Summary
Burada, hücre çekirdeği hazırlığını tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Kardiyak dokunun mikrodiseksiyonu ve enzimatik ayrışmasından sonra, progenitör hücreler donduruldu, ardından tek çekirdekli RNA dizilimi için kullanılan saf canlı hücrelerin izolasyonu ve yüksek verimli dizileme analizleri ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli tahlil yapıldı.
Abstract
Gelişmekte olan kalp, karmaşık düzenleyici mekanizmalar tarafından kontrol edilen çeşitli progenitör hücreleri içeren karmaşık bir yapıdır. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonunun ve kromatin durumunun incelenmesi, hücre tipinin ve durumunun tanımlanmasını sağlar. Tek hücreli dizileme yaklaşımları, kardiyak progenitör hücre heterojenitesinin bir dizi önemli özelliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle taze doku ile sınırlıdır, bu da farklı deneysel koşullara sahip çalışmaları sınırlar, çünkü taze dokunun teknik değişkenliği azaltmak için aynı anda işlenmesi gerekir. Bu nedenle, bu alanda tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) ve yüksek verimli dizileme (snATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için tek çekirdekli test gibi yöntemlerden veri üretmek için kolay ve esnek prosedürlere ihtiyaç vardır. Burada, sonraki tek çekirdekli dual-omikler (kombine snRNA-seq ve snATAC-seq) için çekirdekleri hızlı bir şekilde izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, çekirdeklerin kardiyak progenitör hücrelerin dondurulmuş örneklerinden izole edilmesine izin verir ve mikroakışkan odalar kullanan platformlarla birleştirilebilir.
Introduction
Doğum kusurları arasında, konjenital kalp kusurları (KKH'ler) en yaygın olanıdır ve her yıl canlı doğumların yaklaşık% 1'inde görülür 1,2. Genetik mutasyonlar vakaların sadece küçük bir kısmında tanımlanmıştır, bu da gen regülasyonundaki anormallikler gibi diğer nedenlerin KKH 2,3'ün etiyolojisinde rol oynadığını ima etmektedir. Kardiyak gelişim, çeşitli ve etkileşimli hücre tiplerinin karmaşık bir sürecidir ve nedensel kodlamayan mutasyonların tanımlanmasını ve gen regülasyonu üzerindeki etkilerini zorlaştırır. Kalbin organogenezi, miyokardiyal, fibroblast, epikardial ve endokardiyal hücreler dahil olmak üzere farklı kalp hücreleri alt tiplerine yol açan hücresel progenitörlerle başlar 4,5. Tek hücreli genomik, kalp gelişimini incelemek ve hücresel heterojenitenin sağlık ve hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için anahtar bir yöntem olarak ortaya çıkmaktadır6. Farklı parametrelerin eşzamanlı ölçümü için multi-omik yöntemlerin geliştirilmesi ve hesaplama boru hatlarının genişletilmesi, normal ve hastalıklı kalpte hücre tiplerinin ve alt tiplerinin keşfedilmesini kolaylaştırmıştır6. Bu makalede, fare embriyolarından elde edilen dondurulmuş kardiyak progenitör hücreler için aşağı akış snRNA-seq ve snATAC-seq (ayrıca snRNA-seq ve snATAC-seq kombinasyonu) ile uyumlu güvenilir bir tek çekirdekli izolasyon protokolü açıklanmaktadır7,8,9.
ATAC-seq, düzenleyici açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına ve nükleozomların10,11'in konumlandırılmasına izin veren sağlam bir yöntemdir. Bu bilgi, transkripsiyon faktörlerinin yeri, kimliği ve etkinliği hakkında sonuçlar çıkarmak için kullanılır. Bu nedenle, remodelleyiciler de dahil olmak üzere kromatin faktörlerinin aktivitesi ve RNA polimerazın transkripsiyonel aktivitesi, yöntem, kromatin yapısı 1,2'deki nicel değişiklikleri ölçmek için oldukça hassas olduğu için analiz edilebilir. Bu nedenle, ATAC-seq, belirli bir hücre tipinde transkripsiyonel düzenlemeyi kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için sağlam ve tarafsız bir yaklaşım sağlar. ATAC-seq protokolleri, tek hücrelerde kromatin erişilebilirliğini ölçmek için de doğrulanmıştırve hücre popülasyonları 10,12,13 içindeki kromatin mimarisindeki değişkenliği ortaya koymaktadır.
Son yıllarda tek hücreler alanında kayda değer ilerlemeler olmasına rağmen, asıl zorluk bu deneyleri gerçekleştirmek için gereken taze örneklerin işlenmesidir14. Bu zorluğun üstesinden gelmek için dondurulmuş kalp dokusu veya hücre15,16 ile snRNA-seq ve snATAC-seq gibi analizlerin yapılması amacıyla çeşitli testler yapılmıştır.
Tek hücreli genomik verileri analiz etmek için çeşitli platformlar kullanılmıştır17. Tek hücreli gen ekspresyonu ve ATAC profillemesi için yaygın olarak kullanılan platformlar, çoklu mikroakışkan damlacık kapsüllemesi için platformlardır17. Bu platformlar mikroakışkan odalar kullandığından, enkaz veya agregalar sistemi tıkayabilir ve kullanılamaz verilere neden olabilir. Bu nedenle, tek hücreli çalışmaların başarısı, bireysel hücrelerin / çekirdeklerin doğru izolasyonuna bağlıdır.
Burada sunulan protokol, konjenital kalp kusurlarını anlamak için snRNA-seq ve snATAC-seq kullanan son çalışmalara benzer bir yaklaşım kullanmaktadır 18,19,20,21,22,23. Bu prosedür, taze mikrodiseke edilmiş kalp dokusunun enzimatik ayrışmasını ve ardından fare kardiyak progenitör hücrelerinin kriyoprezervasyonunu kullanır. Çözüldükten sonra, canlı hücreler saflaştırılır ve nükleer izolasyon için işlenir. Bu çalışmada, bu protokol, fare kardiyak progenitör hücrelerinin aynı nükleer preparatından snRNA-seq ve snATAC-seq verilerini elde etmek için başarıyla kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada benimsenen hayvan prosedürü, Aix-Marseille Üniversitesi (C2EA-14) hayvan etik kurulları tarafından onaylanmış ve hayvan deneyleri için atanmış ulusal etik kurul (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Yetkilendirme Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Diseksiyondan önce zamanlanmış çiftleşmenin ayarlanması
- Fare embriyoları oluşturmak için, kalp bölgesi izolasyonundan 9,5 gün önce yetişkin fareler arasında zamanlanmış bir çiftleşme gerçekleştirin. Bu prosedürde, 2-6 aylık vahşi tip C57BL / 6J fareler kullanıldı ve gece boyunca zamanlanmış çiftleşme yapıldı.
- Ertesi sabah, dişi farelerin vajinal tıkacı olup olmadığını kontrol edin. Fişin embriyonik gün (E) 0.5 olarak tanımlandığı günü düşünün.
2. Doku hazırlığı ve hücre izolasyonu
- 2-6 aylık hamile kadın C57BL/6J'yi CO2 yoluyla gebe kaldıktan sonra 9.5. günde artan konsantrasyon ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Karnın alt kısmını% 70 etanol ile temizleyin.
NOT: Servikal çıkıktan önce anesteziklerin kullanılması önerilmez, çünkü bu, embriyoları sonraki transkriptomik ve epigenomik çalışmaları etkileyebilecek çevresel değişikliklere maruz bırakacaktır. - Karın ve periton makasla açın. Rahim boynuzlarını görselleştirin ve her iki boynuzu da çıkarmak için forseps kullanın.
- Boynuzları% 1 FBS ile soğuk komple ortam içeren bir Petri kabına yerleştirin. Belirli bir hacim gerekmese de, embriyoların ortama tamamen daldırıldığından emin olmak için özen gösterilmelidir. 10 cm Petri kabı başına yaklaşık 10 mL'lik bir hacim uygundur.
- 5x büyütmede ayarlanmış stereomikroskop altında ve forseps kullanarak, endometriyal dokuyu, plasentayı ve yumurta sarısı kesesini her embriyodan çıkarın.
- Embriyoları% 1 FBS ile soğuk komple ortama sahip bir Petri kabına yerleştirin. Embriyonik kalp bölgesini, Şekil 1'de gösterilen şematik embriyoda tarif edildiği gibi, soğuk tam ortamda diseke edin.
- Beş fare embriyosundan disseke edilen kalp bölgelerini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin. Ön soğutma sallanan kova santrifüjleri 4 °C'ye kadar santrifüjler.
- Sallanan kovalı bir santrifüjde RT'de 1 dakika boyunca 300x g'de santrifüj. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL doku kültürü dereceli PBS ekleyerek dokuları yıkayın.
- RT'de 1 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatanı çıkarın ve toplam iki yıkama için yıkama adımlarını tekrarlayın. PBS'yi %0,05 tripsin/EDTA (1x) ile değiştirerek yıkamayı iki kez tekrarlayın.
- Doku sindirimi için, 37 ° C'de 10 dakika boyunca 50 μL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin. Geniş delikli bir filtre ucu kullanarak 5 dakika sonra yukarı ve aşağı hareketlerle nazik mekanik ayrışma uygulayın.
- Ayrışmış hücrelere 350 μL tam ortam ekleyerek tripsin sindirim aktivitesini inaktive edin. Yeniden askıya alınan hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
3. Hücre sayımı ve canlılık değerlendirmesi
NOT: Hücre sayısı ve canlılığı, tek hücreli deneylerin başarısı için kritik parametrelerdir. snATAC-seq yaklaşımı, hücre sayısındaki küçük değişikliklere duyarlıdır. Çok az hücre, kromatinin aşırı sindirilmesine neden olur, bu da daha fazla sayıda okuma ve erişilemeyen kromatin bölgelerinin haritalanmasına (gürültü) neden olur. Benzer şekilde, çok fazla hücreye sahip olmak, sıralanması zor olan yüksek moleküler ağırlıklı parçalar üretir. Hücre ve çekirdek konsantrasyonlarının doğru bir şekilde belirlenmesi için, hücre sayısı ve canlılığı iki farklı yöntemle değerlendirildi.
- Aşağıda açıklandığı gibi hücre sayımı için bir tripan mavisi testi yapın.
- Vorteks% 0.4 tripan mavisi boyama çözeltisi, 2.000 x g'de oda sıcaklığında 10 s boyunca döndürün ve 10 μL'yi bir mikrotüpe aktarın.
- Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu karıştırın ve önceden alıntılanmış 10 μL tripan mavisi çözeltisine 10 μL süspansiyon ekleyin. Bir pipetle 10 kez dikkatlice karıştırın.
- Boyanmış hücrelerin 10 μL'sini bir sayım slaytına aktarın. Hücre konsantrasyonunu ve canlılığını otomatik olarak hesaplamak için slaytı sayaca yerleştirin.
- Aşağıda açıklandığı gibi floresan bazlı bir mortalite değerlendirmesi yapın.
NOT: Bu tahlil, hücre canlılığını değerlendirmek için floresan boyaların (ethidyum homodimer-1, EthD-1 ve kalsein) kullanımına dayanmaktadır. Ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanıldı ve uygun hazırlık ve kullanım için sağlayıcının talimatlarına uyuldu.- 1 mL steril doku kültürü sınıfı D-PBS'ye birlikte verilen 2 mM EthD-1 stok çözeltisinin 5 μL'sini ekleyerek 10 μM EthD-1 çözeltisi hazırlayın ve tam karıştırmayı sağlamak için 5 sn boyunca vorteks yapın.
- Birlikte verilen 4 mM kalsein stok çözeltisinin 2,5 μL'sini önceden hazırlanmış EthD-1 çözeltisine aktarın. Tam karıştırma sağlamak için 5 sn vorteks.
- Elde edilen 10 μM EthD-1 ve 10 μM kalsein çalışma çözeltisinden 10 μL'sini 10 μL hücre süspansiyonuna ekleyin.
NOT: Kalsein, sulu çözeltilerde hidrolize karşı oldukça hassastır, bu nedenle bu çalışma solüsyonunu 1 gün içinde kullanın. - Boyanmış hücrelerin 10 μL'sini bir sayım slaydı üzerine aktarın. Slaytı otomatik floresan hücre sayacına yerleştirin. GFP filtresi kullanarak canlı hücreleri ve RFP filtresi kullanarak ölü hücreleri sayın.
NOT: İki sayım yöntemi benzer hücre sayıları ve canlılığı verdi ve yeni ayrışmış hücrelerin toplam sayısının embriyonik kalp bölgesi başına ortalama 20.000 hücre (0.06mm3) olduğu tahmin edildi.
4. Hücre dondurma
- Hücre süspansiyonunu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı tüpün dibine dokunmadan dikkatlice çıkarın ve peleti 1 mL soğutulmuş dondurma ortamında tekrar askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş bir kriyovyal içine aktarın ve kriyovali önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin.
- Kabı 4 saat ila 8 saat boyunca −80 ◦C'ye yerleştirin. Aşağı akış tek çekirdekli RNA ve ATAC dizileme deneyleri için kriyovyal sıvı azota aktarın.
NOT: Kriyoviyal kullanımdan önce kuru buz üzerinde taşınmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücreler hücre canlılığı kaybı olmadan en az 6 ay boyunca sıvı azotta saklanabilir. Buz kristallerinin oluşumunu önlemek için depolama sıcaklığı her zaman -150 ° C'nin altında tutulmalıdır.
5. Hücre çözülmesi ve ölü hücrelerin çıkarılması
- Kriyovyalleri 1-2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Kriyoviyalde küçük bir kristal kaldığında çıkarın.
- 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) tam ortam ekleyin. Bir pipetle üç kez karıştırın. Süspansiyonu, 10 mL sıcak tam ortam içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Tüm hücre süspansiyonunu 30 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Süzgeci 1-2 mL ılık tam ortam ile durulayın ve akışı aynı konik tüpte toplayın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. PBS ile bir kez yıkayın ve hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.
- Peletlenmiş hücrelere sağlanan manyetik mikroboncuklardan 100 μL ekleyin ve geniş delikli bir pipet ucu kullanarak beş kez homojenize edin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Bu arada, manyetik ayırma kolonunu (kapasite: 1 x 107 ila 2 x 108 hücre) 500 μL 1x bağlama tamponu ile durulayın.
- İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikroboncukları içeren hücre süspansiyonunu 500 μL 1x bağlayıcı tampon ile seyreltin.
- Hücre süspansiyonunu (0.6 μL) hazırlanan manyetik ayırma kolonuna uygulayın. Akış, negatif olarak seçilmiş canlı hücre fraksiyonudur ve manyetik olarak tutulan fraksiyon, pozitif olarak seçilen ölü hücrelerdir.
- Canlı hücre atık suyunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunu içeren 1,5 mL mikrotüpü ve sütunu 2 mL 1x bağlama tamponu ile durulayın ve atık suyu aynı 15 mL tüpte toplayın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.
- PBS-BSA çözeltisinden 1 mL ekleyin ve geniş delikli pipet ucu kullanarak beş kez pipetleyerek hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Hücre topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.
- Peletin yeniden askıya alınması için 1 mL PBS-BSA ekleyin ve toplam iki yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.
- Hücreleri 100 μL PBS-BSA çözeltisinde yeniden askıya alın. 10 kez pipetleyerek hafifçe karıştırın.
- Daha önce açıklanan yöntemleri kullanarak hücrelerin konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin (adım 3.1 ve adım 3.2). Bir sonraki adıma geçmek için, hücre sayısının ≥100.000 hücre olduğundan emin olun. Temsili sonuçlar için Şekil 2'ye bakın.
NOT: Kriyoprezervasyon, canlı hücrelerin ilk başlangıç materyalinin yaklaşık% 40'ının kaybına neden olur. Başlangıç hücre sayısına bağlı olarak, manyetik bir sütun üzerindeki boncuk ayrımı yüksek hücre canlılığı ile sonuçlanır, ancak toplam hücre sayısını iki kat ila beş kat arasında böler. Ölü hücreleri çıkarmak için kolon tabanlı bir manyetik kitin kullanılması, yalnızca yeterli başlangıç malzemesi mevcut olduğunda tavsiye edilir.
6. Çekirdek izolasyonu
NOT: snATAC ve snRNA-seq kombine temiz ve sağlam çekirdeklerin süspansiyonu ile gerçekleştirilir. Kullanılan hücre tipi için lizis koşullarının (lizis süresi ve NP40 konsantrasyonu) optimizasyonu önerilir. En uygun lizis zaman noktası ve deterjan konsantrasyonu, nükleer morfolojiyi bozmadan maksimum sayıda hücrenin lize edilmesine neden olanlardır. Hücre/çekirdek kaybı, sabit açılı santrifüj yerine sallanan kovalı santrifüj kullanılarak azaltılabilir. Plastiklerde çekirdek tutulmasını en aza indirmek için, düşük retansiyonlu pipet uçlarının ve santrifüj tüplerinin kullanılması önerilir. Bu, çekirdek geri kazanımını artırabilir. Pipet uçlarının ve santrifüj tüplerinin %5 BSA ile kaplanması daha ucuz ancak daha fazla zaman alan bir alternatiftir.
- Çalışma yerini ve malzemeleri% 70 etanol ve RNaz giderici çözelti ile temizleyin.
- Ön soğutma sallanan kova santrifüjleri 4 °C'ye kadar santrifüjler. Lizis tamponu, lizis seyreltme tamponu, 0.1x lizis tamponu ve yıkama tamponunu taze hazırlayın (bakınız Tablo 1). Tamponları buz üzerinde tutun.
- Hücre süspansiyonunu 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca sallanan kovalı bir santrifüjde santrifüjleyin. Hücre topağının yerinden çıkmasını önlemek için tüpün dibine dokunmadan tüm süpernatantı yavaşça çıkarın.
- 100 μL soğutulmuş 0.1x lizis tamponu ekleyin. 10 kez pipetleyerek hafifçe karıştırın. Buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1 mL soğutulmuş yıkama tamponu ekleyin ve beş kez pipetleyerek yavaşça karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj. Çekirdek topağını bozmadan süpernatantı çıkarın.
- Soğutulmuş yıkama tamponu ile yıkamaları toplam üç yıkama için tekrarlayın. Seyreltilmiş çekirdek tamponunu hazırlayın. Yeniden süspansiyondan sonra, çekirdek stok çözeltisini buz üzerinde tutun.
7. İzole edilen çekirdeklerin kalite ve miktar değerlendirmeleri
NOT: İlk hücre sayısına dayanarak ve hücre lizisi sırasında yaklaşık% 50 çekirdek kaybını tahmin ederek, soğuk seyreltilmiş çekirdek tamponunda uygun sayıda hücreyi yeniden askıya alın. Soğutulmuş seyreltilmiş çekirdek tamponu ile yeniden süspansiyon hacminin hesaplanması, hedeflenen çekirdek geri kazanımına ve üreticinin kullanım kılavuzu tarafından önerilen ilgili çekirdek stok konsantrasyonlarına dayanır. Ek Protokol 1'de bu hesaplamanın bir örneğine bakın.
- İlk hücre sayısına dayanarak ve hücre lizisi sırasında yaklaşık% 50 çekirdek kaybını tahmin ederek, soğuk seyreltilmiş çekirdek tamponunda uygun sayıda hücreyi yeniden askıya alın.
- Gerçek çekirdek konsantrasyonunu belirleyin. 2 μL çekirdek stok çözeltisini 8 μL seyreltilmiş çekirdek tamponu ile karıştırın ve karışımı önceden alıntılanmış 10 μL tripan mavisi veya EthD-1/calceinAM çalışma çözeltisine ekleyin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın. Hücrelerin% 5'inden azı canlı olmalıdır. Temsili sonuçlar için Şekil 3'e bakın.
- Transpozisyon reaksiyonu için önerilen konsantrasyonda toplam 5 μL hacim elde etmek için çekirdek stoğunun hacmini ve seyreltilmiş çekirdek tamponunun hacmini hesaplayın (üreticinin kullanım kılavuzuna bakın). Hemen kullanım kılavuzu17'ye göre transpozisyon reaksiyonuna geçin.
NOT: Transpozisyon reaksiyonundan ATAC ve GEX kütüphanelerinin inşasına kadar tüm adımlar, snRNA-seq ve snATAC-seq kombine17 için kullanılan kitin kullanım kılavuzuna göre gerçekleştirilmiştir.
8. snRNA-seq ve snATAC-seq kütüphanelerinin kalite analizi
- Yeni nesil dizilemeye geçmeden önce, son snATAC-seq ve gen ekspresyonu GEX kütüphanelerinin kalite ve boyut dağılımını doğrulayın. Parça analiz sistemlerini kullanarak kütüphanelerde tanımlanan dizilerin kalitesini ve miktarını değerlendirin. Temsili kalite değerlendirme sonuçları için Şekil 4'e bakınız.
NOT: snATAC-seq kütüphanelerinin son izi, nükleozom sargısının periyodikliğini göstermeli ve boyutlar 200 bp ile birkaç Kbp arasında değişmeli, oysa gen ekspresyon kütüphanesindeki boyutlar 300 bp ila 600 bp arasında değişmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek hücreli yaklaşımlar için tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasına kıyasla, tek çekirdekli süspansiyonların hazırlanması çok daha zordur ve daha yüksek derecede çözünürlük ve işleme gerektirir. Başarılı kombine snRNA-seq ve snATAC-seq için anahtar faktör, temiz ve sağlam bir çekirdek süspansiyonudur. Etkili çekirdek izolasyonu protokolü, her doku tipine ve durumuna (taze veya dondurulmuş) uyarlanmalıdır. Burada, çekirdeklerin dondurulmuş fare embriyonik kalp hücrelerinden izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Embriyonik kardiyak bölge diseksiyonu ve kardiyak hücre dissosiyasyonundan çekirdek izolasyonuna kadar tüm basamaklar Şekil 1'de özetlenmiştir. Başlangıç materyali için, verimli çekirdek izolasyonu için 1 x 105-1 x 106 hücreli hücre sayısı ve hücre canlılığı %>70 önerilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, çözüldükten sonra ölü hücreleri sıralamak ve çıkarmak için bu protokolde gerçekleştirilen ek adım, önemli ölçüde daha yüksek hücre canlılığına sahip daha temiz bir hücre süspansiyonu elde edilmesine ve başlangıç numunesinin kalitesinin iyileştirilmesine izin vermiştir. Çekirdek izolasyonuna ek olarak, bu protokol izole edilmiş çekirdeklerin kalitesinin ve miktarının nasıl değerlendirileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar (Şekil 3). İzole edilmiş çekirdeklerin kalitesi, snRNA-seq ve snATAC-seq birleşik verilerinin kalitesini büyük ölçüde etkiler; Burada izole edilen çekirdeklerin kalitesi nükleer membran morfolojisinin değerlendirilmesi ile değerlendirildi. İzole edilmiş çekirdekler, Şekil 3C'de gösterildiği gibi, parlak alan mikroskobu altında, etkili bir izolasyon sürecini gösteren pürüzsüz ve düzgün bir şekilde yuvarlak görünüyordu. Daha fazla doğruluk için, hücreleri ve çekirdekleri ölçmek için tripan mavisi ve floresan bazlı canlılık değerlendirmesi için bir kit de dahil olmak üzere iki farklı sayım yöntemi kullanılmıştır. Floresan testi, hücresel bütünlük ve hücre içi esteraz aktivitesine dayalı hücre canlılığını belirlemek için kullanıldı. Bu boya çözeltisi, hücre içi esteraz aktivitesini gösteren yeşil floresan kalsein'yi ve hücresel bütünlüğün kaybını yansıtan kırmızı floresan ethidyum homodimer 1'i aynı anda görselleştirerek canlı hücrelerin ölü hücrelerden ayırt edilmesini sağlar. Sayma için floresan boya kullanmak, çekirdekleri hücre kümelerinden ve döküntülerden ayırt etmeye yardımcı olur. Bu protokolü kullanarak, hücre canlılığı, Şekil 3A, B'de gösterildiği gibi, çekirdek izolasyonundan önce% 80-90'dan, çekirdek izolasyonundan sonra% <5'e geçmiştir.
Prosedürümüz, taze dokunun doğrudan sıvı azot içinde dondurulmasını ve lizing adımının önceden enzimatik ayrışma olmadan gerçekleştirilmesini içeren mevcut yöntemle karşılaştırıldı (Ek Protokol 2 ve Ek Şekil 1). Her iki yaklaşım da hangi yöntemin daha kaliteli bir çekirdek süspansiyonu sağladığını belirlemek için test edildi. Tüm embriyonik kalp dokusunun dondurulması, canlı olarak tespit edilen lize edilmemiş hücrelerin yüksek bir yüzdesine yol açmıştır ve bu da uygunsuz hücre lizisine işaret etmektedir (Ek Şekil 1A). Agregalar ve bireysel olmayan hücreler, filtreler yoluyla filtrasyona rağmen gözlendi (Ek Şekil 1A,B).
İzole edilen çekirdekler, eklem snATAC-seq ve snRNA-seq için kütüphaneler oluşturmak için kullanıldı. Şekil 4 , gen ekspresyonu (GEX) kütüphanesinin ve ATAC kütüphanesinin yapımında kullanılan cDNA'nın kalite kontrol sonuçlarını göstermektedir. Kalite kontrol otomatik elektroforez kullanılarak yapıldı (Şekil 5A). mRNA'dan türetilmiş cDNA'lar nicelleştirildi ve verim, GEX kütüphanesi yapımında daha sonra kullanılmak üzere yeterliydi. ~ 300 bp ila 600 bp arasında değişen yüksek kaliteli bir GEX kütüphanesi ve 200 bp ila 7 kbp arasında değişen periyodik nükleozom sargısına sahip yüksek kaliteli bir ATAC kütüphanesi elde edildi. Bu kütüphaneler yüksek verimli dizileme ile sıralandı ve başarılı bir şekilde tek çekirdekli gen ekspresyonu ve kromatin erişilebilirliği oluşturuldu (Şekil 5A). Bu ham veriler, fare E9.5 kardiyak progenitör hücrelerinin transkripsiyonel ve epigenetik profillemesini oluşturmak için çoğullanmaya ve biyoinformatik olarak analiz edilmeye hazırdı. SnRNA-seq ve snATAC-seq, tek genomik24 için Seurat araç seti ile denetimsiz kümeleme kullanılarak bilinen belirteç genlerine dayanarak kümelendi, tanımlandı ve etiketlendi. Bu ilk analiz, E9.5'te beklenen tüm kardiyak hücre tiplerinin varlığını doğruladı (Şekil 5B).
Yukarıdaki sonuçların tümü, bu protokolün dondurulmuş embriyonik kalp hücrelerinden aşağı akış tek çekirdek yaklaşımları için uygun olan çekirdekleri izole etmedeki başarısını desteklemektedir.
Şekil 1: Kombine snRNA-seq ve snATAC-seq profillemesi için numune hazırlamadaki ana adımların gösterimi. Bu akış şeması, aynı hücreden mRNA ve kromatin erişilebilirliğinin eşzamanlı tespiti için gerçekleştirilen kalp dokusu diseksiyonu ve kalp hücresi dissosiyasyonu, hücre dondurma ve çözülme, ölü hücrelerin çıkarılmasıyla canlı hücre saflaştırma ve çekirdek izolasyonu dahil olmak üzere tüm adımları özetler. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; BSA = sığır serum albümini; RT = oda sıcaklığı. BioRender.com ile oluşturuldu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ölü hücre sıralamadan sonra optimize edilmiş çözülmüş hücrelerin yaşayabilirliği. Tripan mavisi dışlama boyası kullanılarak ölü hücre çıkarmadan önce (üstte) ve sonra (altta) otomatik bir hücre sayacı kullanılarak hücre sayısını ve canlılığını gösteren görüntüler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çekirdek preparatının kalite kontrolü. (A,B) Çekirdek izolasyonundan önce (üstte) ve sonra (altta) otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını ve canlılığını gösteren görüntüler. İki sayma yöntemi kullanıldı: (A) floresan mortalite testi ve (B) tripan mavisi testi. (C) Çekirdek izolasyonunun kalitesini gösteren görüntüler. Görüntüler parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılarak 20x'te (ölçek çubuğu = 50 μm) çekildi. Parlak alan görüntüsü (solda) nükleer morfolojiyi göstermektedir; RFP (orta), membran bütünlüğünü kaybeden hücreleri, başka bir deyişle izole edilmiş çekirdekleri gösterir; ve normalde buradaki canlı hücrelerin esteraz aktivitesini gösteren GFP (sağda), çekirdek süspansiyonunda canlı hücrelerin bulunmadığını doğrular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek hücreli gen ekspresyonunun ve ATAC kütüphanelerinin kalite kontrolü. cDNA (üstte), GEX kütüphanesinin (ortada) ve ATAC kütüphanesinin (altta) kalite ve boyut dağılımını gösteren otomatik elektroforez ile DNA analizi. cDNA nicelemesi için, 200 bp ila 8.900 bp arasında değişen bölge seçildi ve biyoanalizör cDNA konsantrasyonunu tahmin etti (pg / μL; kırmızı daire cinsinden). GEX kütüphanesi yapımına devam etmek için yeterli cDNA verimi elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Cell Ranger yazılımı25 ile değerlendirilen örnek performans. (A) X ekseninde barkod başına pik ve y ekseninde barkod başına RNA benzersiz moleküler tanımlayıcılarında (UMI'lar) transpozisyon olaylarını gösteren çapraz duyarlılık grafiği. Beklendiği gibi, hücreler esas olarak yüksek RNA ve ATAC verileri ile sağ üst köşede bulunur. Hücreler ve hücre olmayanlar arasında net bir ayrım gözlendi (boş GEM'ler, arka plan sinyali). (B) ScRNA-seq (solda) ve scATAC-seq (sağda) yakalanan tüm hücrelerin küme kimliğine göre renklendirilmiş ve hücre tiplerine göre gruplandırılmış temsili tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) grafiği. Kümelerin iyi bir şekilde ayrılması gözlendi. Ortak GEX ve ATAC ham verileri, diseke edilmiş E9.5 fare embriyonik kalp bölgesinden 7.000 çekirdeğin diziliminden elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Taze dokunun doğrudan sıvı azot içinde dondurulmasını içeren mevcut yöntemden çekirdek izolasyonunun kalite kontrolü. (A) 40 μm'lik bir süzgeçten önce (üstte) ve sonra (altta) dışlama boyası olarak otomatik bir hücre sayacı ve tripan mavisi kullanılarak izole edilmiş çekirdek sayısını gösteren görüntüler. Lize edilmemiş hücrelerin yüksek bir yüzdesi canlı olarak tespit edildi. % 20 canlı hücrelerin tespiti, uygunsuz hücre lizizini gösterir. Siyah oklar agregaları gösterir. (B) İzole edilmiş çekirdeklerin kalitesini gösteren görüntüler. Görüntüler parlak alan ve floresan mikroskobu kullanılarak 20x (50 μm ölçek çubuğu ile üst ve orta) ve 40x (25 μm ölçek çubuğu ile alt) olarak çekildi. Parlak alan görüntüsü (solda) nükleer morfolojiyi göstermektedir; RFP (sağda) membran bütünlüğünü kaybeden hücreleri, yani izole edilmiş çekirdekleri gösterir. Siyah oklar, enkaz tarafından tutturulmuş çekirdek parçacıklarını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Prosedürde kullanılan tamponlar ve çözeltiler tablosu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Protokol 1: İzole edilen çekirdeklerin miktarının değerlendirilmesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Protokol 2: Çekirdeklerin flaş dondurulmuş dokudan izolasyonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelişmekte olan kalbin hücresel bileşiminin kombine snRNA-seq ve snATAC-seq çalışmaları ile analizi, konjenital kalp hastalığının kökeni hakkında daha derin bir anlayış sağlar26. Birkaç araştırma laboratuvarı, kardiyak doku kriyoprezervasyonunun snRNA-seq27 üzerindeki etkilerini incelemiştir. İnsan hastalığının fare modellerinden taze mikro-disseke edilmiş doku kullanarak snRNA-seq ve snATAC-seq iletmek, farklı deneysel koşulları karşılaştırırken lojistik olarak zor olabilir. Belirli bir gelişim aşaması için bir zorluk, numune işlemenin getirdiği teknik değişkenliği azaltmak için kontrol ve deney gruplarının aynı çalışmada işlenmesi gerektiğidir. Taze dokunun işlenmesi mümkün olmadığında, sonuçlarımıza dayanarak, tüm embriyonik kalp dokusunu dondurmak yerine ayrıştırmanız ve daha sonra kriyoprotekte etmeniz önerilir. Bir yöntemin diğerine göre seçimi, kalp dokusu bütün olarak dondurulmuşsa, çözüldükten sonra canlı tek hücrelerin izole edilmesinin çok daha zor olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, doku ayrışma protokolü optimize edilmezse, dokunun tamamını dondurmak daha iyi olabilir. Kriyoprezervasyonun ardından ayrışma, bu doku ayrışma protokolünün hücre tipi önyargısı olmayan% >90 taze canlı hücreler vermesi nedeniyle tercih edilir.
Bu yaklaşımın, taze doku gereksinimini ortadan kaldıran dondurulmuş hücrelerin kullanımı ve bozulmamış tek çekirdeklerin izolasyonuna izin veren tek hücreli bir ayrışma adımının kullanılması gibi çeşitli faydaları vardır; Gerçekten de bu, aşağı akış tek hücreli analiz için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, enzimatik ayrışma, hücre popülasyonlarında transkripsiyonel önyargıyı indükleyebilir. Enzimatik hücre ayrışması, hücresel mikro çevreye müdahale eder ve bu nedenle, çoğu hücre tipinde transkripsiyonel değişiklikleri indükler28. Bu değişikliklerin birincil belirleyicisi, hücre tipi29 değil, ayrışma zamanıdır. Ayrışmaya bağlı artefaktları ılımlılaştırmak için, önerilen sindirim süresini takip etmek önemlidir. Farklı dokularda yayınlanan literatür, 30 dakika veya daha kısa bir sindirim süresinin küçük transkripsiyonel değişikliklere neden olduğunu göstermektedir28,30. Ek olarak, veri bozulmalarını en aza indirmek için biyoinformatik müdahaleler kullanılabilir31,32.
Saf ve sağlam tek çekirdeklerin elde edilmesi tek çekirdekli genomikte en önemli faktördür. Tek hücreli platformların mikroakışkan odalarının hücre kümelerinin veya organik kalıntıların varlığı nedeniyle tıkanması, düşük veri kalitesine veya daha sorunlu bir şekilde deneysel başarısızlığa yol açar. Bu prosedürde, enzimatik ayrışma, kriyoprezervasyon ve canlı kardiyak progenitör hücrelerin saflaştırılması birleştirilerek mevcut protokoller değiştirildi. Prosedürümüz, FACS sıralamaya gerek kalmadan saf çekirdeklerin izolasyonuna izin verir. Bu prosedürü kullanarak, kümelenmeden, neredeyse hiç döküntü olmadan ve sağlam tek çekirdekler olmadan yüksek kaliteli bir nükleer süspansiyon elde ettik. Hücre izolasyon adımı, potansiyel çekirdeklerin kümelenmesini önlemek için çok önemlidir; Gerçekten de bu, büyük pipet uçları kullanılarak nazik pipetleme yapılarak veya çekirdekler filtrelenerek önlenebilir. Farklı adımlarda filtrelerin kullanılması ve ardından ışık mikroskobu altında gözlem yapılması bu tür sorunları önleyebilir.
Burada tarif edilen protokol, E9.5 kardiyak progenitör hücrelerden elde edilen aynı çekirdek preparasyonundan snRNA-seq ve snATAC-seq profillemesi için başarıyla kullanılmıştır. Bu yöntem, hamile vahşi tip farelerde, konjenital kalp kusurları için fare modellerine karşı kullanılabilir. Konjenital kalp defektleri muhtemelen kardiyak progenitör hücrelerin farklılaşmasını, çoğalmasını, migrasyonunu ve hayatta kalmasını kontrol eden yolakların bozulmasına bağlı olarak ortaya çıkar33,34. Bu kusurların kökenini daha iyi anlamak için, bu çalışma özellikle konjenital kalp kusurlarında etkilenen ana alanların progenitörlerinin, özellikle ikinci kalp alanı11'in kardiyak progenitörlerinin ve nöral krest35'in mevcut olduğu embriyonik evre 9.5'e odaklanmıştır. Bu prosedürün yetişkin fare kalbi ve insan kalbi hücrelerine uygulanması, özellikle hücre ayrışması ve lizis adımları açısından protokolün optimizasyonunu gerektirir.
Manuel ve otomatik hücre sayımı arasındaki ana hususlar maliyetler, işçilik ve doğruluktur. Otomatik sayaçlar, manuel sayım yapan çoğu yetenekli bilim insanından daha hızlıdır. Özellikle çok sayıda numune ile uğraşırken, sadece sayım tuşuna basıp sonucu görüntüleyebilmek büyük fayda sağlar. Bu önemli bir noktadır, çünkü çekirdekler izole edildikten sonra, bütünlüklerinin kaybolmasını önlemek için hızlı bir şekilde işlenmeleri gerekir. Otomatik sistemlerin birincil doğruluk yararı, bu sistemlerin kullanıcılar veya laboratuvarlar arasındaki değişkenliği ortadan kaldırmasıdır. Diğer bir avantaj, otomatik sistemlerin tipik olarak hemositometrelerden daha geniş bir görüş alanına sahip olmasıdır. Hücrelerin/çekirdeklerin sayısı veya hücrelerin/çekirdeklerin konsantrasyonu daha düşük olduğunda, bu daha geniş görüş alanı kesinlikle geleneksel manuel yönteme göre bir avantajdır.
İyonik olmayan deterjanın konsantrasyonu çok yüksek olduğunda yüksek oranda mitokondriyal DNA kontaminasyonu gözlenebilir. Lizis tamponundaki konsantrasyonunu azaltarak, bu kontaminasyon çekirdeklerin verimini düşürmeden azaltılabilir. En tatmin edici sonuçlar %0.1 deterjan içeren lizis tamponu ile yaptığımız deneylerde elde edilmiştir. Çekirdekleri bir salıncak kovasında döndürmek, peletteki mitokondri sayısını da azaltabilir.
Tn5 transpozazın çekirdeklere uygun bir oranına sahip olmak, başarılı snATAC-seq13,14 için çok önemlidir. Örneğin, çok fazla Tn5'e sahip olmak, kapalı kromatin ve sıralama kütüphanelerinin düşük karmaşıklığı nedeniyle yüksek bir arka plana yol açabilirken, alt lizis tam bir PCR güçlendirilmiş kütüphane13 ile sonuçlanmayabilir. Çekirdek sayısını doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı yöntem kullandık.
Multimodal omik veri setleri, genomik organizasyonun çoklu seviyelerini aynı anda araştırma fırsatı sunar 9,36. Ortak RNA ve ATAC multimodal yaklaşımı, yukarı akış düzenleyicilerinin ve aşağı akış metabolik genlerinin incelenmesini sağlar ve tek hücreli çözünürlükte kalp gelişimi bağlamında transkripsiyonel ağların ve kromatin mimarisinin incelenmesi için kapsamlı bir yaklaşım sağlar. Tek çekirdekli izolasyon için bu protokol, ekspresyon ve kromatin veri kümelerinin hem bireysel hem de ortak değerlendirmesi ile uyumludur. Kromatin erişilebilirliği önemli bir epigenetik düzenleme seviyesidir, çünkü spesifik genomik bölgelerde transkripsiyonel düzenleyicilerin aktivitesini sağlar 8,9,10,11,12,13. Bu nedenle, düzinelerce olası transkripsiyon faktörünün kimliği ve hedef bölgeleri hakkında çok sayıda bilgi, kromatin profilindeki DNA dizisi tarafından sağlanır. snATAC-seq tarafından elde edilen bilgilerin snRNA ekspresyon profillemesi ile karşılaştırılması, daha sonra Cut&Run37 tarafından daha fazla analiz edilebilen en alakalı transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu prosedürün ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacağını ve araştırmaları için bu güçlü yöntemi kullanmalarını teşvik edeceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma SS'ye ERA-CVD-2019 ve ANR-JCJC-2020 tarafından desteklenmiştir. U 1251/Marsilya Tıbbi Genetik laboratuvarından Genomik ve Biyoinformatik tesisine (GBiM) ve değerli yorumlar sağlayan isimsiz hakemlere teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
