Summary
이 프로토콜은 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 포르피린 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC의 반응에 의해 유세포 분석을 위한 포르피린 기반 보상 비드를 준비하는 방법을 설명합니다. 미립자 부산물을 줄이기 위해 여과 절차가 사용됩니다.
Abstract
유세포 분석은 형광 측정을 기반으로 다양한 세포 집단을 신속하게 특성화하고 정량화할 수 있습니다. 세포는 먼저 하나 이상의 형광 시약으로 염색되며, 각각은 세포 표면 항원 발현과 같은 표현형 특성에 따라 세포에 선택적으로 결합하는 상이한 형광 분자(형광단)로 기능화됩니다. 세포에 결합된 각 시약의 형광 강도는 지정된 파장 범위를 감지하는 채널을 사용하여 유세포 분석기에서 측정할 수 있습니다. 여러 형광단을 사용하는 경우 개별 형광단의 빛이 원치 않는 검출 채널로 흘러 들어가는 경우가 많으며, 이는 보상이라는 프로세스에서 형광 강도 데이터를 수정해야 합니다.
보상 제어 입자, 일반적으로 단일 형광단에 결합된 폴리머 비드는 세포 표지 실험에 사용되는 각 형광단에 필요합니다. 유세포 분석기의 보상 입자 데이터는 형광 강도 측정에 보정을 적용하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 형광 시약인 메조테트라(4-카르복시페닐) 포르핀(TCPP)과 공유 작용화된 폴리스티렌 보상 비드의 준비 및 정제와 유세포 분석 보상에서의 적용에 대해 설명합니다. 이 작업에서, 아민 작용화 폴리스티렌 비드를 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염)로 pH 6 및 실온에서 16시간 동안 교반하면서 처리했습니다. TCPP 비드를 원심분리에 의해 단리하고, 보관을 위해 pH 7 완충액에 재현탁시켰다. TCPP 관련 미립자는 부산물로 관찰되었습니다. 이러한 미립자의 수는 선택적 여과 프로토콜을 사용하여 줄일 수 있습니다. 생성된 TCPP 비드는 다중 형광단으로 표지된 인간 객담 세포를 사용한 실험에서 보상을 위해 유세포 분석기에서 성공적으로 사용되었습니다. TCPP 비드는 냉장고에 300일 동안 보관한 후 안정적인 것으로 입증되었습니다.
Introduction
포르피린은 형광 및 종양 표적화 특성으로 인해 생물 의학 분야에서 수년 동안 관심의 대상이었습니다 1,2,3. 광역학 요법(PDT) 및 초음파 요법(SDT)과 같은 치료 적용은 암 환자에게 포르피린의 전신 투여, 종양에 약물 축적, 특정 파장 또는 초음파의 레이저 광에 대한 종양의 국소 노출을 수반합니다. 레이저 광선 또는 초음파에 노출되면 포르피린에 의한 활성 산소 종의 생성과 그에 따른 세포 사멸이 일어난다 4,5. 광역학 진단(photodynamical, PDD)에서 포르피린 형광은 암세포와 정상세포를 구별하는 데 사용된다6. 이러한 맥락에서, 전구체 인 5- 아미노 레불린 산 (5-ALA)의 전신 또는 국소 주사시 종양에 축적되는 천연 형광 포르피린 인 protoporphyrin IX는 위장관 간질 종양, 방광암 및 뇌암을 확인하는 데 사용됩니다 7,8. 최근에는 다발성 골수종에서 최소 잔류 질환을 검출하기 위한 접근법으로 5-ALA 치료법이 연구되었다9. 우리 연구실은 인간 객담 샘플에서 폐암 세포와 암 관련 세포를 선택적으로 염색하는 능력을 위해 테트라아릴 포르피린 TCPP(5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphine)를 사용해 왔으며, 이는 슬라이드 기반 및 유세포 분석 분석 분석에서 활용된 특성이다10.
일부 포르피린은 치료 및 진단제로 사용될 수 있다는 점에서 이중 기능성이다 2,11. 생물 의학 연구에서, 이러한 이중 기능성 포르피린은 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 다른 화합물 12,13,14,15,16의 존재에 의해 어떻게 영향을 받는지뿐만 아니라 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 어떻게 작용하는지 평가하는 데 사용됩니다. 포르피린의 세포 흡수와 세포 독성은 모두 고처리량 방식으로 유세포 분석 플랫폼에서 측정할 수 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 및 방출 스펙트럼은 복잡하지만 대부분의 유세포 분석 플랫폼은 이를 정확하게 식별할 수 있는 장비를 갖추고 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 스펙트럼은 Soret 밴드로 알려진 380-500 nm 범위의 강한 흡수 밴드를 특징으로합니다. 2-4 개의 약한 흡수 밴드는 일반적으로 500-750 nm 범위 (Q 밴드)에서 관찰됩니다 17. 대부분의 유세포 분석기에 존재하는 청색 488nm 레이저 또는 보라색 레이저(405nm)는 포르피린을 여기시키기 위해 적절한 파장의 빛을 생성할 수 있습니다. 포르피린의 방출 스펙트럼은 전형적으로 600-800 nm 범위(18)에서 피크를 나타내는데, 이는 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코에리트린(PE) 형광단과는 스펙트럼 중첩이 거의 없지만, 알로피코시아닌(APC)과 같이 자주 사용되는 다른 형광단뿐만 아니라 PE-Cy5 등과 같은 탠덤 형광단과는 상당히 겹친다. 따라서 다색 유세포 분석에서 포르피린을 사용할 때 포르피린의 형광을 측정하도록 지정된 채널이 아닌 다른 채널에서 형광의 유출을 적절하게 보정하기 위해 단일 형광단 제어가 필수적입니다.
이상적으로, 형광단 패널에 대한 스필오버 매트릭스를 계산하는 데 사용되는 단일 형광단 대조군("보상 대조군"이라고도 함)은 샘플과 동일한 세포 유형으로 구성되어야 합니다. 그러나 시작할 샘플이 거의 없거나 샘플 내의 대상 모집단이 매우 작은 경우(예: 질병의 초기 단계에서 최소 잔류 질병 또는 암세포를 확인하려는 경우) 이러한 목적으로 샘플을 사용하는 것은 최적이 아닙니다. 세포에 대한 유용한 대안은 샘플을 분석하는 데 사용되는 동일한 형광단과 결합된 비드입니다. 많은 이러한 비드가 시판되고 있으며; 이러한 비드는 원하는 형광단(prelabeled fluorophore-specific beads)19,20으로 사전 표지되거나 형광 표지된 항체가 부착될 수 있습니다(항체 캡처 비드)20,21. 상업적인 보상 구슬은 많은 형광단에 사용할 수 있지만 이러한 구슬은 기초 및 임상 연구에서 사용이 증가하고 있음에도 불구하고 포르피린에 사용할 수 없습니다.
시료 보존 및 적절한 크기의 양성 대 음성 모집단 외에도, 비드를 보상 대조군으로 사용하는 것의 다른 이점은 준비의 용이성, 낮은 배경 형광 및 시간 경과에 따른 우수한 안정성입니다22. 비드를 보상 대조군으로 사용할 때의 잠재적인 단점은 비드에 포획된 형광 항체의 방출 스펙트럼이 세포를 표지하는 데 사용된 동일한 항체의 방출 스펙트럼과 다를 수 있다는 것입니다. 이것은 스펙트럼 유세포 분석기(20)를 사용할 때 특히 중요할 수 있다. 따라서 보상 제어로서의 비드의 개발은 비드가 개발되는 분석에 사용될 유세포 분석기에서 수행되어야 합니다. 또한, 비드의 개발에는 동일한 형광 염색 시약으로 표지된 세포와의 비교가 포함되어야 합니다.
여기에서는 검출 채널의 중간 형광 강도가 객담의 TCPP 표지 세포의 형광 강도와 비슷한 TCPP 아민 기능화 폴리스티렌 보상 비드의 제조와 유세포 분석을 위한 보상 대조군으로 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 동등하고 기능화되지 않은 비드의 자가형광은 음성 형광 보상 대조군으로 사용하기에 충분히 낮았습니다. 또한, 이들 비드는 거의 1년 동안 보관시 안정성을 입증하였다.
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Protocol
모든 절차는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.
1. TCPP 원액의 제조, 1.0 mg/mL
참고: 매월 준비할 수 있습니다.
- 분석 저울, 주걱 및 계량 용지를 사용하여 49.0-50.9mg의 TCPP를 계량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다. 측정된 TCPP 양을 빛으로부터 보호해 두십시오.
알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오. - 1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 정제수 및 이소프로판올(IPA)의 필요한 양을 결정합니다. 정제수와 이소프로판올을 100mL 유리 비커에 넣고 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 덮습니다.
- 1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 필요한 중탄산나트륨의 양을 결정합니다.
- 분석 저울, 주걱 및 칭량지를 사용하여 1.3단계에서 결정된 필요한 양의 중탄산나트륨을 칭량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다.
알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오. - 정제수와 이소프로판올이 들어있는 100 mL 비이커에 중탄산나트륨을 넣는다. 증발로부터 보호하기 위해 파라 필름으로 용액을 덮으십시오.
- 1.5단계의 용액을 교반 플레이트에 놓고 용해될 때까지 저어줍니다(약 10분)
- pH를 측정하여 단계 1.6의 중탄산나트륨 함유 용액의 pH가 9에서 10 사이인지 확인합니다.
- 단계 1.1에서 칭량한 TCPP를 단계 1.7의 용액에 천천히 첨가하고 용해될 때까지 계속 교반합니다(~30분). 이 단계에서 빛으로부터 보호하십시오.
- 유리 또는 폴리프로필렌 용기에 담아 실온에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.
2. 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) 및 hemisodium salt buffer solution, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("MES buffer")의 제조
알림: 사용 당일에 준비하여 실온에 보관해야 합니다.
- MES 헤미소듐염 2.50g의 무게를 측정하여 150mL 플라스틱 병에 넣습니다.
- 정제수 121mL를 넣고 고체가 보이지 않을 때까지 수동으로 흔들어 녹입니다.
- MES 버퍼의 pH를 측정하여 6에서 6.2 사이인지 확인합니다.
- 당일 사용할 수 있도록 실온에서 보관하십시오.
3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) 분말
- 냉동실에서 EDC 분말을 꺼내 5단계에서 사용할 때까지 실온에 둡니다.
4. 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 TCPP 용액의 결합
- 상기 단계 2에서 제조된 0.1 M MES 완충용액 4.3 mL를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣는다.
- 아민 작용화 폴리스티렌 비드 현탁액(10μm, 2.5% w/v)을 최대 속도로 60초 동안 소용돌이칩니다.
- 이 갓 와류된 비드 현탁액 288μL를 4.1단계의 MES 버퍼에 추가합니다.
- MES/비드 용액을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.
- 1단계에서 준비한 1mg/mL TCPP 용액을 최대 속도로 60초 동안 소용돌이칩니다.
- 1.20 mL의 갓 소용돌이 된 TCPP 원액을 4.4단계의 MES/비드 현탁액에 추가합니다.
- MES/비드/TCPP 서스펜션을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.
- EDC 용액이 준비되는 동안 튜브를 호일로 덮으십시오.
5. N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl) 원액의 제조
알림: EDC 용액은 부패하기 쉬우므로 준비 직후에 사용해야 합니다.
- 정제수 20.0mL를 새 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
- 3단계에서 EDC HCl 200mg의 무게를 측정하고 물에 첨가합니다(5.1단계).
- EDC HCL을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이치면 투명한 용액이 생성됩니다.
6. EDC HCl/MES 작업 용액 준비
알림: EDC HCl/MES 용액은 부패하기 쉬우므로 준비 직후에 사용해야 합니다.
- 54.0mL의 MES 완충 용액(2단계에서 준비)을 150mL 플라스틱 병에 추가합니다.
- 6.0mL의 EDC HCl 원액(단계 5에서 제조)을 MES 완충액에 넣고 10초 동안 진탕하여 혼합합니다.
7. TCPP로 비드 라벨링
- 4.5mL의 EDC 작업 용액(6단계에서)을 MES 버퍼에 비드와 TCPP가 들어 있는 15mL 폴리프로필렌 튜브에 추가합니다(4.7단계).
- 튜브를 실온에서 35시간 동안 16rpm으로 반전 회전자에 넣고 빛으로부터 보호합니다.
- 튜브를 실온에서 1,000×g으로 10분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 0.8mL에 비드를 재현탁합니다.
- 비드 용액을 1 mL 피펫이 있는 호박색 폴리프로필렌 바이알에 옮기고, 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 보관한다.
알림: 이 시점에서 비드는 최소 3개월 동안 안정적입니다.
8. 유세포 분석에 의한 TCPP 비드의 품질 검사(QC)
알림: QC는 TCPP 비드의 중간 형광 강도(MFI)가 의도한 용도에 충분히 밝은지 여부와 절차에서 생성되는 미립자의 양에 중점을 두어야 합니다. 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하세요.
- 5mL 폴리스티렌 튜브 1개를 "TCPP 음성 비드"로 표시합니다.
알림: 네거티브 비드는 라벨링에 사용되는 아민 기능화 비드와 다릅니다. 재료 표를 참조하십시오. - 다른 튜브에 "TCPP 양성 비드"라는 레이블을 붙입니다.
- 다른 튜브를 "무지개 구슬"로 표시하십시오.
- 얼음처럼 차가운 HBSS 300μL를 "TCPP 음성 비드" 및 "TCPP 양성 비드"로 표시된 튜브에 분취합니다.
- 얼음처럼 차가운 HBSS 500μL를 "레인보우 비드"라고 표시된 튜브에 넣습니다.
- 기능화되지 않은 폴리스티렌(표지되지 않은) 비드 현탁액을 최대 속도(2-3초)로 잠깐 소용돌이치고 10μL를 "TCPP 음성 비드"라고 표시된 튜브에 추가합니다.
- TCPP 표지 비드 현탁액(7.5단계에서 마무리됨)을 최대 속도로 잠깐 소용돌이치고 3μL를 "TCPP 양성 비드" 튜브에 추가합니다.
- 레인보우 비드 서스펜션을 최대 속도로 잠깐 소용돌이 치고 "레인보우 비즈" 튜브에 두 방울을 떨어뜨립니다.
- 모든 튜브를 얼음 위에 놓고 덮고 빛으로부터 보호하십시오.
- 유세포 분석기의 적절한 일일 시동 절차를 시작하고 QC를 수행하여 최적의 유체 및 레이저 정렬을 확인합니다.
참고: 프로토콜의 이 부분에서는 작업자가 광 산란 및 형광 강도를 표준화하는 절차와 올바른 보상 매트릭스를 계산하는 기본 원칙을 포함하여 사용 가능한 유세포 분석기 사용에 대해 교육을 받았다고 가정합니다. - 레인보우 비드와 TCPP 비드를 서로 다른 실행 사이에 전압 설정을 변경하지 않고 실행합니다.
- 레인보우 구슬 이벤트 10,000개를 실행하고 수집하세요.
- 물로 헹구고 TCPP 음성 비드의 10,000개 이벤트를 수집합니다.
- 물로 헹구고 TCPP 양성 비드의 10,000개 이벤트를 수집합니다.
- 1분 동안 물로 헹굽니다.
알림: TCPP 비드를 실행한 후 물로 헹구는 것이 중요합니다. TCPP가 세포분석기의 라인에서 헹구어지지 않으면 잔류 TCPP가 획득할 다음 튜브의 세포에 라벨을 붙일 수 있습니다. - 세포분석기에 대한 제조업체의 지침에 따라 적절한 세척 및 종료 프로토콜을 수행합니다.
참고: 대표적인 결과는 그림 1을 참조하십시오.
9. 비드 여과
참고: 유세포 분석(8단계)에 의한 비드의 QC가 높은 비율의 미립자(70% 이상)를 나타내는 경우 아래 프로토콜을 사용하여 비드 현탁액을 필터링하는 것이 좋습니다(그림 2).
- 7.5단계에서 완성된 TCPP 비드 현탁액 0.8mL에 얼음처럼 차가운 HBSS 3.20mL를 추가합니다(5배 희석 생성).
- 희석된 비드 현탁액을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.
- 일회용 5mL 주사기에서 플런저를 제거합니다.
- 유리 섬유 팁 필터(5μm, 직경 13mm)로 주사기를 맞춥니다.
- 주사기에 HBSS 4mL를 추가합니다.
- 0.5 mL의 와동된 희석된 비드 현탁액을 첨가한다(단계 9.2).
- 플런저를 사용하여 주사기/필터 설정을 통해 약 2방울/초의 속도로 현탁액을 여과합니다.
- 약 5방울/s의 속도로 필터를 통해 신선한 HBSS 2mL를 주사기에 끌어당겨 비드를 세척합니다.
- HBSS를 약 2방울/초의 속도로 폐기물 용기에 다시 밀어 넣습니다.
- 필터에서 비드를 제거하려면 필터를 통해 주사기에 신선한 HBSS 5mL를 더 넣습니다.
- 주사기에서 필터를 조심스럽게 제거합니다.
- 주사기에서 비드 현탁액을 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브로 꺼냅니다.
- 필터를 주사기에 다시 놓고 9.10-9.12단계를 네 번 더 반복합니다. 그런 다음 필터와 주사기를 버리십시오.
- 9.1단계의 모든 비드가 필터링될 때까지 9.2-9.13단계를 반복합니다. 매번 새 주사기와 필터를 사용하십시오.
- 여과된 비드 현탁액을 실온에서 1,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.
- 각 50mL 튜브의 상층액을 흡인하고 비드를 부드럽게 재현탁하여 0.5mL의 신선한 HBSS에 결합합니다.
- p1,000 마이크로피펫이 있는 비드를 새로운 호박색, 유리 또는 폴리프로필렌 바이알에 옮기고 4°C에서 보관합니다.
- 8단계를 반복하여 여과된 비드 현탁액에서 TCPP 관련 미립자의 비율이 감소했는지 확인합니다. 대표적인 결과는 그림 3을 참조하십시오.
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Representative Results
비드의 TCPP 라벨링을 위한 이 프로토콜은 비교적 빠르고 효율적입니다. 도 1은 유세포 분석에 의해 결정된 TCPP 비드 라벨링 공정의 대표적인 결과를 보여준다. 도 1A는 TCPP를 검출하기 위한 적절한 채널에서 검출된 레인보우 비드의 표준화된 프로파일을 보여준다. 이 비드는 유세포 분석기에 의한 TCPP 검출을 위한 레이저 전압의 표준화를 위한 QC 역할을 합니다. 그림 1B는 아민 작용화 폴리스티렌, TCPP 표지 비드의 광 산란 프로파일을 보여줍니다. 도 1C는 비-기능화 비드(non-labeled beads)의 광 산란 프로파일을 도시한다; 이를 네거티브 비드 컨트롤로 사용하여 보상 매트릭스를 계산합니다. 표지되지 않은 비드 현탁액에 없는 빨간색 직사각형으로 표시된 모집단은 TCPP가 커플링 시약 EDC에 노출될 때 형성되는 TCPP 관련 미립자를 나타냅니다. 이러한 응집체는 비드의 형광 강도(FI)가 결정될 때 제외되어야 합니다. 도 1D는 도 1B에서 블랙 게이트에 의해 선택된 표지된 비드의 FI를 보여주며, 이는 (unated) 비드의 FI보다 분명히 몇 로그 더 높다(도 1D와 도 1E 비교).
미립자의 비율(즉, 그림 1B에서 빨간색 게이트로 표시된 이벤트)은 라벨링 배치에 따라 다를 수 있습니다. 대부분의 표준 유세포 분석 응용 분야의 경우, 미립자가 50% 이하인 비드 현탁액을 사용하면 TCPP를 사용하는 다색 유세포 분석 실험에서 보상을 올바르게 설정할 수 있습니다. 예를 들어, 자동화된 데이터 분석이 사용되는 응용 분야에서는 훨씬 더 많은 미립자 함량이 적절한 보정 설정을 방해할 수 있습니다. 이러한 경우 여과를 사용하는 것이 좋습니다(프로토콜 단계 9 및 그림 2). 그림 3 은 ~65%의 미립자로 구성된 비드 현탁액에 대한 여과 효과를 보여줍니다( 그림 3A, B의 왼쪽 패널). 여과 후 미립자 함량은 ~ 12 %로 감소했습니다. 여과의 부작용은 비드의 일부 손실(표시되지 않음)과 약간의 FI 손실입니다(그림 3C). 이러한 효과는 비드 현탁액의 여과가 고려될 때 고려되어야 한다. 미립자 함량을 낮추기 위한 비드 여과의 대안은 비드, TCPP 및 커플링 시약 EDC 간의 비율을 변경하는 것입니다. 그러나 이러한 비율의 변경은 비드의 FI에도 영향을 미칩니다.
미립자 형성, MFI 및 비드/TCPP/EDC 비율 간의 관계는 그림 4 및 그림 5에 나와 있습니다. 그림 4A 및 그림 5A는 각각 EDC/TCPP 비율 및 TCPP/비드 비율의 함수로서 표지된 비드의 MFI를 보여줍니다. 비율이 증가함에 따라 MFI는 안정 될 때까지 증가합니다. 그림 4B 및 그림 5B의 대표적인 예는 각각 비율이 증가함에 따라 미립자 함량이 증가함을 보여줍니다. 이 TCPP 라벨링 프로토콜은 미립자 함량을 가능한 한 낮게 유지하면서 최대 MFI에 최적화되었습니다(그림 4A 및 그림 5A의 화살표). 미립자는 라벨링 절차 중에 EDC를 커플링 시약으로 사용할 때만 나타납니다. 비드와 TCPP만 사용하면 미립자가 형성되지 않지만(표시되지 않음) 비드의 라벨링으로 인해 FI가 훨씬 낮은 비드가 생성됩니다(그림 6A와 그림 6B 비교). 우리는 이 EDC 기반 커플링 방법을 TCPP23의 활성화된 NHS(N-하이드록시숙신이미드) 에스테르를 기반으로 하는 방법으로 대체하려고 했습니다. 그러나 비드와 TCPP를 함께 사용하는 것과 비교하여 이 대체 커플링 방법을 사용하는 FI에서 큰 차이가 없음을 발견했으며, 이는 이 방법을 사용하여 비드에 대한 TCPP의 공유 결합이 무시할 수 있음을 시사합니다(그림 6B와 그림 6C 비교).
지금까지 모든 도면에 제시된 데이터는 10.6 μm 직경의 비드를 사용하여 수집하였다. 우리는 더 큰 비드가 증가된 표면적으로 인해 더 많은 TCPP 결합 부위를 가질 수 있으므로 더 높은 FI를 표시할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 반대로, 우리는 더 작은 표면적과 더 적은 TCPP 결합 부위를 가진 더 작은 비드가 더 낮은 FI를 표시해야 한다는 가설을 세웠습니다. 여기에 설명된 것과 동일한 라벨링 프로토콜을 사용하지만 8.6μm 비드 또는 20μm 비드(10.6μm 비드 대신)를 사용합니다. 우리는 10.6μm 비드와 비교하여 8.6μm 비드에서 예측된 FI 감소를 발견했습니다(그림 6D와 그림 6A 비교). 20μm 비드는 우리가 사용한 유세포 분석기의 스케일에서 FI를 표시했지만(데이터는 표시되지 않음), 이러한 더 큰 비드는 그 후 빠르게 용액에서 침전되어 더 이상 추적되지 않았습니다.
TCPP로 비드를 라벨링하기 위한 이 프로토콜은 TCPP를 사용하여 세포를 라벨링하는 유세포 분석 실험에서 신뢰할 수 있는 보상 도구를 갖기 위해 개발되었습니다. 과거에는 이러한 목적으로 A549 셀을 사용했지만(24), 라벨링 절차가 항상 높은 FI를 초래하는 것은 아닙니다. 또한, 고정 후에도 세포를 1 개월 이상 사용할 수 없었습니다. 여기에 설명된 TCPP로 비드를 라벨링(10.6μm)하기 위한 프로토콜은 그림 1과 같이 일관되게 밝게 염색된 비드를 생성했습니다. 또한, 동일한 TCPP 표지 비드를 300일 후 유세포 분석으로 테스트했을 때 MFI나 미립자 함량에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 7). 비드에 대한 TCPP의 결합은 형광 방출 스펙트럼에 거의 영향을 미치지 않았습니다(그림 8A; 검은색 점선과 검은색 실선 비교, 이는 용액 내 TCPP의 형광 방출 스펙트럼을 나타냄). TCPP 표지 비드의 형광 방출 스펙트럼은 A549 폐암 세포 내부, 특히 700-725nm 파장 부근에서 측정된 TCPP 스펙트럼과 더 달랐습니다(그림 8A, 각각 주황색 선과 비교하여 검은색 점선). 그러나 다중 형광단 표지 객담 샘플에서 다른 신호의 TCPP 신호를 보상할 수 있는 능력으로 TCPP 표지된 비드는 TCPP 염색 A549 세포와 동일하게 잘 작동했습니다(각각 그림 8B와 그림 8C 비교).
이 . LMD 파일은 FlowRepository(https://flowrepository.org)의 ID FR-FCM-Z6ZP에서 찾을 수 있습니다(그림 1). FR-FCM-Z5UJ (그림 3B, C); FR-FCM-Z6ZR(그림 4B); FR-FCM-Z6ZS(그림 5B); FR-FCM-Z6ZB(그림 6); FR-FCM-Z6Y5 (그림 8B); 및 FR-FCM-Z6ZT(그림 8C).
그림 1: TCPP로 라벨링된 비드의 품질 검사 . (A) 무지개 구슬. APC 형광단에 특이적인 채널에서 검출된 레인보우 비드의 히스토그램이 제시됩니다. 이 채널은 TCPP 형광을 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 레인보우 비드는 APC 레이저의 QC 역할을 합니다. 첫 번째 및 네 번째 피크는 각 브래킷으로 표시된 영역에 있어야 합니다. (비,디) TCPP 라벨이 붙은 비드. (씨, 이) 라벨이 붙지 않은 구슬. TCPP 표지된 비드 용액의 이 특정 샘플에는 51.9% 비드( B의 검은색 직사각형 게이트)가 포함되었습니다. 빨간색 사각형의 이벤트는 TCPP 레이블 지정 중에 형성된 미립자를 나타냅니다. 이러한 미립자는 표지되지 않은 비드 용액에 존재하지 않았다 ( B 와 C의 빨간색 직사각형 비교). TCPP 표지 및 비표지 비드의 형광 강도는 각각 D 와 E로 표시됩니다. 약어: SSC = 측면 산란; FSC = 순방향 산란; APC = 알로피코시아닌; TCPP = 메조-테트라(4-카르복시페닐) 포르핀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로토콜 단계 9.3-9.12에서 사용된 비드 필터링 방법의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미립자 및 형광 강도에 대한 여과의 영향. (A) 여과 전(왼쪽 사진)과 여과 후(오른쪽 이미지)에 TCPP로 표지된 10μm 비드의 현미경 이미지. 이미지는 20배 증폭으로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 여과 전의 TCPP-비드 현탁액(왼쪽 프로파일)에는 25.6%의 비드(검은색 직사각형)와 65.7%의 파편 또는 미립자(빨간색 직사각형)가 포함되었습니다. 현탁액의 비드 비율은 여과 후 74.7%로 증가했으며(오른쪽 프로파일, 검은색 직사각형), 파편은 11.9%로 감소했습니다. (C) B에서 확인된 비드의 TCPP FI의 히스토그램. 왼쪽의 히스토그램은 여과 전의 TCPP 표지 비드를 나타내며, FI는 여과 후의 비드보다 약간 높습니다(오른쪽의 히스토그램). 두 그림에서 1 × 103 의 FI에 배치된 빨간색 선은 두 히스토그램의 비교를 용이하게 하기 위한 것입니다. 약어: SSC = 측면 산란; FSC = 순방향 산란; APC = 알로피코시아닌; TCPP = 메조-테트라(4-카르복시페닐) 포르핀; FI = 형광 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EDC/TCPP 비율, 중간 형광 강도(MFI) 및 미립자 형성 간의 관계. (A) 비드 라벨링 프로토콜에 사용된 EDC/TCPP 비율과 후속 TCPP 라벨링 비드의 MFI 간의 관계가 제시됩니다. 이 곡선은 표준 편차(SD)에 ± 3개의 독립적인 실험의 평균 MFI를 보여줍니다. 빨간색 화살표(3.75)는 이 프로토콜에 사용된 EDC 및 TCPP 솔루션의 체적 비율을 나타냅니다. (B) 각 프로파일 위에 표시된 EDC/TCPP 비율로 제조된 비드 현탁액의 대표적인 광산란 프로파일. 모든 프로파일은 동일한 실험에서 파생됩니다. 구슬은 검은색 직사각형으로 표시됩니다. 빨간색 직사각형으로 표시된 미립자 형성은 EDC/TCPP 비율이 증가함에 따라 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. TCPP/비드 비율, MFI 및 미립자 형성 간의 관계. (A) 비드 라벨링 프로토콜에 사용된 TCPP/비드 부피 비율과 후속 TCPP 라벨링 비드의 MFI 간의 관계가 제시됩니다. MFI는 빠르게 증가하여 TCPP/비드 비율이 2가 된 후 고원 단계에 도달합니다. 이 곡선은 표준 편차(SD)에 ± 3개의 독립적인 실험의 평균 MFI를 보여줍니다. 빨간색 화살표(4.17)는 이 프로토콜에 사용된 비율을 나타냅니다. (B) 각 프로파일 위에 표시된 바와 같이 TCCP/비드 비율로 제조된 비드 현탁액의 대표적인 광산란 프로파일. 모든 프로파일은 동일한 실험에서 파생됩니다. 구슬은 검은색 직사각형으로 표시됩니다. 빨간색 직사각형으로 표시된 미립자 형성은 TCPP/비드 비율이 증가함에 따라 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 사용된 커플링 방법과 비드 크기 비교. TCPP로 표지된 비드의 형광 강도에 대한 히스토그램이 표시됩니다. (A) 10.6μm 비드는 커플링 시약 EDC의 사용을 포함하여 제공된 프로토콜에 따라 라벨링되었습니다. (B) (A)와 동일하지만 EDC는 라벨링 프로토콜 중에 생략되었습니다. (C) 10.6μm 비드를 Kabe et al.23에 의해 기술된 방법에 따라 NHS 에스테르를 사용하여 표지하였다. (D) (A)와 동일하지만, 10.6μm 비드 대신 8.6μm 비드를 사용하였다. 각 프로파일의 빨간색 수직선은 히스토그램 간의 비교를 용이하게 하기 위해 임의로 1 × 103 으로 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 시간 경과에 따른 TCPP 비드의 안정성. TCPP-표지된 비드(10 μm)를 프로토콜에 따라 표지하고, 4°C의 냉장고에 보관하고, 암실에 보관하였다. 0일은 라벨링의 날입니다. 그 후 다양한 시점에서, 저장된 비드의 분취량을 유세포 분석에 의해 재분석하였다. 제시된 것은 임의로 100%로 설정된 0일 값에 대한 (A) MFI 및 (B) 백분율 미립자의 측정값입니다. 주황색 수평선은 0일의 값을 10% 위, 10% 아래로 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 보상 도구로서 TCPP 염색 세포와 비교한 TCPP 비드. (A) A549 폐암 세포의 염색 후 용액 중의 TCCP, 비드에 결합된 TCPP 및 TCPP의 형광 방출 스펙트럼을 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하였다. 가용성 및 비드 결합 TCPP의 방출 스펙트럼은 매우 유사합니다. 둘 다 700nm 파장 주변의 표지된 A549 세포와 다릅니다. (B,C)입니다. 객담 샘플을 단일 세포로 처리하고 AF488(FL1), BV510(FL10), PE(FL2), PE-CF594(FL3) 및 TCPP(FL6)와 같은 다중 형광단으로 표지했습니다. 각 형광단에 대해 관련 형광단과 결합된 비드를 포함하는 단색 제어 튜브를 준비했습니다. TCPP의 경우 두 개의 제어 튜브가 설정되었는데, 하나는 TCPP 표지 비드가 있고 다른 하나는 TCPP로 표지된 고정 A549 셀이 있습니다. 이를 통해 (B) TCPP 표지 비드가 TCPP(FL-6)에 대한 보상 대조군으로 사용된 것과 (C) TCPP 표지된 A549 세포가 사용된 두 가지 보상 매트릭스를 만들 수 있었습니다. 이 두 보상 행렬은 매우 유사하며 TCPP(FL6)와 FL-3 간의 TCPP 관련 보상에서 가장 큰 차이가 있습니다. 이러한 특정 파라미터를 표시하는 첨부된 점도표는 거의 동일한 프로파일을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: TCPP 원액에 필요한 시약. NaHCO3, 정제수 및 이소프로판올(IPA)의 양은 1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양(49.0mg에서 50.9mg 사이)을 기준으로 합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
암 진단 및 치료학에 포르피린이 많이 적용되고 있음에도 불구하고2, 일차 인간 조직에서 암성 대 비암성 세포 집단을 식별하기 위한 유세포 분석 시약으로서의 포르피린의 잠재적 용도에 대한 문헌은 제한적이다24,25,26. 인간 객담24,27의 유세포 분석에 대한 우리의 연구는 TCPP 및 기타 여러 형광단으로 해리된 객담 세포의 염색을 필요로 합니다. 그러나 다른 형광단에 대해 지정된 검출 채널에서 TCPP의 형광 유출은 보상 대조군으로 TCPP 표지 비드가 필요하다는 것을 의미했습니다. 그러나 그러한 비드는 상업적으로 이용 가능하지 않았고 개발되어야했습니다. 이산화규소계 분자체에 테트라아릴 포르피린을 부착하는 것이 보고되었습니다28,29. 그러나, 이산화규소계 입자는 유세포 분석 표준물질을 제조하는 목적에 부적합한 것으로 판명되었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서 우리의 연구는 폴리스티렌 비드에 초점을 맞췄습니다.
이소프로판올-물(1:1 v/v)30의 TCPP 용액은 pH 6에서 폴리스티렌 비드를 표시했지만 MFI는 분석에서 염색된 세포에 비해 너무 낮았습니다. 우리는 MFI를 증가시키는 방법으로 공유 비드 변형을 탐구했습니다. 아미드화를 통한 아민 작용화 라텍스 비드와 TCPP의 NHS 에스테르의 공유 개질은 비상업적 2μm 직경 비드31을 사용하여 Kabe 등(23)에 의해 이전에 기술되었다. Kabe et al.23의 연구에서 TCPP는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)32와 함께 DMF에서 5시간 동안 배양하여 TCPP의 활성화된 NHS 모노에스테르를 제조했습니다. 이어서, 이 활성화된 에스테르 용액을 말단 아민 링커를 함유하는 비드와 반응시켰다. 그러나 이 프로토콜을 상업용 아민 기능화 폴리스티렌 비드에 적용했을 때 라벨링으로 인해 MFI가 충분히 밝지 않은 비드가 보상되었습니다. 따라서 우리는 NHS 에스테르 중간체에 사용하지 않고 아민 폴리스티렌 비드의 직접 아미드화를 탐구했습니다.
이 작업에서, 아민 작용화 폴리스티렌 비드를 아미드 커플링 시약 EDC의 존재 하에 TCPP로 처리하여 비드의 아미노기와 TCPP의 카르복시기 그룹 사이에 아미드 결합을 생성하였다. EDC는 수용성, 넓은 pH 범위에 걸친 수성 아미드화 반응에서 입증된 유용성, 저렴한 비용 및 수용성 부산물33,34 때문에 선택되었습니다. 직경 8.6μm, 10.6μm, 20μm의 아민 폴리스티렌 비드를 pH 6의 물에서 TCPP 및 EDC와 반응시켰습니다. 이전 연구에 따르면 TCPP는 이 pH에서 용해성을 유지하며 이 pH는 EDC33과도 호환됩니다. 표지 된 8.6 μm 비드는 우리의 분석에 너무 낮은 MFI를 초래했습니다. 20 μm 비드는 충분히 높은 MFI를 가졌지만, 현탁액으로부터 침전되어 유동 세포분석기를 막히는 경향이 있었다(도시되지 않음). 10.6μm 비드는 적절한 MFI를 가지며 유세포 분석을 위해 충분히 오랫동안 현탁액에 남아 있어 보상 표준으로 최적화되었습니다. 특히, 동등한 표지되지 않은 비드는 배경 형광이 낮았고 보상을 위한 음성 대조군 비드로 사용될 수 있었습니다.
비드의 양을 일정하게 유지하면서 EDC 대 TCPP의 부피 시약 비율을 증가시키면 약 2의 비율로 고원에 도달할 때까지 비드 MFI가 증가했습니다. EDC 대 TCPP 비율을 일정하게 유지하면서 비드에 대한 TCPP의 비율이 증가함에 따라 MFI 고원도 관찰되었습니다. TCPP가 EDC의 부재 하에서 비드를 표지하기 때문에, MFI 정체기는 비드의 표면에서 공유 결합 및 비공유 결합 부위가 포화된 결과일 수 있다. TCPP 관련 미립자 부산물은 EDC와 TCPP가 pH 6에서 결합되었을 때 관찰되었습니다. 이 미립자는 TCPP와 유사한 형광 스펙트럼을 가졌지만 EDC가 없을 때는 형성되지 않았으며, 이는 EDC와 TCPP의 반응으로 인한 불용성 부산물임을 시사합니다. 미립자는 불규칙한 모양을 가지며 일반적으로 5μm보다 작지만 더 큰 응집체를 형성 할 수 있으며 비드 표면에 부착 될 수도 있습니다. TCPP 관련 미립자는 아민 폴리스티렌 비드가 TCPP 및 EDC와 반응했을 때도 관찰되었습니다. 미립자의 양은 EDC 대 TCPP 비율이 높고 TCPP 대 비드 비율이 높을수록 증가했습니다. 최종 프로토콜에서 선택된 시약 비율은 미립자 수준이 허용 가능한 상태로 유지되는 동안 생성된 비드 현탁액의 MFI가 높기 때문에 비드 라벨링 절차의 성공에 핵심적인 역할을 합니다. 이 프로토콜에서 생성된 미립자의 수준은 보상을 위한 TCPP 비드의 사용을 배제하지 않지만, 더 높은 수준의 미립자는 보상 설정(35)의 정확성을 저해할 수 있다. 우리는 또한 미립자 수준이 높을 경우 미립자 수준을 크게 낮출 수 있는 여과 절차를 개발했습니다.
우리는 회전 교반기를 사용하여 반응을 수행했습니다. 반응을 교반하지 않으면 염색이 느려집니다(데이터는 나타내지 않음). 16시간의 반응 시간이 권장됩니다. 반응 시간(>24h)이 길수록 TCPP 미립자 수치가 높아지고, 반응 시간(<8h)이 짧을수록 비드 MFI가 낮아집니다. 표지되지 않은 비드 대조군의 경우, 표지되지 않은 비드의 자가형광이 보상 매트릭스를 올바르게 계산하는 데 방해가 되었기 때문에 TCPP로 표지되지 않은 아민 기능화 비드를 사용하지 않았습니다. 대신, 우리는 제조사와 크기가 비슷한 기능화되지 않은 폴리스티렌 비드를 사용했습니다. 또한, 표지되지 않은 비드와 TCPP 표지된 비드를 별도의 튜브에 보관했습니다. 동일한 튜브에 두 세트의 비드를 사용하여 표지되지 않은 비드(데이터는 표시되지 않음)로 TCPP가 일부 전달되는 것을 관찰했으며, 이로 인해 보상 매트릭스의 정확한 계산을 방해하는 MFI의 오른쪽 이동이 발생했습니다.
요약하면, TCPP 표지 비드의 높은 MFI를 달성하기 위한 중요한 점은 염색 반응 동안 사용된 시약 비율, 염색 반응 시간 및 표지되지 않은 비드의 직경입니다. 이 작업에서, 상술한 프로토콜은 유세포 분석기에서 사용하기에 적절한 크기이고 보상을 위해 충분히 형광을 띤 TCPP-염색된 비드를 제공하였다. TCPP-염색된 비드는 300일 동안 4°C에서 유의한 MFI를 잃지 않았다. TCPP 비드의 형광 스펙트럼은 용액 중 TCPP의 형광 스펙트럼과 비슷했습니다. 또한, TCPP 표지 비드와 염색된 A549 세포로 계산된 보상 매트릭스는 당사 분석에서 거의 동일한 객담 프로파일을 생성하여 이러한 비드의 유용성을 입증했습니다.
이 프로토콜은 Navios EX 장비에서 유용했던 TCPP 보상 비드의 제조를 설명하지만, 이러한 동일한 비드는 다른 감도(36) 및 다른 검출기 구성(20)을 갖는 다른 장비에서 작동하지 않을 수 있다. 그러나 이 연구는 비드 크기와 시약 비율을 통해 형광을 조절하는 방법을 제시합니다. TCPP는 시험관 내 및 생체 내에서 암세포 선택성을 입증한 여러 형광 포르피린 중 하나일 뿐입니다 2,37,38,39. 모든 형광 포르피린이 이 프로토콜에 사용되는 아민 작용화 폴리스티렌 비드에 결합할 수 있는 것은 아닙니다. 사실, 이러한 구슬의 사용은 카르복실산을 함유하는 포르피린으로 제한됩니다. 유세포 분석법으로 측정한 포르피린을 사용한 인간 조직 샘플의 다양한 세포 집단의 차등 염색은 암의 초기 발병, 진행 및 예후에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 적절한 대조 비드를 보상 표준으로 사용하여 인간 조직 샘플을 염색하고 유세포 분석에 의한 분석을 위해 다른 포르피린을 사용하는 것은 추가 연구를 위한 매력적인 방향입니다.
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Disclosures
모든 저자는 bioAffinity Technologies의 직원입니다.
Acknowledgments
Navios EX 유세포분석기를 사용하기 위해 수치 준비 및 정밀 병리학 서비스(텍사스주 샌안토니오)에 도움을 준 David Rodriguez에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable - 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable - 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
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