Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie
Summary
Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.
Abstract
Het zich ontwikkelende hart is een complexe structuur die verschillende voorlopercellen bevat die worden bestuurd door complexe regulerende mechanismen. Het onderzoek van de genexpressie en chromatinetoestand van individuele cellen maakt de identificatie van het celtype en de toestand mogelijk. Single-cell sequencing benaderingen hebben een aantal belangrijke kenmerken van cardiale voorlopercel heterogeniteit onthuld. Deze methoden zijn echter over het algemeen beperkt tot vers weefsel, wat studies met verschillende experimentele omstandigheden beperkt, omdat het verse weefsel in één keer in dezelfde run moet worden verwerkt om de technische variabiliteit te verminderen. Daarom zijn eenvoudige en flexibele procedures nodig om gegevens te produceren van methoden zoals single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (snATAC-seq) in dit gebied. Hier presenteren we een protocol om kernen snel te isoleren voor volgende single-nuclei dual-omics (gecombineerde snRNA-seq en snATAC-seq). Deze methode maakt de isolatie van kernen uit bevroren monsters van cardiale voorlopercellen mogelijk en kan worden gecombineerd met platforms die microfluïdische kamers gebruiken.
Introduction
Onder geboorteafwijkingen zijn aangeboren hartafwijkingen (CHD’s) de meest voorkomende, die voorkomen bij ongeveer 1% van de levendgeborenen per jaar 1,2. Genetische mutaties worden slechts in een minderheid van de gevallen geïdentificeerd, wat impliceert dat andere oorzaken, zoals afwijkingen in genregulatie, betrokken zijn bij de etiologie van CHD 2,3. Cardiale ontwikkeling is een complex proces van diverse en op elkaar inwerkende celtypen, waardoor de identificatie van causale niet-coderende mutaties en hun effecten op genregulatie een uitdaging vormen. Organogenese van het hart begint met cellulaire voorlopers die aanleiding geven tot verschillende subtypen hartcellen, waaronder myocardiale, fibroblast-, epicardiale en endocardiale cellen 4,5. Single-cell genomics is in opkomst als een belangrijke methode voor het bestuderen van de ontwikkeling van het hart en het beoordelen van de impact van cellulaire heterogeniteit op gezondheid en ziekte6. De ontwikkeling van multi-omics-methoden voor de gelijktijdige meting van verschillende parameters en de uitbreiding van computationele pijplijnen heeft de ontdekking van celtypen en subtypen in het normale en zieke hart vergemakkelijkt6. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar single-nucleus isolatieprotocol voor bevroren cardiale voorlopercellen verkregen uit muizenembryo’s dat compatibel is met downstream snRNA-seq en snATAC-seq (evenals snRNA-seq en snATAC-seq gecombineerd)7,8,9.
ATAC-seq is een robuuste methode die de identificatie van regulerende open chromatinegebieden en de positionering van nucleosomen10,11 mogelijk maakt. Deze informatie wordt gebruikt om conclusies te trekken over de locatie, identiteit en activiteit van transcriptiefactoren. De activiteit van chromatinefactoren, inclusief remodelers, evenals de transcriptionele activiteit van RNA-polymerase, kan dus worden geanalyseerd omdat de methode zeer gevoelig is voor het meten van kwantitatieve veranderingen in chromatinestructuur 1,2. ATAC-seq biedt dus een robuuste en onpartijdige benadering voor het blootleggen van de mechanismen die transcriptionele regulatie in een specifiek celtype regelen. ATAC-seq-protocollen zijn ook gevalideerd om de toegankelijkheid van chromatine in afzonderlijke cellen te meten, wat variabiliteit in de chromatine-architectuur binnen celpopulaties10,12,13 onthult.
Hoewel er de laatste jaren opmerkelijke vooruitgang is geboekt op het gebied van afzonderlijke cellen, is de grootste moeilijkheid de verwerking van de verse monsters die nodig zijn om deze experimenten uit te voeren14. Om deze moeilijkheid te omzeilen zijn verschillende tests uitgevoerd met als doel analyses uit te voeren zoals snRNA-seq en snATAC-seq met bevroren hartweefsel of cellen15,16.
Verschillende platforms zijn gebruikt om single-cell genomics-gegevenste analyseren 17. De veelgebruikte platforms voor eencellige genexpressie en ATAC-profilering zijn platforms voor meervoudige microfluïdische druppelinkapseling17. Omdat deze platforms microfluïdische kamers gebruiken, kunnen puin of aggregaten het systeem verstoppen, wat resulteert in niet-bruikbare gegevens. Het succes van eencellige studies hangt dus af van de nauwkeurige isolatie van individuele cellen / kernen.
Het hier gepresenteerde protocol gebruikt een vergelijkbare benadering als recente studies met snRNA-seq en snATAC-seq om aangeboren hartafwijkingen te begrijpen 18,19,20,21,22,23. Deze procedure maakt gebruik van de enzymatische dissociatie van vers gemicrodisseceerd hartweefsel gevolgd door de cryopreservatie van hartvoorlopercellen van muizen. Na het ontdooien worden de levensvatbare cellen gezuiverd en verwerkt voor nucleaire isolatie. In dit werk werd dit protocol met succes gebruikt om snRNA-seq- en snATAC-seq-gegevens te verkrijgen van hetzelfde nucleaire preparaat van hartvoorlopercellen van muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De analyse van de cellulaire samenstelling van het zich ontwikkelende hart door gecombineerde snRNA-seq- en snATAC-seq-studies biedt een dieper inzicht in de oorsprong van aangeboren hartaandoeningen26. Verschillende onderzoekslaboratoria hebben de effecten van cryopreservatie van hartweefsel op snRNA-seq27 bestudeerd. Het uitvoeren van snRNA-seq en snATAC-seq met behulp van vers micro-ontleed weefsel van muismodellen van menselijke ziekten kan logistiek uitdagend zijn bij …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door ERA-CVD-2019 en ANR-JCJC-2020 tot SS. We danken de Genomics and Bioinformatics-faciliteit (GBiM) van het U 1251 / Marseille Medical Genetics-laboratorium en de anonieme reviewers voor het leveren van waardevolle opmerkingen.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023)
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
