Summary
Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.
Abstract
O coração em desenvolvimento é uma estrutura complexa contendo várias células progenitoras controladas por mecanismos regulatórios complexos. O exame da expressão gênica e do estado da cromatina de células individuais permite a identificação do tipo e estado celular. Abordagens de sequenciamento unicelular têm revelado uma série de características importantes da heterogeneidade de células progenitoras cardíacas. No entanto, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, o que limita estudos com diversas condições experimentais, pois o tecido fresco deve ser processado de uma só vez no mesmo período para reduzir a variabilidade técnica. Portanto, procedimentos fáceis e flexíveis para produzir dados de métodos como o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (snATAC-seq) são necessários nesta área. Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos para núcleos únicos subsequentes dual-omics (snRNA-seq e snATAC-seq combinados). Este método permite o isolamento de núcleos de amostras congeladas de células progenitoras cardíacas e pode ser combinado com plataformas que utilizam câmaras microfluídicas.
Introduction
Dentre os defeitos congênitos, os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são os mais comuns, ocorrendo em cerca de 1% dos nascidos vivos a cada ano 1,2. Mutações genéticas são identificadas em apenas uma minoria dos casos, implicando que outras causas, como anormalidades na regulação gênica, estão envolvidas na etiologia daCC2,3. O desenvolvimento cardíaco é um processo complexo de tipos celulares diversos e interagentes, tornando desafiadora a identificação de mutações causais não codificantes e seus efeitos na regulação gênica. A organogênese do coração inicia-se com progenitores celulares que dão origem a diferentes subtipos de células cardíacas,incluindo células miocárdicas, fibroblastas, epicárdicas e endocárdicas4,5. A genômica unicelular está emergindo como um método-chave para estudar o desenvolvimento cardíaco e avaliar o impacto da heterogeneidade celular na saúde e na doença6. O desenvolvimento de métodos multi-ômicos para a mensuração simultânea de diferentes parâmetros e a expansão de pipelines computacionais tem facilitado a descoberta de tipos e subtipos celulares no coração normal edoente6. Este artigo descreve um protocolo confiável de isolamento de núcleo único para células progenitoras cardíacas congeladas obtidas de embriões de camundongos que é compatível com snRNA-seq e snATAC-seq a jusante (bem como snRNA-seq e snATAC-seq combinados)7,8,9.
O ATAC-seq é um método robusto que permite a identificação de regiões reguladoras da cromatina aberta e o posicionamento de nucleossomos10,11. Essas informações são usadas para tirar conclusões sobre a localização, identidade e atividade dos fatores de transcrição. A atividade de fatores da cromatina, incluindo remodeladores, bem como a atividade transcricional da RNA polimerase, podem, portanto, ser analisadas, uma vez que o método é altamente sensível para medir mudanças quantitativas na estrutura da cromatina 1,2. Assim, ATAC-seq fornece uma abordagem robusta e imparcial para descobrir os mecanismos que controlam a regulação transcricional em um tipo celular específico. Protocolos ATAC-seq também foram validados para medir a acessibilidade da cromatina em células isoladas, revelando variabilidade na arquitetura da cromatina dentro de populações celulares10,12,13.
Embora tenha havido notáveis avanços no campo das células isoladas nos últimos anos, a principal dificuldade é o processamento das amostras frescas necessárias para a realização dessesexperimentos14. Para contornar essa dificuldade, vários testes têm sido realizados com o objetivo de realizar análises como snRNA-seq e snATAC-seq com tecido cardíaco congeladoou células 15,16.
Várias plataformas têm sido utilizadas para analisar dados de genômica unicelular17. As plataformas amplamente utilizadas para expressão gênica de célula única e perfil ATAC são plataformas para encapsulamento de gotículas microfluídicas múltiplas17. Como essas plataformas utilizam câmaras microfluídicas, detritos ou agregados podem entupir o sistema, resultando em dados inutilizáveis. Assim, o sucesso de estudos unicelulares depende do isolamento preciso de células/núcleos individuais.
O protocolo aqui apresentado utiliza abordagem semelhante a estudos recentes utilizando snRNA-seq e snATAC-seq para compreensão de cardiopatias congênitas 18,19,20,21,22,23. Este procedimento utiliza a dissociação enzimática do tecido cardíaco recém-microdissecado seguido da criopreservação de células progenitoras cardíacas de camundongos. Após o descongelamento, as células viáveis são purificadas e processadas para isolamento nuclear. Neste trabalho, este protocolo foi utilizado com sucesso para obter dados de snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação nuclear de células progenitoras cardíacas de camundongos.
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Protocol
O procedimento animal adotado neste estudo foi aprovado pelos comitês de ética animal da Universidade Aix-Marseille (C2EA-14) e foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo comitê nacional de ética para experimentação animal (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorização Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Configurando o acasalamento cronometrado antes da dissecação
- Para gerar embriões de camundongos, realize um acasalamento cronometrado entre camundongos adultos 9,5 dias antes do isolamento da região cardíaca. Neste procedimento, camundongos selvagens C57BL/6J com idade entre 2-6 meses foram usados, e o acasalamento cronometrado foi realizado durante a noite.
- Na manhã seguinte, verifique se as ratas fêmeas têm um tampão vaginal. Considere o dia em que o plugue é identificado como dia embrionário (E) 0,5.
2. Preparação de tecidos e isolamento celular
- Eutanásia de 2-6 meses de idade fêmea prenhe C57BL/6J no dia 9,5 pós-concepção via CO2 com uma concentração crescente seguida de luxação cervical. Limpe a parte inferior do abdômen com etanol 70%.
NOTA: O uso de anestésicos antes da luxação cervical não é recomendado, pois exporia os embriões a alterações ambientais que poderiam afetar estudos transcriptômicos e epigenômicos subsequentes. - Abra o abdome e o peritônio com tesoura. Visualize os chifres uterinos e use fórceps para excisar ambos os chifres.
- Coloque os chifres em uma placa de Petri contendo meio completo frio com 1% de SFB. Embora nenhum volume específico seja necessário, deve-se tomar cuidado para garantir que os embriões estejam completamente imersos no meio. Um volume aproximado de 10 mL por placa de Petri de 10 cm é apropriado.
- Sob o estereomicroscópio regulado em aumento de 5x e usando pinças, remova o tecido endometrial, a placenta e o saco vitelínico de cada embrião.
- Coloque os embriões em uma placa de Petri com meio completo frio com FBS a 1%. Dissecar a região embrionária do coração, conforme descrito no esquema embrionário ilustrado na Figura 1, em meio completo a frio.
- Agrupe as regiões cardíacas dissecadas de cinco embriões de camundongos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrífugas de balde oscilante pré-refrigeradas a 4 °C.
- Centrifugar a 300x g por 1 min em RT em uma centrífuga de balde oscilante. Remova o sobrenadante e lave os tecidos adicionando 1 mL de PBS grau de cultura de tecido.
- Centrifugar a 300 x g por 1 min em RT. Retire o sobrenadante e repita as etapas de lavagem para um total de duas lavagens. Repetir a lavagem duas vezes, substituindo o PBS por tripsina/EDTA a 0,05% (1x).
- Para digestão dos tecidos, adicionar 50 μL de tripsina a 0,25%/EDTA por 10 min a 37 °C. Aplique dissociação mecânica suave após 5 minutos por gestos para cima e para baixo usando uma ponta de filtro de orifício largo.
- Inativar a atividade de digestão de tripsina adicionando 350 μL de meio completo às células dissociadas. Passe as células ressuspensas através de um filtro celular de 40 μm.
3. Contagem de células e avaliação da viabilidade
NOTA: A contagem de células e a viabilidade são parâmetros críticos para o sucesso de experimentos de célula única. A abordagem snATAC-seq é sensível a pequenas variações no número de células. Poucas células levam à digestão excessiva da cromatina, o que resulta em um maior número de leituras e no mapeamento de regiões de cromatina inacessíveis (ruído). Da mesma forma, ter muitas células gera fragmentos de alto peso molecular que são difíceis de sequenciar. Para a determinação precisa das concentrações celulares e nucleares, a contagem e a viabilidade celular foram avaliadas por dois métodos diferentes.
- Execute um ensaio de azul de tripano para contagem de células, conforme descrito abaixo.
- Solução corante de azul de tripano Vortex 0,4%, girar por 10 s à temperatura ambiente a 2.000 x g e transferir 10 μL para um microtubo.
- Usando uma pipeta, misture a suspensão celular e adicione 10 μL de suspensão aos 10 μL já aliquotados da solução azul de tripano. Misture cuidadosamente 10 vezes com uma pipeta.
- Transfira 10 μL das células coradas para uma lâmina de contagem. Coloque a lâmina no contador para calcular automaticamente a concentração e a viabilidade da célula.
- Realizar uma avaliação da mortalidade baseada em fluorescência, conforme descrito abaixo.
NOTA: Este ensaio baseia-se no uso de corantes fluorescentes (homodímero de etídio-1, EthD-1 e calceína AM) para avaliar a viabilidade celular. Foi utilizado um kit disponível comercialmente e foram seguidas as instruções do fornecedor para o preparo e uso adequados.- Preparar uma solução de EthD-1 de 10 μM adicionando 5 μL da solução-mãe de EthD-1 de 2 mM fornecida a 1 mL de D-PBS de grau de cultura de tecido estéril e vórtice por 5 s para garantir a mistura completa.
- Transferir 2,5 μL da solução-mãe de 4 mM de calceína AM fornecida para a solução EthD-1 já preparada. Vórtice por 5 s para garantir a mistura completa.
- Adicionar 10 μL da solução de trabalho resultante de 10 μM de EthD-1 e 10 μM de calceína AM a 10 μL de suspensão celular.
NOTA: A calceína é altamente suscetível à hidrólise em soluções aquosas, por isso use esta solução de trabalho dentro de 1 dia. - Transfira 10 μL das células coradas para uma lâmina de contagem. Insira a lâmina no contador de células fluorescentes automatizado. Conte as células vivas usando um filtro GFP e as células mortas com um filtro RFP.
NOTA: Os dois métodos de contagem forneceram contagens e viabilidade celulares semelhantes, e o número total de células recém-dissociadas foi estimado em média em torno de 20.000 células por região embrionária do coração (0,06 mm3).
4. Congelamento celular
- Centrifugar a suspensão celular a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante sem tocar no fundo do tubo e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio congelante resfriado.
- Transfira a suspensão celular para um criovial pré-resfriado e coloque o criovial em um recipiente de congelamento pré-resfriado.
- Coloque o recipiente a −80 ◦C durante 4 h a 8 h. Transferir o nitrogênio criovial para nitrogênio líquido para experimentos de sequenciamento de RNA de núcleo único e ATAC a jusante.
NOTA: O criovial deve ser transportado em gelo seco antes do uso. Em nossa experiência, as células podem ser armazenadas em nitrogênio líquido por pelo menos 6 meses sem perda de viabilidade celular. A temperatura de armazenamento deve ser mantida abaixo de -150 °C o tempo todo para evitar a formação de cristais de gelo.
5. Descongelamento celular e remoção de células mortas
- Colocar os crióvios em banho-maria a 37 °C durante 1-2 min. Removê-lo quando um pequeno cristal permanecer no criovial.
- Adicionar 1 ml de meio completo pré-aquecido (37 °C). Misture com uma pipeta três vezes. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de meio completo aquecido.
- Passe toda a suspensão da célula sobre um filtro de 30 μm. Enxaguar o filtro com 1-2 mL de meio completo morno e coletar o fluxo no mesmo tubo cônico.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o sobrenadante. Lavar uma vez com PBS e transferir a suspensão celular para um microtubo de 1,5 ml.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
- Adicionar 100 μL das microesferas magnéticas fornecidas às células peletizadas e homogeneizar cinco vezes usando uma ponta de pipeta de furo largo. Incubar por 15 min no TR.
- Enquanto isso, lave a coluna de separação magnética (capacidade: 1 x 107 a 2 x 108 células) com 500 μL de 1x tampão de ligação.
- Uma vez concluída a incubação, diluir a suspensão celular contendo as microesferas com 500 μL de tampão de ligação 1x.
- Aplicar a suspensão celular (0,6 μL) na coluna de separação magnética preparada. O flow-through é a fração de células vivas selecionadas negativamente, e a fração retida magneticamente é a célula morta positivamente selecionada.
- Recolher o efluente de células vivas num tubo de centrifugação de 15 ml. Enxaguar o microtubo de 1,5 mL que continha a suspensão celular e a coluna com 2 mL de tampão de ligação 1x e coletar o efluente no mesmo tubo de 15 mL.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
- Adicionar 1 mL da solução de PBS-BSA e misturar suavemente pipetando cinco vezes usando uma ponta de pipeta de orifício largo. Transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mL.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular.
- Adicionar 1 mL de PBS-BSA para ressuspender o pellet e repetir a etapa de lavagem para um total de duas lavagens.
- Ressuspender as células em 100 μL de solução de PBS-BSA. Misture delicadamente pipetando 10 vezes.
- Determinar a concentração e a viabilidade das células utilizando os métodos descritos anteriormente (passo 3.1 e passo 3.2). Para prosseguir para a próxima etapa, certifique-se de uma contagem de células de ≥ 100.000 células. Consulte a Figura 2 para obter resultados representativos.
NOTA: A criopreservação resulta em uma perda de aproximadamente 40% do material de partida inicial de células vivas. Dependendo do número inicial de células, a separação de esferas em uma coluna magnética resulta em alta viabilidade celular, mas divide o número total de células em duas a cinco vezes. A utilização de um kit magnético baseado em coluna para remover as células mortas é aconselhada apenas quando houver material de partida suficiente.
6. Isolamento de núcleos
NOTA: snATAC e snRNA-seq combinados são realizados com uma suspensão de núcleos limpos e intactos. Recomenda-se a otimização das condições de lise (tempo de lise e concentração de NP40) para o tipo celular utilizado. O tempo ótimo de lise e a concentração de detergente são aqueles que resultam no número máximo de células lisadas sem interromper a morfologia nuclear. A perda de células/núcleos pode ser reduzida usando uma centrífuga de balde oscilante em vez de uma centrífuga de ângulo fixo. Para minimizar a retenção de núcleos em plásticos, recomenda-se o uso de pontas de pipeta de baixa retenção e tubos de centrífuga. Isso pode aumentar a recuperação dos núcleos. O revestimento das pontas da pipeta e dos tubos da centrífuga com 5% de BSA é uma alternativa mais barata, mas mais demorada.
- Limpe o local de trabalho e os materiais com etanol 70% e solução de remoção de RNase.
- Centrífugas de balde oscilante pré-refrigeradas a 4 °C. Prepare recentemente o tampão de lise, o tampão de diluição de lise, o tampão de lise de 0,1x e o tampão de lavagem (ver Tabela 1). Mantenha os buffers no gelo.
- Centrifugar a suspensão da célula a 500 x g por 5min a 4 °C em uma centrífuga de balde oscilante. Remova suavemente todo o sobrenadante sem tocar no fundo do tubo para evitar deslocar o pellet de células.
- Adicionar 100 μL de tampão de lise 0,1x refrigerado. Misture suavemente pipetando 10 vezes. Incubar por 5 min no gelo.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem resfriado e misture delicadamente pipetando cinco vezes. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante sem interromper o pellet do núcleo.
- Repita as lavagens com tampão de lavagem refrigerado para um total de três lavagens. Preparar o tampão de núcleo diluído. Após a ressuspensão, manter a solução estoque de núcleos no gelo.
7. Avaliação da qualidade e quantidade dos núcleos isolados
NOTA: Com base na contagem inicial de células e estimando aproximadamente 50% de perda de núcleos durante a lise celular, ressuspenda o número apropriado de células em tampão de núcleos diluídos a frio. O cálculo do volume de ressuspensão com tampão de núcleo diluído refrigerado baseia-se na recuperação dos núcleos visados e nas concentrações de reserva de núcleos correspondentes recomendadas pelo guia do utilizador do fabricante. Ver um exemplo deste cálculo no Protocolo Complementar 1.
- Com base na contagem inicial de células e estimando aproximadamente 50% de perda de núcleos durante a lise celular, ressuspenda o número apropriado de células em tampão de núcleo diluído a frio.
- Determine a concentração real dos núcleos. Misturar 2 μL de solução-mãe de núcleos com 8 μL de tampão de núcleos diluído e adicionar a mistura aos 10 μL pré-aliquotados de azul de tripano ou solução de trabalho EthD-1/calceínaAM. Conte os núcleos usando um contador de células automatizado. Menos de 5% das células devem ser viáveis. Consulte a Figura 3 para obter resultados representativos.
- Calcular o volume de reservas de núcleos e o volume de tampão de núcleos diluídos para obter um volume total de 5 μL na concentração recomendada para a reação de transposição (consulte o guia do usuário do fabricante). Proceder imediatamente à reação de transposição de acordo com o guia do usuário17.
OBS: Todas as etapas desde a reação de transposição até a construção das bibliotecas ATAC e GEX foram realizadas de acordo com o guia do usuário do kit utilizado para snRNA-seq e snATAC-seqcombinados17.
8. Análise da qualidade das bibliotecas snRNA-seq e snATAC-seq
- Antes de proceder ao sequenciamento de próxima geração, valide a qualidade e a distribuição de tamanho das bibliotecas finais snATAC-seq e GEX de expressão gênica. Avaliar a qualidade e quantidade de sequências identificadas nas bibliotecas utilizando sistemas de análise de fragmentos. Consulte a Figura 4 para obter resultados representativos da avaliação da qualidade.
NOTA: O traço final das bibliotecas snATAC-seq deve mostrar a periodicidade do enrolamento nucleossomo, e os tamanhos devem variar de 200 pb a vários Kbp, enquanto os tamanhos na biblioteca de expressão gênica devem variar de 300 pb a 600 pb.
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Representative Results
Em comparação com a preparação de suspensões de célula única para abordagens de célula única, a preparação de suspensões de núcleo único é muito mais desafiadora e requer um maior grau de resolução e processamento. O fator chave para o sucesso da combinação combinada de snRNA-seq e snATAC-seq é uma suspensão de núcleos limpa e intacta. O protocolo para isolamento eficiente dos núcleos deve ser adaptado a cada tipo e condição de tecido (fresco ou congelado). Aqui, um protocolo otimizado é descrito para o isolamento de núcleos de células cardíacas embrionárias de camundongos congeladas. Todas as etapas desde a dissecção da região cardíaca embrionária e dissociação das células cardíacas até o isolamento dos núcleos estão resumidas na Figura 1. Para o material de partida, uma contagem de células de 1 x 105-1 x 106 células e uma viabilidade celular >70% são recomendadas para o isolamento eficiente dos núcleos. Como mostrado na Figura 2, a etapa adicional realizada neste protocolo para classificar e remover as células mortas após o descongelamento permitiu obter uma suspensão celular mais limpa com uma viabilidade celular significativamente maior e melhorar a qualidade da amostra inicial. Além do isolamento dos núcleos, esse protocolo fornece informações detalhadas sobre como avaliar a qualidade e a quantidade dos núcleos isolados (Figura 3). A qualidade dos núcleos isolados afeta grandemente a qualidade dos dados combinados snRNA-seq e snATAC-seq; Aqui, a qualidade dos núcleos isolados foi avaliada pela avaliação da morfologia da membrana nuclear. Os núcleos isolados apresentaram-se lisos e uniformemente redondos, como mostra a Figura 3C, sob microscopia de campo claro, indicando um processo de isolamento efetivo. Para maior precisão, dois diferentes métodos de contagem foram usados, incluindo azul de tripano e um kit para a avaliação de viabilidade baseada em fluorescência, para quantificar as células e núcleos. O ensaio de fluorescência foi utilizado para determinar a viabilidade celular com base na integridade celular e atividade da esterase intracelular. Esta solução corante permite distinguir células vivas de células mortas, visualizando simultaneamente calceína AM fluorescente verde, que indica a atividade esterase intracelular, e homodímero etídio fluorescente vermelho 1, que reflete a perda da integridade celular. O uso de um corante fluorescente para contagem ajuda a distinguir núcleos de aglomerados celulares e detritos. Usando este protocolo, a viabilidade celular passou de 80%-90% antes do isolamento dos núcleos para <5% após o isolamento dos núcleos, como mostrado na Figura 3A,B.
Nosso procedimento foi comparado ao método existente, que envolve o congelamento do tecido fresco diretamente em nitrogênio líquido e a realização da etapa de lise sem dissociação enzimática prévia (Protocolo Suplementar 2 e Figura Suplementar 1). Ambas as abordagens foram testadas para determinar qual método proporciona uma suspensão de núcleos de melhor qualidade. O congelamento do tecido cardíaco embrionário total deu origem a uma alta porcentagem de células não lisadas detectadas como vivas, indicando lise celular inadequada (Figura 1A suplementar). Agregados e células não individuais foram observados apesar da filtração através de filtros (Figura 1A,B Suplementar).
Os núcleos isolados foram usados para gerar bibliotecas para snATAC-seq e snRNA-seq conjuntos. A Figura 4 ilustra os resultados do controle de qualidade do cDNA utilizado para a construção da biblioteca de expressão gênica (GEX) e da biblioteca ATAC. O controle de qualidade foi realizado por eletroforese automatizada (Figura 5A). Os cDNAs derivados do RNAm foram quantificados, e o rendimento foi suficiente para uso subsequente na construção da biblioteca GEX. Uma biblioteca GEX de alta qualidade variando de ~300 pb a 600 pb e uma biblioteca ATAC de alta qualidade com enrolamento nucleossomal periódico variando de 200 pb a 7 kbp foram obtidas. Essas bibliotecas foram sequenciadas por sequenciamento de alto rendimento e geraram com sucesso a expressão gênica de núcleo único e acessibilidade à cromatina (Figura 5A). Esses dados brutos estavam prontos para serem desmultiplexados e analisados bioinformaticamente para gerar perfis transcricionais e epigenéticos de células progenitoras cardíacas E9.5 de camundongos. SnRNA-seq e snATAC-seq foram agrupados, identificados e marcados com base em genes marcadores conhecidos usando agrupamento não supervisionado com a ferramenta Seurat para genômica única24 . Essa análise inicial confirmou a presença de todos os tipos de células cardíacas esperadas no E9.5 (Figura 5B).
Todos os resultados acima suportam o sucesso deste protocolo em isolar núcleos que são adequados para abordagens de núcleos únicos a jusante de células cardíacas embrionárias congeladas.
Figura 1: Representação das principais etapas na preparação da amostra para o perfil combinado snRNA-seq e snATAC-seq. Este fluxograma recapitula todas as etapas, incluindo dissecção do tecido cardíaco e dissociação de células cardíacas, congelamento e descongelamento celular, purificação de células vivas pela remoção de células mortas e isolamento de núcleos, que são realizados para a detecção simultânea de acesso de RNAm e cromatina a partir da mesma célula. Abreviações: PBS = solução salina tamponada com fosfato; BSA = albumina de soro bovino; TR = temperatura ambiente. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Viabilidade das células descongeladas otimizadas após a triagem das células mortas. Imagens mostrando a contagem e viabilidade de células usando um contador de células automatizado antes (superior) e depois (inferior) da remoção de células mortas usando o corante de exclusão azul de tripano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Controle de qualidade da preparação dos núcleos. (A,B) Imagens mostrando a contagem e viabilidade de células usando um contador de células automatizado antes (superior) e após (abaixo) isolamento dos núcleos. Dois métodos de contagem foram utilizados: (A) o ensaio de mortalidade fluorescente e (B) o ensaio do azul de tripano. (C) Imagens mostrando a qualidade do isolamento dos núcleos. As imagens foram obtidas a 20x (barra de escala = 50 μm) usando microscopia de campo claro e fluorescência. A imagem de campo claro (à esquerda) mostra morfologia nuclear; o RFP (meio) mostra células que perderam sua integridade membrana, ou seja, núcleos isolados; e a GFP (direita) que normalmente indica a atividade esterase de células vivas aqui confirma a ausência de células vivas na suspensão dos núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Controle de qualidade da expressão gênica unicelular e bibliotecas ATAC. Análise de DNA com eletroforese automatizada mostrando a qualidade e distribuição de tamanho do cDNA (parte superior), biblioteca GEX (meio) e biblioteca ATAC (abaixo). Para a quantificação do cDNA, a zona variando de 200 pb a 8.900 pb foi selecionada, e o bioanalisador estimou a concentração de cDNA (em pg/μL; círculo vermelho). Um rendimento de cDNA suficiente foi obtido para prosseguir com a construção da biblioteca GEX. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Desempenho amostral avaliado com o software Cell Ranger25. (A) Gráfico de sensibilidade cruzada mostrando os eventos de transposição em picos por código de barras no eixo x e identificadores moleculares únicos (UMIs) de RNA por código de barras no eixo y. Como esperado, as células estão localizadas principalmente no canto superior direito, com dados elevados de RNA e ATAC. Uma clara separação entre as células e não-células (GEMs vazias, sinal de fundo) foi observada. (B) Gráfico representativo de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) de todas as células capturadas em scRNA-seq (esquerda) e scATAC-seq (direita) coloridas por identidade de cluster e agrupadas com base nos tipos celulares. Observou-se boa separação dos agrupamentos. Os dados brutos das articulações GEX e ATAC foram obtidos a partir do sequenciamento de 7.000 núcleos da região cardíaca embrionária de camundongos E9.5 dissecada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Controle de qualidade do isolamento de núcleos a partir do método existente envolvendo o congelamento de tecidos frescos diretamente em nitrogênio líquido. (A) Imagens mostrando a contagem de núcleos isolados utilizando contador automático de células e azul de tripano como corante de exclusão antes (superior) e após (inferior) filtração através de filtro de 40 μm. Uma alta porcentagem de células não lisadas foi detectada como viva. A detecção de 20% de células vivas indica lise celular inadequada. As setas pretas indicam agregados. (B) Imagens mostrando a qualidade dos núcleos isolados. As imagens foram obtidas a 20x (superior e médio com barra de escala de 50 μm) e 40x (inferior com barra de escala de 25 μm) utilizando microscopia de campo claro e fluorescência. A imagem de campo claro (esquerda) mostra a morfologia nuclear; o RFP (à direita) mostra células que perderam sua integridade de membrana, ou seja, núcleos isolados. As setas pretas indicam múltiplos de núcleos ligados por detritos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 1: Tabela de buffers e soluções utilizadas no procedimento. Clique aqui para baixar esta tabela.
Protocolo Suplementar 1: Avaliação da quantidade de núcleos isolados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Protocolo Suplementar 2: Isolamento de núcleos de tecido congelado por flash. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A análise da composição celular do coração em desenvolvimento por meio de estudos combinados de snRNA-seq e snATAC-seq fornece uma compreensão mais profunda da origem da cardiopatiacongênita26. Vários laboratórios de pesquisa têm estudado os efeitos da criopreservação de tecido cardíaco no snRNA-seq27. A condução de snRNA-seq e snATAC-seq usando tecido fresco microdissecado de modelos murinos de doença humana pode ser logisticamente desafiadora quando se comparam diferentes condições experimentais. Para um determinado estágio de desenvolvimento, uma dificuldade é que os grupos controle e experimental devem ser processados na mesma corrida para reduzir a variabilidade técnica introduzida pelo processamento das amostras. Quando o processamento de tecido fresco não é possível, recomenda-se, com base em nossos resultados, dissociar e, em seguida, criopreservar em vez de congelar todo o tecido cardíaco embrionário. A escolha de um método em detrimento do outro baseia-se no fato de que, se o tecido cardíaco estiver inteiro congelado, isolar células únicas viáveis após o descongelamento é muito mais desafiador. No entanto, se o protocolo de dissociação tecidual não for otimizado, então pode ser melhor congelar o tecido inteiro. A dissociação seguida de criopreservação é preferida, uma vez que este protocolo de dissociação tecidual produz >90% de células viáveis frescas sem viés de tipo celular.
Essa abordagem apresenta vários benefícios, como o uso de células congeladas, que elimina a necessidade de tecido fresco, e o uso de uma etapa de dissociação unicelular, que permite o isolamento de núcleos únicos intactos; na verdade, isso é crítico para a análise de célula única a jusante. Entretanto, a dissociação enzimática pode induzir viés transcricional em populações celulares. A dissociação enzimática celular interfere no microambiente celular e, assim, induz alterações transcricionais na maioria dos tipos celulares28. O principal determinante dessas alterações é o tempo de dissociação, e não o tipo celular29. Para moderar artefatos induzidos por dissociação é importante seguir o tempo de digestão recomendado. A literatura publicada em diversos tecidos indica que um tempo de digestão de 30 min ou menos induz pequenas alterações transcricionais28,30. Além disso, intervenções de bioinformática poderiam ser utilizadas para minimizar as distorções dos dados31,32.
A obtenção de núcleos únicos puros e intactos é o fator mais importante na genômica de núcleo único. O entupimento das câmaras microfluídicas de plataformas unicelulares devido à presença de aglomerados celulares ou detritos orgânicos leva à baixa qualidade dos dados ou, mais problemáticamente, à falha experimental. Nesse procedimento, os protocolos existentes foram modificados pela combinação de dissociação enzimática, criopreservação e purificação de células progenitoras cardíacas viáveis. Nosso procedimento permite o isolamento de núcleos puros sem a necessidade de triagem FACS. Usando este procedimento, obtivemos uma suspensão nuclear de alta qualidade sem aglomeração, quase sem detritos e núcleos únicos intactos. A etapa de isolamento celular é crucial para evitar possíveis aglomerações de núcleos; De fato, isso pode ser evitado por pipetagem suave usando pontas de pipeta grandes ou filtrando os núcleos. O uso de filtros em diferentes etapas e a posterior observação ao microscópio de luz podem prevenir tais problemas.
O protocolo aqui descrito foi utilizado com sucesso para o perfil de snRNA-seq e snATAC-seq a partir da mesma preparação de núcleos obtida de células progenitoras cardíacas E9.5. Este método pode ser usado em camundongos selvagens prenhes versus modelos de camundongos para defeitos cardíacos congênitos. Defeitos cardíacos congênitos provavelmente ocorrem devido ao rompimento de vias que controlam a diferenciação, multiplicação, migração e sobrevivência das células progenitoras cardíacas33,34. Para melhor entender a origem desses defeitos, este estudo focou especificamente no estágio embrionário 9.5, no qual estão presentes os progenitores das principais áreas acometidas nas cardiopatias congênitas, em especial os progenitores cardíacos do segundo campocardíaco11 e da cristaneural35. A aplicação deste procedimento às células do coração de camundongo adulto e do coração humano requer a otimização do protocolo, particularmente em termos das etapas de dissociação e lise celular.
As principais considerações entre a contagem manual e automatizada de células são os custos, a mão de obra e a precisão. Contadores automatizados são mais rápidos do que a maioria dos cientistas qualificados que realizam uma contagem manual. Especialmente quando se trata de um grande número de amostras, é de grande benefício poder simplesmente pressionar a contagem e visualizar o resultado. Esse é um ponto importante, pois uma vez isolados os núcleos, eles devem ser processados rapidamente para evitar a perda de sua integridade. O principal benefício de precisão dos sistemas automatizados é que esses sistemas eliminam a variabilidade entre usuários ou laboratórios. Outra vantagem é que os sistemas automatizados normalmente têm um campo de visão maior do que os hemocitômetros. Quando o número de células/núcleos ou a concentração das células/núcleos são menores, esse campo de visão maior é certamente uma vantagem em relação ao método manual tradicional.
Uma alta porcentagem de contaminação do DNA mitocondrial pode ser observada quando a concentração do detergente não iônico é muito alta. Ao diminuir sua concentração no tampão de lise, essa contaminação pode ser reduzida sem diminuir o rendimento dos núcleos. Os resultados mais satisfatórios foram obtidos em nossos experimentos com tampão de lise contendo detergente a 0,1%. Girar os núcleos em um balde de balanço também pode reduzir o número de mitocôndrias no pellet.
Ter uma proporção adequada de Tn5 transposase para núcleos é crucial para o sucesso do snATAC-seq13,14. Por exemplo, ter muito Tn5 pode levar a um fundo alto devido à cromatina fechada e à baixa complexidade das bibliotecas de sequenciamento, enquanto a sublise pode não resultar em uma biblioteca amplificada por PCR completa13. Para determinar o número de núcleos com precisão, foram utilizados dois métodos complementares.
Conjuntos de dados ômicos multimodais oferecem a oportunidade de investigar múltiplos níveis de organização genômica simultaneamente 9,36. A abordagem multimodal conjunta de RNA e ATAC permite o estudo de reguladores a montante e genes metabólicos a jusante e fornece uma abordagem abrangente para o estudo de redes transcricionais e arquitetura de cromatina no contexto do desenvolvimento cardíaco na resolução de célula única. Este protocolo para isolamento de núcleos únicos é compatível com a avaliação individual e conjunta de conjuntos de dados de expressão e cromatina. A acessibilidade da cromatina é um importante nível epigenético de regulação, pois possibilita a atividade de reguladores transcricionais em sítios genômicos específicos8,9,10,11,12,13. Uma infinidade de informações sobre a identidade e os locais alvo de dezenas de possíveis fatores de transcrição são, portanto, fornecidas pela sequência de DNA no perfil da cromatina. A comparação das informações obtidas pelo snATAC-seq com o perfil de expressão do snRNA pode ajudar a identificar os fatores de transcrição mais relevantes, que podem ser posteriormente analisados por Cut&Run37. Esperamos que este procedimento ajude os pesquisadores interessados e os encoraje a usar este poderoso método em suas pesquisas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 para SS. Agradecemos ao centro de Genômica e Bioinformática (GBiM) do laboratório U 1251/Marseille Medical Genetics e aos revisores anônimos por fornecerem comentários valiosos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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