rotador inversor a 35 rpm durante 16 h a temperatura ambiente y protegido de la luz.
  3. Centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 10 min a 1.000 × g.
  4. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 0,8 ml de solución salina balanceada (HBSS) de Hanks.
  5. Transfiera la solución de perlas a un vial de polipropileno ámbar con una pipeta de 1 ml y guárdela a 4 °C hasta que vuelva a usarla.
    NOTA: Las perlas son estables durante al menos 3 meses en este punto.

8. Control de calidad (QC) de las perlas TCPP por citometría de flujo

NOTA: El control de calidad debe centrarse en si la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las perlas TCPP es lo suficientemente brillante para su uso previsto y la cantidad de partículas generadas por el procedimiento. Consulte la sección de resultados representativos para obtener más detalles.

  1. Etiquete un tubo de poliestireno de 5 ml como "perlas TCPP negativas".
    NOTA: Las perlas negativas son diferentes de las perlas funcionalizadas con amina utilizadas para el etiquetado. Vea la tabla de materiales.
  2. Etiquete otro tubo como "perlas positivas TCPP".
  3. Etiquete otro tubo como "cuentas de arco iris".
  4. Alícuota 300 μL de HBSS helado en los tubos etiquetados con "perlas TCPP negativas" y "perlas TCPP positivas".
  5. Agregue 500 μL de HBSS helado en el tubo etiquetado como "Cuentas de arco iris".
  6. Vortex la suspensión de perlas de poliestireno no funcionalizado (sin etiquetar) brevemente a velocidad máxima (2-3 s) y agregue 10 μL de ella al tubo etiquetado como "perlas negativas TCPP".
  7. Vortex la suspensión de perlas etiquetadas con TCPP (finalizada en el paso 7.5) brevemente a velocidad máxima, y agregue 3 μL de ella al tubo de "perlas positivas TCPP".
  8. Vortex la suspensión de cuentas Rainbow brevemente a velocidad máxima y agregue dos gotas de ella en el tubo "Rainbow beads".
  9. Mantenga todos los tubos sobre hielo, cubiertos y protegidos de la luz.
  10. Inicie los procedimientos de inicio diarios apropiados del citómetro de flujo y realice un control de calidad para verificar los fluidos óptimos y la alineación del láser.
    NOTA: Para esta parte del protocolo, se supone que el operador está capacitado en el uso del citómetro de flujo disponible, incluidos los procedimientos de estandarización de la dispersión de luz y la intensidad de fluorescencia, así como los principios básicos para calcular la matriz de compensación correcta.
  11. Ejecute las cuentas Rainbow y las cuentas TCPP sin cambiar la configuración de voltaje entre las diferentes ejecuciones.
    1. Corre y recoge 10.000 eventos de las cuentas del arco iris.
    2. Realice un enjuague con agua y recopile 10,000 eventos de las perlas negativas de TCPP.
    3. Realice un enjuague con agua y recoja 10,000 eventos de las perlas positivas para TCPP.
    4. Realice un enjuague con agua de 1 minuto.
      NOTA: Es importante realizar un enjuague con agua después de ejecutar las perlas TCPP. Si el TCPP no se enjuaga de las líneas en el citómetro, existe la posibilidad de que el TCPP residual pueda marcar las células en el siguiente tubo a adquirir.
    5. Realice los protocolos de limpieza y apagado apropiados específicos según las instrucciones del fabricante para el citómetro.
      NOTA: Para obtener resultados representativos, consulte la figura 1.

9. Filtración de cuentas

NOTA: Si el control de calidad de las perlas por citometría de flujo (paso 8) muestra una alta proporción de partículas (70% o más), considere filtrar la suspensión del cordón utilizando el protocolo a continuación (Figura 2).

  1. Agregue 3.20 ml de HBSS helado a 0.8 ml de la suspensión de perlas TCPP finalizada en el paso 7.5 (creando una dilución quíntuple).
  2. Vortex la suspensión de talón diluido a velocidad máxima durante 15 s.
  3. Retire el émbolo de una jeringa desechable de 5 ml.
  4. Ajuste la jeringa con un filtro de punta de fibra de vidrio (5 μm, 13 mm de diámetro).
  5. Agregue 4 ml de HBSS a la jeringa.
  6. Añadir 0,5 ml de la suspensión de perlas diluidas de vórtice (paso 9.2).
  7. Utilice el émbolo para filtrar la suspensión a través de la configuración de la jeringa/filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  8. Lave las perlas extrayendo 5 ml de HBSS fresco en la jeringa a través del filtro a aproximadamente 2 gotas/s.
  9. Empuje el HBSS de nuevo en el contenedor de residuos a aproximadamente 2 gotas/s.
  10. Para retirar las perlas del filtro, extraiga otros 5 ml de HBSS fresco en la jeringa a través del filtro.
  11. Retire con cuidado el filtro de la jeringa.
  12. Expulse la suspensión del talón de la jeringa en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
  13. Vuelva a colocar el filtro en la jeringa y repita los pasos 9.10-9.12 cuatro veces más. Luego deseche el filtro y la jeringa.
  14. Repita los pasos 9.2-9.13 hasta que se hayan filtrado todas las cuentas del paso 9.1. Use una jeringa nueva y filtre cada vez.
  15. Centrifugar las suspensiones de perlas filtradas durante 10 min a 1.000 × g a temperatura ambiente.
  16. Aspirar el sobrenadante de cada tubo de 50 ml y resuspender suavemente las perlas, combinándolas en 0,5 ml de HBSS fresco.
  17. Transfiera las perlas con una micropipeta de p1.000 a un vial nuevo de ámbar, vidrio o polipropileno y guárdelas a 4 °C.
  18. Repita el paso 8 para determinar si la proporción de partículas relacionadas con TCPP en la suspensión de perlas filtradas ha disminuido. Para obtener resultados representativos, consulte la figura 3.

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Representative Results

Este protocolo para el etiquetado TCPP de perlas es relativamente rápido y eficiente. La Figura 1 muestra un resultado representativo del proceso de etiquetado de perlas TCPP determinado por citometría de flujo. La Figura 1A muestra el perfil estandarizado de las cuentas Rainbow, tal como se detecta en el canal apropiado para detectar TCPP. Estas perlas sirven como un control de calidad para la estandarización de los voltajes láser para la detección de TCPP por el citómetro de flujo. La Figura 1B muestra el perfil de dispersión de luz de perlas de poliestireno funcionalizado con aminas, marcadas con TCPP. La Figura 1C muestra el perfil de dispersión de luz de perlas no funcionalizadas (perlas no etiquetadas); Los usamos como un control de cuentas negativas para calcular la matriz de compensación. La población indicada por el rectángulo rojo, que está ausente en la suspensión de perlas no etiquetada, representa las partículas relacionadas con TCPP formadas cuando TCPP se expone al reactivo de acoplamiento EDC. Dichos agregados deben excluirse cuando se determine la intensidad de fluorescencia (FI) de las perlas. La Figura 1D muestra el FI de las perlas etiquetadas, seleccionado por la puerta negra en la Figura 1B, que es claramente varios logaritmos más alto que el FI de las perlas (sin etiquetar) sin etiquetar (comparando la Figura 1D con la Figura 1E).

La proporción de partículas (es decir, los eventos indicados por la puerta roja en la Figura 1B) puede variar según el lote de etiquetado. Para la mayoría de las aplicaciones de citometría de flujo estándar, una suspensión de perlas con 50% de partículas o menos permite configurar correctamente la compensación en un experimento de citometría de flujo multicolor utilizando TCPP. Sin embargo, hay aplicaciones, por ejemplo, donde se utiliza el análisis automatizado de datos, para las cuales un contenido de partículas mucho más alto puede interferir con la configuración de compensación adecuada. En tales casos, se recomienda la filtración (paso de protocolo 9 y Figura 2). La Figura 3 muestra el efecto de la filtración en la suspensión de perlas que comprendía ~65% de partículas (paneles izquierdos de la Figura 3A, B). Después de la filtración, el contenido de partículas disminuyó a ~ 12%. Los efectos adversos de la filtración son cierta pérdida de perlas (no mostradas) y una ligera pérdida de FI (Figura 3C). Estos efectos deben tenerse en cuenta cuando se considera la filtración de la suspensión de perlas. Una alternativa a la filtración de perlas para reducir el contenido de partículas es alterar la relación entre las perlas, el TCPP y el reactivo de acoplamiento EDC. Sin embargo, las alteraciones en estas proporciones también afectan el FI de las perlas.

La relación entre la formación de partículas, MFI y la relación perla/TCPP/EDC se ilustra en la Figura 4 y la Figura 5. La Figura 4A y la Figura 5A muestran la MFI de las perlas etiquetadas en función de la relación EDC/TCPP y la relación TCPP/perla, respectivamente. Con ratios crecientes, la IMF aumenta hasta que se estabiliza. Los ejemplos representativos de la Figura 4B y la Figura 5B muestran que el contenido de partículas aumenta con la proporción creciente respectiva. Este protocolo de etiquetado TCPP se optimizó para una IMF máxima mientras se mantiene el contenido de partículas lo más bajo posible (flechas en la Figura 4A y la Figura 5A). Las partículas solo aparecen cuando EDC se utiliza como reactivo de acoplamiento durante el procedimiento de etiquetado. Usando solo perlas y TCPP, las partículas no se forman (no se muestran), pero el etiquetado de las perlas da como resultado cuentas con una FI mucho menor (comparando la Figura 6A con la Figura 6B). Intentamos reemplazar este método de acoplamiento basado en EDC con un método basado en un éster activado de NHS (N-hidroxisuccinimida) de TCPP23. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la FI con este método de acoplamiento alternativo en comparación con el uso de perlas y TCPP juntos, lo que sugiere que hay una unión covalente insignificante de TCPP a las perlas con este método (comparando la Figura 6B con la Figura 6C).

Los datos presentados en todas las figuras hasta el momento se recopilaron utilizando perlas de 10,6 μm de diámetro. Planteamos la hipótesis de que las perlas más grandes pueden tener más sitios de unión de TCPP debido al aumento del área de superficie y, por lo tanto, podrían mostrar una mayor FI. Por el contrario, planteamos la hipótesis de que las perlas más pequeñas con áreas de superficie más pequeñas y menos sitios de unión TCPP deberían mostrar una FI más baja. Utilizando el mismo protocolo de etiquetado que se describe aquí, pero con cuentas de 8,6 μm o perlas de 20 μm (en lugar de cuentas de 10,6 μm), encontramos la reducción prevista en FI en las perlas de 8,6 μm en comparación con las perlas de 10,6 μm (comparando la Figura 6D con la Figura 6A). Las perlas de 20 μm mostraron un FI fuera de la escala para el citómetro de flujo que utilizamos (datos no mostrados), pero estas perlas más grandes se asentaron rápidamente en solución y no se siguieron más.

Este protocolo para etiquetar perlas con TCPP fue desarrollado con el propósito de tener una herramienta de compensación confiable en experimentos de citometría de flujo donde TCPP se usa para etiquetar células. En el pasado, utilizamos células A549 para este propósito24, pero el procedimiento de etiquetado no siempre resultó en una alta FI. Además, las células, incluso después de la fijación, no podían usarse durante más de 1 mes. El protocolo para etiquetar perlas (10.6 μm) con TCPP descrito en este documento resultó consistentemente en perlas teñidas brillantemente, como se muestra en la Figura 1. Además, cuando las mismas perlas marcadas con TCPP se probaron mediante citometría de flujo después de 300 días, no observamos un cambio significativo en el MFI ni en el contenido de partículas (Figura 7). El acoplamiento de TCPP a las perlas tuvo poco efecto en su espectro de emisión de fluorescencia (Figura 8A; comparando la línea negra discontinua con la línea negra continua, que representa el espectro de emisión de fluorescencia de TCPP en solución). El espectro de emisión de fluorescencia de las perlas marcadas con TCPP difería más del espectro de TCPP medido dentro de las células de cáncer de pulmón A549, especialmente alrededor de las longitudes de onda de 700-725 nm (Figura 8A; línea negra discontinua en comparación con la línea naranja, respectivamente). Sin embargo, con la capacidad de compensar la señal TCPP de las otras señales en una muestra de esputo marcada con múltiples fluoróforos, las perlas marcadas con TCPP funcionaron igual de bien que las células A549 teñidas con TCPP (comparando la Figura 8B con la Figura 8C, respectivamente).

El. Los archivos LMD se pueden encontrar en FlowRepository (https://flowrepository.org), bajo los ID FR-FCM-Z6ZP (Figura 1); FR-FCM-Z5UJ (Figura 3B,C); FR-FCM-Z6ZR (Figura 4B); FR-FCM-Z6ZS (Figura 5B); FR-FCM-Z6ZB (Figura 6); FR-FCM-Z6Y5 (Figura 8B); y FR-FCM-Z6ZT (Figura 8C).

Figure 1
Figura 1: Control de calidad de las perlas etiquetadas con TCPP. (A) Cuentas arco iris. Se presenta el histograma de las cuentas Rainbow detectadas en el canal específico para el fluoróforo APC. Este canal también se puede utilizar para detectar la fluorescencia TCPP. Las cuentas Rainbow sirven como control de calidad para el láser APC; Los picos primero y cuarto deben caer en la región indicada por los corchetes respectivos. (B,D) Perlas etiquetadas con TCPP. (C,E) Cuentas sin etiquetar. Esta muestra particular de solución de perlas etiquetadas con TCPP incluía perlas al 51,9% (puerta rectangular negra en B). Los eventos en el rectángulo rojo representan las partículas que se formaron durante el etiquetado TCPP. Tales partículas estaban ausentes en la solución de perlas no etiquetada (comparando los rectángulos rojos en B y C). Las intensidades de fluorescencia de las perlas marcadas y no etiquetadas con TCPP se presentan en D y E, respectivamente. Abreviaturas: SSC = dispersión lateral; FSC = dispersión hacia adelante; APC = aloficocianina; TCPP = meso-tetra(4-carboxifenil) porfina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática del método de filtrado de cuentas utilizado en los pasos de protocolo 9.3-9.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efectos de la filtración sobre las partículas y la intensidad de la fluorescencia. (A) Imágenes microscópicas de perlas de 10 μm etiquetadas con TCPP antes (imagen izquierda) y después de la filtración (imagen derecha). Las imágenes fueron tomadas con una amplificación de 20x. Barra de escala = 20 μm. (B) La suspensión de talón TCPP antes de la filtración (perfil izquierdo) incluyó 25,6% de perlas (rectángulo negro) y 65,7% de residuos o partículas (rectángulo rojo). La proporción de perlas en la suspensión aumentó a 74.7% después de la filtración (perfil derecho; rectángulo negro), y los desechos disminuyeron a 11.9%. (C) Histogramas del TCPP FI de las perlas identificadas en B. El histograma de la izquierda representa las perlas etiquetadas con TCPP antes de la filtración, con un FI ligeramente más alto que el de las perlas después de la filtración (histograma a la derecha). Las líneas rojas, colocadas en un FI de 1 × 103 en ambas figuras, son para facilitar la comparación de ambos histogramas. Abreviaturas: SSC = dispersión lateral; FSC = dispersión hacia adelante; APC = aloficocianina; TCPP = meso-tetra(4-carboxifenil) porfina; FI = intensidad de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Relación entre la relación EDC/TCPP, la intensidad media de fluorescencia (MFI) y la formación de partículas. (A) Se presenta la relación entre la relación EDC/TCPP utilizada en el protocolo de etiquetado de perlas y la IMF de las perlas etiquetadas con TCPP subsiguientes. La curva muestra la IMF promedio de tres experimentos independientes ± desviación estándar (DE). La flecha roja (3,75) indica la relación volumétrica de las soluciones EDC y TCPP utilizadas en este protocolo. (B) Perfiles representativos de dispersión de luz de las suspensiones de perlas preparadas con las relaciones EDC/TCPP indicadas arriba de cada perfil. Todos los perfiles se derivan del mismo experimento. Las cuentas están indicadas por el rectángulo negro. La formación de partículas, indicada por los rectángulos rojos, aumenta con el aumento de las relaciones EDC / TCPP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Relación entre la relación TCPP/perlas, MFI y formación de partículas. (A) Se presenta la relación entre la relación volumétrica TCPP/perlas utilizada en el protocolo de etiquetado de perlas y la IMF de las perlas etiquetadas con TCPP subsiguientes. La IMF aumenta rápidamente, alcanzando una fase de meseta después de una relación TCPP/perlas de 2. La curva muestra la IMF promedio de tres experimentos independientes ± desviación estándar (DE). La flecha roja (4.17) indica la relación utilizada en este protocolo. (B) Perfiles representativos de dispersión de luz de las suspensiones de perlas preparadas con las relaciones TCCP/perlas indicadas arriba de cada perfil. Todos los perfiles se derivan del mismo experimento. Las cuentas están indicadas por los rectángulos negros. La formación de partículas, indicada por los rectángulos rojos, aumenta con el aumento de las relaciones TCPP/perla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Una comparación de los métodos de acoplamiento y los tamaños de cuentas utilizados. Se muestran histogramas de la intensidad de fluorescencia de las perlas etiquetadas con TCPP. (A) Las perlas de 10,6 μm se etiquetaron de acuerdo con el protocolo proporcionado, incluido el uso del reactivo de acoplamiento EDC. (B) Lo mismo que (A), pero EDC se omitió durante el protocolo de etiquetado. (C) Las perlas de 10,6 μm fueron etiquetadas utilizando el éster NHS, según el método descrito por Kabe et al.23. (D) Igual que (A), pero en lugar de cuentas de 10,6 μm, se utilizaron cuentas de 8,6 μm. Las líneas rojas verticales en cada perfil se establecen arbitrariamente en 1 × 103 para facilitar las comparaciones entre los histogramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Estabilidad de las perlas TCPP a lo largo del tiempo. Las perlas etiquetadas con TCPP (10 μm) se etiquetaron de acuerdo con el protocolo, se almacenaron en el refrigerador a 4 ° C y se mantuvieron en la oscuridad. El día 0 es el día del etiquetado. En varios puntos de tiempo a partir de entonces, las alícuotas de las perlas almacenadas se volvieron a analizar mediante citometría de flujo. Se presentan mediciones de las partículas porcentuales (A) MFI y (B) en relación con el valor del día 0, que se estableció arbitrariamente en 100%. Las líneas naranjas horizontales representan los valores 10% por encima y 10% por debajo de los del día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Perlas TCPP comparadas con células teñidas con TCPP como herramientas de compensación. (A) Los espectros de emisión de fluorescencia de TCCP en solución, TCPP acoplado a perlas y TCPP después de la tinción de células de cáncer de pulmón A549 se midieron en un lector de microplacas. Los espectros de emisión de TCPP soluble y unido a cuentas son muy similares. Ambos difieren de los de las células A549 marcadas alrededor de la longitud de onda de 700 nm. (B,C). Una muestra de esputo se procesó en células individuales y se marcó con múltiples fluoróforos: AF488 (FL1), BV510 (FL10), PE (FL2), PE-CF594 (FL3) y TCPP (FL6). Para cada fluoróforo, preparamos tubos de control de un solo color que contenían perlas acopladas con el fluoróforo correspondiente. Para TCPP, se instalaron dos tubos de control: uno con perlas etiquetadas con TCPP y otro con celdas A549 fijas etiquetadas con TCPP. Esto nos permitió crear dos matrices de compensación: (B) una en la que se utilizaron las perlas etiquetadas con TCPP como control de compensación para TCPP (FL-6) y (C) otra en la que se utilizaron celdas A549 etiquetadas con TCPP. Estas dos matrices de compensación son muy similares, con la mayor diferencia en la compensación relacionada con TCPP entre TCPP (FL6) y FL-3. Los diagramas de puntos adjuntos que muestran estos parámetros particulares muestran perfiles casi idénticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Reactivos necesarios para la solución madre de TCPP. Las cantidades de NaHCO3, agua purificada e isopropanol (IPA) se basan en la cantidad de TCPP pesada en el paso 1.1 (entre 49,0 mg y 50,9 mg). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

A pesar de las muchas aplicaciones de las porfirinas en el diagnóstico y la terapéutica del cáncer2, existe una literatura limitada sobre su uso potencial como reactivo citométrico de flujo para la identificación de poblaciones celulares cancerosas versus no cancerosas en tejidos humanos primarios24,25,26. Nuestra investigación sobre el análisis citométrico de flujo del esputo humano24,27 requiere la tinción de células de esputo disociadas con TCPP y varios otros fluoróforos. Sin embargo, el derrame de fluorescencia de TCPP en los canales de detección designados para otros fluoróforos significaba que se necesitaba un cordón marcado con TCPP como control de compensación. Sin embargo, no había tal cuenta disponible comercialmente y tuvo que ser desarrollada. Se ha descrito la unión de porfirinas tetraarilo a tamices moleculares basados en dióxido de silicio28,29. Sin embargo, las partículas a base de dióxido de silicio demostraron ser inadecuadas para preparar patrones de citometría de flujo (datos no mostrados). Por lo tanto, nuestros estudios se centraron en las perlas de poliestireno.

Una solución de TCPP en isopropanol-agua (1:1 v/v)30 marcó las perlas de poliestireno a pH 6, pero la MFI fue demasiado baja en relación con las células teñidas en nuestro ensayo. Exploramos la modificación del cordón covalente como una forma de aumentar la IMF. La modificación covalente de las perlas de látex funcionalizadas con amina con el éster NHS de TCPP a través de amidación fue descrita previamente por Kabe et al.23 utilizando perlas no comerciales de 2 μm de diámetro31. En el estudio de Kabe et al.23, TCPP fue incubado en DMF con N-hidroxisuccinimida (NHS)32 durante 5 h para preparar un monoéster NHS activado de TCPP. Esta solución de éster activado se hizo reaccionar con perlas que contenían un enlazador terminal de aminas. Sin embargo, cuando aplicamos este protocolo a perlas comerciales de poliestireno funcionalizado con aminas, el etiquetado dio como resultado perlas con una IMF insuficientemente brillantes para la compensación. Por lo tanto, exploramos la amidación directa de las perlas de poliestireno amina sin usar un intermediario éster NHS.

En este trabajo, las perlas de poliestireno funcionalizadas con aminas se trataron con TCPP en presencia del reactivo de acoplamiento de amida EDC para generar enlaces amida entre los grupos amino en las perlas y los grupos carboxi en el TCPP. El EDC fue seleccionado por su solubilidad acuosa, utilidad comprobada en reacciones acuosas de amidación en un amplio rango de pH, bajo costo y subproductos solubles en agua33,34. Reaccionamos perlas de poliestireno amina con diámetros de 8,6 μm, 10,6 μm y 20 μm con TCPP y EDC en agua a pH 6. Estudios anteriores han indicado que TCPP permanece soluble a este pH, y este pH también es compatible con EDC33. Las perlas etiquetadas de 8,6 μm dieron como resultado una IMF que era demasiado baja para nuestro ensayo. Las perlas de 20 μm tenían una MFI suficientemente alta, pero eran propensas a asentarse fuera de la suspensión y obstruir el citómetro de flujo (no se muestra). Las perlas de 10,6 μm tenían una IMF adecuada, permanecieron en suspensión el tiempo suficiente para el análisis de citometría de flujo y, por lo tanto, se optimizaron como estándares de compensación. En particular, las perlas equivalentes no etiquetadas tenían baja fluorescencia de fondo y podían usarse como perlas de control negativo para compensación.

El aumento de la relación de reactivos volumétricos de EDC a TCPP mientras se mantiene constante la cantidad de perlas aumentó la MFI de la cuenta hasta que se alcanzó una meseta en una proporción de aproximadamente 2. También se observó una meseta de MFI a medida que la proporción de TCPP a perlas se incrementó mientras se mantenía constante la relación EDC a TCPP. Dado que el TCPP etiquetó las perlas en ausencia de EDC, la meseta de MFI puede ser el resultado de sitios de unión covalentes y no covalentes que se saturan en la superficie de la perla. Se observó un subproducto de partículas relacionado con TCPP cuando EDC y TCPP se combinaron a pH 6. Esta partícula tenía un espectro de fluorescencia similar al TCPP, pero no se formó en ausencia de EDC, lo que sugiere que es un subproducto insoluble de la reacción de EDC con TCPP. Las partículas tenían una forma irregular y, aunque generalmente eran más pequeñas que 5 μm, podían formar agregados más grandes y también podían adherirse a la superficie de las perlas. También se observaron partículas relacionadas con TCPP cuando las perlas de poliestireno amina reaccionaron con TCPP y EDC. La cantidad de partículas aumentó con una mayor proporción de EDC a TCPP y una mayor proporción de TCPP a perlas. Las proporciones de reactivos seleccionadas en el protocolo final son clave para el éxito del procedimiento de etiquetado de talones porque aseguran que la suspensión de talón resultante tenga una IMF alta mientras que el nivel de partículas sigue siendo aceptable. El nivel de partículas producidas en este protocolo no excluye el uso de perlas TCPP para compensación, pero niveles más altos de partículas pueden obstaculizar la precisión de los ajustes de compensación35. También desarrollamos un procedimiento de filtración que puede reducir significativamente el nivel de partículas si estas están presentes a un nivel alto.

Llevamos a cabo nuestra reacción utilizando un agitador giratorio. No agitar la reacción da como resultado una tinción más lenta (datos no mostrados). Se recomienda un tiempo de reacción de 16 h. Los tiempos de reacción más largos (>24 h) dan como resultado niveles más altos de partículas TCPP, mientras que los tiempos de reacción más cortos (<8 h) dan como resultado una MFI de perlas más baja. Para el control de perlas no etiquetadas, no utilizamos perlas funcionalizadas con aminas que no estaban etiquetadas con TCPP porque la autofluorescencia de las perlas no etiquetadas estaba interfiriendo con el cálculo correcto de las matrices de compensación. En su lugar, utilizamos perlas de poliestireno no funcionalizadas similares en marca y tamaño. Además, mantuvimos las perlas sin etiqueta y etiquetadas con TCPP en tubos separados. Con ambos conjuntos de perlas en el mismo tubo, observamos cierta transferencia de TCPP a las perlas no etiquetadas (datos no mostrados), lo que provocó un desplazamiento a la derecha en la IMF que prohibió el cálculo correcto de la matriz de compensación.

En resumen, los puntos críticos para lograr una IMF alta de las perlas marcadas con TCPP son las proporciones de reactivos utilizadas durante la reacción de tinción, el tiempo de la reacción de tinción y el diámetro de las perlas no etiquetadas. En este trabajo, el protocolo descrito anteriormente proporcionó perlas teñidas con TCPP que tenían el tamaño apropiado para su uso en un citómetro de flujo y eran lo suficientemente fluorescentes para la compensación. Las perlas teñidas con TCPP no perdieron MFI significativas a 4 °C durante 300 días. El espectro de fluorescencia de las perlas TCPP fue comparable al de TCPP en solución. Además, las matrices de compensación calculadas con perlas marcadas con TCPP y células A549 teñidas generaron perfiles de esputo prácticamente idénticos en nuestro ensayo, lo que demuestra la utilidad de estas perlas.

Este protocolo describe la preparación de perlas de compensación TCPP que fueron útiles en el instrumento Navios EX, pero estas mismas perlas pueden no funcionar en un instrumento diferente con diferente sensibilidad36 y una configuración de detector diferente20. Sin embargo, este trabajo sugiere formas de modular la fluorescencia a través del tamaño de la cuenta y la relación del reactivo. TCPP es sólo una de varias porfirinas fluorescentes que han demostrado selectividad de células cancerosas in vitro e in vivo2,37,38,39. No todas las porfirinas fluorescentes pueden unirse a las perlas de poliestireno funcionalizadas con amina utilizadas en este protocolo. De hecho, el uso de estas perlas se limita a las porfirinas que contienen un ácido carboxílico. La tinción diferencial de diversas poblaciones celulares en muestras de tejido humano con porfirinas, medida por citometría de flujo, podría proporcionar información sobre el desarrollo temprano del cáncer, su progresión y su pronóstico. El uso de otras porfirinas para teñir muestras de tejido humano y su análisis por citometría de flujo, utilizando perlas de control apropiadas como estándares de compensación, es una dirección atractiva para futuras investigaciones.

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Disclosures

Todos los autores son empleados de bioAffinity Technologies.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a David Rodríguez por su ayuda con la preparación de figuras y Precision Pathology Services (San Antonio, TX) por el uso de su citómetro de flujo Navios EX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene Research Products International   ZC1028-500
Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead Spherotech APX-100-10 Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead
Conical tubes, 50 mL, Falcon Fisher Scientific 14-432-22
Centrifuge with appropriate rotor
Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL Fisher Scientific 09-761-140
EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% Sigma 03450-1G CAS No:  25952-53-8
FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) BD
Glass coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-540-BP
Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) Thomas Scientific 1190M60
Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm Fisher Scientific 12-550-143
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific 14-175-095
Isopropanol, ACS grade Fisher Scientific AC423830010
Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips Eppendorf 3123000918
MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt Sigma M0164 CAS No:  117961-21-4
Navios EX flow cytometer Beckman Coulter
Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software Olympus or similar
Pasteur pipettes, glass, 5.75" Fisher Scientific 13-678-6B
pH meter (UB 10 Ultra Basic) Denver Instruments
Pipette controller (Drummond) Pipete.com DP101
Plastic Syringe, 5 mL Fisher Scientific 14955452
Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,  2.5% w/v, 8.0-12.9 µm Spherotech PP-100-10 
Polypropylene tubes, 15mL, conical Fisher Scientific 14-959-53A
Polystyrene tubes, round bottom  Fisher Scientific 14-959-2A
Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) Fisher Scientific NC9207381
Serological pipettes, disposable - 10 mL Fisher Scientific 07-200-574
Serological pipettes, disposable - 25 mL Fisher Scientific 07-200-576
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S6014 CAS No:  144-55-8
TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)  Frontier Scientific  Fisher Scientific 50-393-68 CAS No:  14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (or similar) Tecan Life Sciences
Tube revolver/rotator Thermo Fisher 88881001
Vortex mixer Fisher Scientific 2215365

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References

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Este mes en JoVE Número 193 Citometría de flujo control de compensación fluoróforo etiquetado perlas funcionalizadas con aminas amidación porfirina
Perlas modificadas con porfirina para uso como controles de compensación en citometría de flujo
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