Summary
Nous présentons ici un protocole décrivant la préparation des noyaux cellulaires. Après la microdissection et la dissociation enzymatique du tissu cardiaque en cellules individuelles, les cellules progénitrices ont été congelées, suivies de l’isolement de cellules viables pures, qui ont été utilisées pour le séquençage de l’ARN mononucléaire et le test mononucléique pour la chromatine accessible à la transposase avec des analyses de séquençage à haut débit.
Abstract
Le cœur en développement est une structure complexe contenant diverses cellules progénitrices contrôlées par des mécanismes de régulation complexes. L’examen de l’expression génique et de l’état de chromatine des cellules individuelles permet d’identifier le type et l’état cellulaire. Les approches de séquençage unicellulaire ont révélé un certain nombre de caractéristiques importantes de l’hétérogénéité des cellules progénitrices cardiaques. Cependant, ces méthodes sont généralement limitées aux tissus frais, ce qui limite les études avec diverses conditions expérimentales, car les tissus frais doivent être traités immédiatement dans le même cycle pour réduire la variabilité technique. Par conséquent, des procédures simples et flexibles pour produire des données à partir de méthodes telles que le séquençage de l’ARN mononucléal (snRNA-seq) et le test mononucléal pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) sont nécessaires dans ce domaine. Ici, nous présentons un protocole pour isoler rapidement les noyaux pour les dual-omiques à noyaux simples suivants (snRNA-seq combiné et snATAC-seq). Cette méthode permet d’isoler des noyaux à partir d’échantillons congelés de cellules progénitrices cardiaques et peut être combinée avec des plates-formes utilisant des chambres microfluidiques.
Introduction
Parmi les malformations congénitales, les cardiopathies congénitales (CHD) sont les plus fréquentes, survenant dans environ 1% des naissances vivantes chaque année 1,2. Les mutations génétiques ne sont identifiées que dans une minorité de cas, ce qui implique que d’autres causes, telles que des anomalies dans la régulation des gènes, sont impliquées dans l’étiologie de la coronaropathie 2,3. Le développement cardiaque est un processus complexe de types cellulaires divers et en interaction, ce qui rend difficile l’identification des mutations causales non codantes et de leurs effets sur la régulation des gènes. L’organogenèse du cœur commence par des progéniteurs cellulaires qui donnent naissance à différents sous-types de cellules cardiaques, notamment les cellules myocardiques, fibroblastiques, épicardiques et endocardiques 4,5. La génomique unicellulaire est en train de devenir une méthode clé pour étudier le développement cardiaque et évaluer l’impact de l’hétérogénéité cellulaire sur la santé et la maladie6. Le développement de méthodes multi-omiques pour la mesure simultanée de différents paramètres et l’expansion des pipelines de calcul a facilité la découverte de types et de sous-types cellulaires dans le cœur normal et malade6. Cet article décrit un protocole fiable d’isolement mononucléaire pour les cellules progénitrices cardiaques congelées obtenues à partir d’embryons de souris qui est compatible avec le snRNA-seq et le snATAC-seq en aval (ainsi qu’avec snRNA-seq et snATAC-seq combinés)7,8,9.
ATAC-seq est une méthode robuste qui permet l’identification des régions chromatiques ouvertes régulatrices et le positionnement des nucléosomes10,11. Cette information est utilisée pour tirer des conclusions sur l’emplacement, l’identité et l’activité des facteurs de transcription. L’activité des facteurs de chromatine, y compris les remodeurs, ainsi que l’activité transcriptionnelle de l’ARN polymérase, peuvent donc être analysées car la méthode est très sensible pour mesurer les changements quantitatifs de la structure de la chromatine 1,2. Ainsi, ATAC-seq fournit une approche robuste et impartiale pour découvrir les mécanismes contrôlant la régulation transcriptionnelle dans un type de cellule spécifique. Les protocoles ATAC-seq ont également été validés pour mesurer l’accessibilité de la chromatine dans des cellules individuelles, révélant une variabilité dans l’architecture de la chromatine au sein des populations cellulaires10,12,13.
Bien qu’il y ait eu des progrès notables dans le domaine des cellules individuelles ces dernières années, la principale difficulté est le traitement des échantillons frais nécessaires à la réalisation de ces expériences14. Pour contourner cette difficulté, divers tests ont été réalisés dans le but de réaliser des analyses telles que snRNA-seq et snATAC-seq avec du tissu cardiaque congelé ou des cellules15,16.
Plusieurs plateformes ont été utilisées pour analyser les données génomiques unicellulaires17. Les plateformes largement utilisées pour l’expression génique unicellulaire et le profilage ATAC sont des plateformes pour l’encapsulation de gouttelettes microfluidiques multiples17. Comme ces plates-formes utilisent des chambres microfluidiques, les débris ou les agrégats peuvent obstruer le système, ce qui rend les données inutilisables. Ainsi, le succès des études unicellulaires dépend de l’isolement précis des cellules/noyaux individuels.
Le protocole présenté ici utilise une approche similaire aux études récentes utilisant snRNA-seq et snATAC-seq pour comprendre les malformations cardiaques congénitales 18,19,20,21,22,23. Cette procédure utilise la dissociation enzymatique de tissus cardiaques fraîchement microdisséqués suivie de la cryoconservation de cellules progénitrices cardiaques de souris. Après décongélation, les cellules viables sont purifiées et traitées pour l’isolement nucléaire. Dans ce travail, ce protocole a été utilisé avec succès pour obtenir des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation nucléaire de cellules progénitrices cardiaques de souris.
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Protocol
La procédure animale adoptée dans cette étude a été approuvée par les comités d’éthique animale de l’Université d’Aix-Marseille (C2EA-14) et a été réalisée selon des protocoles approuvés par le comité national d’éthique de l’expérimentation animale (Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ; Autorisation Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Mise en place de l’accouplement programmé avant la dissection
- Pour générer des embryons de souris, effectuez un accouplement chronométré entre souris adultes 9,5 jours avant l’isolement de la région cardiaque. Dans cette procédure, des souris C57BL / 6J de type sauvage âgées de 2 à 6 mois ont été utilisées et un accouplement chronométré a été effectué pendant la nuit.
- Le lendemain matin, vérifiez si les souris femelles ont un plug vaginal. Considérez le jour où le bouchon est identifié comme jour embryonnaire (E) 0,5.
2. Préparation tissulaire et isolement cellulaire
- Euthanasier une femelle enceinte de 2 à 6 mois C57BL/6J au jour 9,5 après la conception via CO2 avec une concentration croissante suivie d’une luxation cervicale. Nettoyez la partie inférieure de l’abdomen avec de l’éthanol à 70%.
REMARQUE : L’utilisation d’anesthésiques avant la luxation cervicale n’est pas recommandée, car cela exposerait les embryons à des changements environnementaux qui pourraient avoir une incidence sur les études transcriptomiques et épigénomiques ultérieures. - Ouvrez l’abdomen et le péritoine avec des ciseaux. Visualisez les cornes utérines et utilisez des forceps pour exciser les deux cornes.
- Placer les cornes dans une boîte de Petri contenant un milieu complet froid avec 1% FBS. Bien qu’aucun volume spécifique ne soit requis, il faut veiller à ce que les embryons soient complètement immergés dans le milieu. Un volume approximatif de 10 mL par boîte de Petri de 10 cm est approprié.
- Sous le stéréomicroscope réglé à un grossissement de 5x et à l’aide de forceps, retirez le tissu endométrial, le placenta et le sac vitellin de chaque embryon.
- Placer les embryons dans une boîte de Petri avec un milieu complet froid avec 1% FBS. Disséquer la région du cœur embryonnaire, telle que décrite sur l’embryon schématique illustré à la figure 1, dans un milieu complet froid.
- Regrouper les régions cardiaques disséquées à partir de cinq embryons de souris dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifugeuses à godet oscillant avant le refroidissement à 4 °C.
- Centrifuger à 300x g pendant 1 min à TA dans une centrifugeuse à godet oscillant. Retirez le surnageant et lavez les mouchoirs en ajoutant 1 mL de PBS de qualité culture tissulaire.
- Centrifuger à 300 x g pendant 1 min à TA. Retirez le surnageant et répétez les étapes de lavage pour un total de deux lavages. Répétez le lavage deux fois, en remplaçant le PBS par 0,05% de trypsine/EDTA (1x).
- Pour la digestion des tissus, ajouter 50 μL de trypsine/EDTA à 0,25 % pendant 10 min à 37 °C. Appliquer une dissociation mécanique douce après 5 min par des gestes de haut en bas à l’aide d’une pointe filtrante à large orifice.
- Inactiver l’activité de digestion de la trypsine en ajoutant 350 μL de milieu complet aux cellules dissociées. Faire passer les cellules remises en suspension à travers une crépine cellulaire de 40 μm.
3. Comptage des cellules et évaluation de la viabilité
REMARQUE : Le nombre de cellules et la viabilité sont des paramètres essentiels au succès des expériences sur une seule cellule. L’approche snATAC-seq est sensible aux variations mineures du nombre de cellules. Trop peu de cellules conduisent à une sur-digestion de la chromatine, ce qui entraîne un nombre plus élevé de lectures et la cartographie des régions de chromatine inaccessibles (bruit). De même, avoir trop de cellules génère des fragments de poids moléculaire élevé qui sont difficiles à séquencer. Pour la détermination précise des concentrations de cellules et de noyaux, le nombre de cellules et la viabilité ont été évalués par deux méthodes différentes.
- Effectuer un test de trypan bleu pour le comptage cellulaire, comme décrit ci-dessous.
- Solution de coloration au bleu trypan à 0,4 % de vortex, faire tourner pendant 10 s à température ambiante à 2 000 x g et transférer 10 μL dans un microtube.
- À l’aide d’une pipette, mélanger la suspension cellulaire et ajouter 10 μL de suspension aux 10 μL déjà aliquotes de solution de bleu de trypan. Mélanger soigneusement 10 fois à la pipette.
- Transférer 10 μL des cellules colorées dans une lame de comptage. Placez la lame dans le compteur pour calculer automatiquement la concentration et la viabilité de la cellule.
- Effectuer une évaluation de la mortalité basée sur la fluorescence comme décrit ci-dessous.
REMARQUE : Ce test est basé sur l’utilisation de colorants fluorescents (éthidium homodimère-1, EthD-1 et calcéine AM) pour évaluer la viabilité cellulaire. Une trousse disponible dans le commerce a été utilisée et les instructions du fournisseur ont été suivies pour la préparation et l’utilisation appropriées.- Préparer une solution mère d’EthD-1 de 10 μM en ajoutant 5 μL de la solution mère d’EthD-1 de 2 mM fournie à 1 mL de D-PBS de culture tissulaire stérile et vortex pendant 5 s pour assurer un mélange complet.
- Transférer 2,5 μL de la solution mère de calcéine AM à 4 mM fournie à la solution d’EthD-1 déjà préparée. Vortex pendant 5 s pour assurer un mélange complet.
- Ajouter 10 μL de la solution de travail résultant de 10 μM EthD-1 et 10 μM de calcéine AM à 10 μL de suspension cellulaire.
REMARQUE: La calcéine est très sensible à l’hydrolyse dans les solutions aqueuses, alors utilisez cette solution de travail dans 1 jour. - Transférer 10 μL des cellules colorées sur une lame de comptage. Insérez la lame dans le compteur automatisé de cellules fluorescentes. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un filtre GFP et les cellules mortes avec un filtre RFP.
REMARQUE: Les deux méthodes de comptage ont donné un nombre de cellules et une viabilité similaires, et le nombre total de cellules fraîchement dissociées a été estimé en moyenne à environ 20 000 cellules par région cardiaque embryonnaire (0,06 mm3).
4. Congélation cellulaire
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer délicatement le surnageant sans toucher le fond du tube et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de congélation réfrigéré.
- Transférer la suspension cellulaire dans un cryovial pré-refroidi et placer le cryovial dans un récipient de congélation pré-refroidi.
- Placer le récipient à −80 ◦C pendant 4 h à 8 h. Transférer le cryovial à l’azote liquide pour des expériences de séquençage de l’ARN mononoyau et de l’ATAC en aval.
NOTE: Le cryovial doit être transporté sur de la glace sèche avant utilisation. D’après notre expérience, les cellules peuvent être stockées dans de l’azote liquide pendant au moins 6 mois sans perte de viabilité cellulaire. La température de stockage doit être maintenue en dessous de −150 °C en tout temps pour éviter la formation de cristaux de glace.
5. Décongélation cellulaire et élimination des cellules mortes
- Placer les cryoflacons dans un bain-marie à 37 °C pendant 1-2 min. Retirez-le lorsqu’il reste un minuscule cristal dans le cryovial.
- Ajouter 1 mL de milieu complet préchauffé (37 °C). Mélanger trois fois à la pipette. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu complet chaud.
- Passez toute la suspension cellulaire sur une crépine de 30 μm. Rincer la passoire avec 1-2 mL de milieu complet chaud et recueillir l’écoulement dans le même tube conique.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, et enlever le surnageant. Laver une fois avec du PBS et transférer la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 mL.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, et retirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
- Ajouter 100 μL des microbilles magnétiques fournies aux cellules granulées et homogénéiser cinq fois à l’aide d’une pointe de pipette de grand calibre. Incuber pendant 15 min à TA.
- En attendant, rincez la colonne de séparation magnétique (capacité : 1 x 107 à 2 x 108 cellules) avec 500 μL de tampon de liaison 1x.
- Une fois l’incubation terminée, diluer la suspension cellulaire contenant les microbilles avec 500 μL de tampon de liaison 1x.
- Appliquez la suspension cellulaire (0,6 μL) sur la colonne de séparation magnétique préparée. Le flux continu est la fraction de cellules vivantes sélectionnée négativement, et la fraction magnétiquement retenue est les cellules mortes sélectionnées positivement.
- Recueillir l’effluent de cellules vivantes dans un tube à centrifuger de 15 mL. Rincer le microtube de 1,5 mL qui contenait la suspension cellulaire et la colonne avec 2 mL de tampon de liaison 1x, et recueillir l’effluent dans le même tube de 15 mL.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
- Ajouter 1 mL de la solution PBS-BSA et mélanger doucement en pipetant cinq fois à l’aide d’un embout de pipette à large orifice. Transférer la suspension cellulaire dans un microtube de 1,5 mL.
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
- Ajouter 1 mL de PBS-BSA pour remettre en suspension la pastille et répéter l’étape de lavage pour un total de deux lavages.
- Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de solution PBS-BSA. Mélanger doucement en pipetant 10 fois.
- Déterminer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide des méthodes décrites précédemment (étape 3.1 et étape 3.2). Pour passer à l’étape suivante, assurez-vous d’un nombre de cellules de ≥ 100 000 cellules. Voir la figure 2 pour des résultats représentatifs.
NOTE: La cryoconservation entraîne une perte d’environ 40% du matériel de départ initial des cellules vivantes. Selon le nombre de cellules de départ, la séparation des billes sur une colonne magnétique entraîne une viabilité cellulaire élevée, mais divise le nombre total de cellules par deux à cinq fois. L’utilisation d’un kit magnétique à colonne pour éliminer les cellules mortes n’est conseillée que lorsque suffisamment de matières premières sont disponibles.
6. Isolement des noyaux
REMARQUE: snATAC et snRNA-seq combinés sont réalisés avec une suspension de noyaux propres et intacts. L’optimisation des conditions de lyse (temps de lyse et concentration de NP40) pour le type de cellule utilisé est recommandée. Le point temporel optimal de lyse et la concentration de détergent sont ceux qui permettent de lyser le maximum de cellules sans perturber la morphologie nucléaire. La perte de cellules/noyaux peut être réduite en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant au lieu d’une centrifugeuse à angle fixe. Pour minimiser la rétention des noyaux sur les plastiques, il est recommandé d’utiliser des pointes de pipettes à faible rétention et des tubes de centrifugation. Cela peut augmenter la récupération des noyaux. Le revêtement des embouts de pipettes et des tubes de centrifugation avec 5% de BSA est une alternative moins coûteuse mais plus longue.
- Nettoyez le lieu de travail et les matériaux avec de l’éthanol à 70% et une solution d’élimination de la RNase.
- Centrifugeuses à godet oscillant avant le refroidissement à 4 °C. Préparer fraîchement le tampon de lyse, le tampon de dilution de lyse, le tampon de lyse 0,1x et le tampon de lavage (voir tableau 1). Maintenez les tampons sur la glace.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 500 x g pendant 5min à 4 °C dans une centrifugeuse à godet pivotant. Retirez délicatement tout le surnageant sans toucher le fond du tube pour éviter de déloger la pastille de cellule.
- Ajouter 100 μL de tampon de lyse 0,1x refroidi. Mélanger doucement en pipetant 10 fois. Incuber pendant 5 min sur la glace.
- Ajouter 1 ml de tampon de lavage réfrigéré et mélanger délicatement en pipetant cinq fois. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant sans perturber la pastille de noyaux.
- Répétez les lavages avec un tampon de lavage réfrigéré pour un total de trois lavages. Préparer le tampon des noyaux dilués. Après la remise en suspension, conserver la solution mère de noyaux sur de la glace.
7. Évaluation de la qualité et de la quantité des noyaux isolés
REMARQUE : Sur la base du nombre initial de cellules et en estimant la perte de noyaux d’environ 50 % pendant la lyse cellulaire, remettre en suspension le nombre approprié de cellules dans un tampon de noyaux dilués à froid. Le calcul du volume de remise en suspension avec un tampon de noyaux dilués réfrigérés est basé sur la récupération ciblée des noyaux et les concentrations de noyaux correspondantes recommandées par le guide de l’utilisateur du fabricant. Voir un exemple de ce calcul dans le protocole additionnel n° 1.
- Sur la base du nombre initial de cellules et en estimant environ 50% de perte de noyaux pendant la lyse cellulaire, remettre en suspension le nombre approprié de cellules dans un tampon de noyaux dilués à froid.
- Déterminer la concentration réelle des noyaux. Mélanger 2 μL de solution mère de noyaux avec 8 μL de tampon de noyaux dilué et ajouter le mélange à la solution de travail pré-aliquote de 10 μL de bleu de trypan ou d’EthD-1/calceinAM. Comptez les noyaux à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Moins de 5% des cellules devraient être viables. Voir la figure 3 pour des résultats représentatifs.
- Calculer le volume du stock de noyaux et le volume du tampon de noyaux dilués pour obtenir un volume total de 5 μL à la concentration recommandée pour la réaction de transposition (voir le guide de l’utilisateur du fabricant). Procéder immédiatement à la réaction de transposition conformément au guide d’utilisation17.
NOTE: Toutes les étapes de la réaction de transposition à la construction des bibliothèques ATAC et GEX ont été effectuées conformément au guide de l’utilisateur du kit utilisé pour snRNA-seq et snATAC-seq combinés17.
8. Analyse de la qualité des bibliothèques snRNA-seq et snATAC-seq
- Avant de passer au séquençage de nouvelle génération, validez la qualité et la distribution de taille des bibliothèques finales snATAC-seq et GEX d’expression génique. Évaluer la qualité et la quantité des séquences identifiées dans les bibliothèques à l’aide de systèmes d’analyse de fragments. Voir la figure 4 pour des résultats représentatifs de l’évaluation de la qualité.
NOTE: La trace finale des bibliothèques snATAC-seq devrait montrer la périodicité de l’enroulement des nucléosomes, et les tailles devraient aller de 200 bp à plusieurs Kbp, tandis que les tailles dans la bibliothèque d’expression génique devraient aller de 300 bp à 600 bp.
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Representative Results
Par rapport à la préparation de suspensions unicellulaires pour les approches unicellulaires, la préparation de suspensions mononucléiformes est beaucoup plus difficile et nécessite un degré plus élevé de résolution et de traitement. Le facteur clé du succès combiné snRNA-seq et snATAC-seq est une suspension de noyaux propre et intacte. Le protocole pour une isolation efficace des noyaux doit être adapté à chaque type de tissu et à chaque condition (frais ou congelé). Ici, un protocole optimisé est décrit pour l’isolement des noyaux à partir de cellules cardiaques embryonnaires de souris congelées. Toutes les étapes de la dissection de la région cardiaque embryonnaire et de la dissociation des cellules cardiaques à l’isolement du noyau sont résumées à la figure 1. Pour la matière première, un nombre de cellules de 1 x 105-1 x 106 cellules et une viabilité cellulaire de >70% sont recommandés pour une isolation efficace des noyaux. Comme le montre la figure 2, l’étape supplémentaire effectuée dans ce protocole pour trier et éliminer les cellules mortes après décongélation a permis d’obtenir une suspension cellulaire plus propre avec une viabilité cellulaire significativement plus élevée et d’améliorer la qualité de l’échantillon de départ. En plus de l’isolement des noyaux, ce protocole fournit des informations détaillées sur la façon d’évaluer la qualité et la quantité des noyaux isolés (Figure 3). La qualité des noyaux isolés a un impact considérable sur la qualité des données combinées snRNA-seq et snATAC-seq; Ici, la qualité des noyaux isolés a été évaluée par l’évaluation de la morphologie de la membrane nucléaire. Les noyaux isolés apparaissaient lisses et uniformément ronds, comme le montre la figure 3C, sous microscopie à fond clair, indiquant un processus d’isolement efficace. Pour plus de précision, deux méthodes de comptage différentes ont été utilisées, y compris le bleu de trypan et un kit pour l’évaluation de la viabilité basée sur la fluorescence, afin de quantifier les cellules et les noyaux. Le test de fluorescence a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire en fonction de l’intégrité cellulaire et de l’activité intracellulaire de l’estérase. Cette solution de colorant permet de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes en visualisant simultanément la calcéine fluorescente verte AM, qui indique l’activité intracellulaire de l’estérase, et l’homodimère d’éthidium fluorescent rouge 1, qui reflète la perte d’intégrité cellulaire. L’utilisation d’un colorant fluorescent pour compter aide à distinguer les noyaux des amas cellulaires et des débris. En utilisant ce protocole, la viabilité cellulaire est passée de 80% à 90% avant l’isolement des noyaux à <5% après l’isolement des noyaux, comme le montre la figure 3A,B.
Notre procédure a été comparée à la méthode existante, qui consiste à congeler des tissus frais directement dans de l’azote liquide et à effectuer l’étape de lyse sans dissociation enzymatique préalable (Protocole supplémentaire 2 et Figure supplémentaire 1). Les deux approches ont été testées pour déterminer quelle méthode donne une suspension de noyaux de meilleure qualité. La congélation instantanée de tissus cardiaques embryonnaires entiers a donné lieu à un pourcentage élevé de cellules non lysées détectées comme vivantes, ce qui indique une lyse cellulaire inappropriée (Figure supplémentaire 1A). Des agrégats et des cellules non individuelles ont été observés malgré la filtration à travers les filtres (figure supplémentaire 1A, B).
Les noyaux isolés ont été utilisés pour générer des bibliothèques pour le snATAC-seq et le snRNA-seq. La figure 4 illustre les résultats du contrôle de la qualité de l’ADNc utilisé pour la construction de la bibliothèque d’expression génique (GEX) et de la bibliothèque ATAC. Le contrôle de la qualité a été effectué à l’aide d’une électrophorèse automatisée (figure 5A). Les ADNc dérivés de l’ARNm ont été quantifiés et le rendement était suffisant pour une utilisation ultérieure dans la construction de bibliothèques GEX. Une bibliothèque GEX de haute qualité allant de ~300 bp à 600 bp et une bibliothèque ATAC de haute qualité avec un enroulement périodique des nucléosomes allant de 200 bp à 7 kbp ont été obtenues. Ces bibliothèques ont été séquencées par séquençage à haut débit et ont généré avec succès l’expression génique d’un seul noyau et l’accessibilité de la chromatine (Figure 5A). Ces données brutes étaient prêtes à être démultiplexées et analysées bio-informatique pour générer un profilage transcriptionnel et épigénétique des cellules progénitrices cardiaques E9.5 de souris. SnRNA-seq et snATAC-seq ont été regroupés, identifiés et marqués sur la base de gènes marqueurs connus en utilisant un clustering non supervisé avec la boîte à outils Seurat pour la génomique unique24 . Cette première analyse a confirmé la présence de tous les types de cellules cardiaques attendus à E9.5 (Figure 5B).
Tous les résultats ci-dessus soutiennent le succès de ce protocole dans l’isolement des noyaux qui conviennent aux approches en aval des noyaux uniques à partir de cellules cardiaques embryonnaires congelées.
Figure 1 : Représentation des principales étapes de la préparation de l’échantillon pour le profilage combiné snRNA-seq et snATAC-seq. Cet organigramme récapitule toutes les étapes, y compris la dissection des tissus cardiaques et la dissociation des cellules cardiaques, la congélation et la décongélation des cellules, la purification des cellules vivantes par élimination des cellules mortes et l’isolement des noyaux, qui sont effectuées pour la détection simultanée de l’accessibilité de l’ARNm et de la chromatine à partir de la même cellule. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; BSA = albumine sérique bovine; RT = température ambiante. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Viabilité des cellules décongelées optimisées après tri des cellules mortes. Images montrant le nombre de cellules et la viabilité à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avant (en haut) et après (en bas) l’élimination des cellules mortes à l’aide du colorant d’exclusion bleu trypan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Contrôle de la qualité de la préparation des noyaux. (A,B) Images montrant le nombre de cellules et la viabilité à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avant (en haut) et après (en bas) l’isolement des noyaux. Deux méthodes de comptage ont été utilisées : (A) le test de mortalité fluorescente et (B) le test du bleu de trypan. (C) Images montrant la qualité de l’isolement des noyaux. Les images ont été prises à 20x (barre d’échelle = 50 μm) en utilisant le fond clair et la microscopie à fluorescence. L’image en fond clair (à gauche) montre la morphologie nucléaire; la RFP (au milieu) montre les cellules qui ont perdu leur intégrité membranaire, c’est-à-dire les noyaux isolés; et la GFP (à droite) qui indique normalement l’activité estérase des cellules vivantes confirme ici l’absence de cellules vivantes dans la suspension des noyaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Contrôle de la qualité de l’expression génique unicellulaire et des bibliothèques ATAC. Analyse de l’ADN avec électrophorèse automatisée montrant la qualité et la distribution de la taille de l’ADNc (en haut), de la bibliothèque GEX (au milieu) et de la bibliothèque ATAC (en bas). Pour la quantification de l’ADNc, la zone allant de 200 pb à 8 900 pb a été sélectionnée, et le bioanalyseur a estimé la concentration d’ADNc (en pg/μL; cercle rouge). Un rendement suffisant en ADNc a été obtenu pour procéder à la construction de la bibliothèque GEX. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Performances de l’échantillon évaluées à l’aide du logiciel Cell Ranger25. (A) Diagramme de sensibilité croisée montrant les événements de transposition en pics par code-barres sur l’axe des x et identificateurs moléculaires uniques (UMI) de l’ARN par code-barres sur l’axe des y. Comme prévu, les cellules sont principalement situées dans le coin supérieur droit, avec des données élevées d’ARN et d’ATAC. Une séparation nette entre les cellules et les non-cellules (GEM vides, signal de fond) a été observée. (B) Tracé représentatif d’approximation et de projection de la variété uniforme (UMAP) de toutes les cellules capturées dans scRNA-seq (à gauche) et scATAC-seq (à droite) colorées par identité de cluster et regroupées en fonction des types de cellules. Une bonne séparation des grappes a été observée. Les données brutes conjointes GEX et ATAC ont été obtenues à partir du séquençage de 7 000 noyaux de la région cardiaque embryonnaire de souris E9.5 disséquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Contrôle de la qualité de l’isolement des noyaux à partir de la méthode existante impliquant la congélation de tissus frais directement dans de l’azote liquide. (A) Images montrant le nombre de noyaux isolés à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé et du bleu de trypan comme colorant d’exclusion avant (en haut) et après (en bas) la filtration à travers une passoire de 40 μm. Un pourcentage élevé de cellules non lysées ont été détectées comme vivantes. La détection de 20% de cellules vivantes indique une lyse cellulaire inappropriée. Les flèches noires indiquent les agrégats. (B) Images montrant la qualité des noyaux isolés. Les images ont été prises à 20x (haut et milieu avec une barre d’échelle de 50 μm) et 40x (en bas avec une barre d’échelle de 25 μm) en utilisant le fond clair et la microscopie à fluorescence. L’image en fond clair (à gauche) montre la morphologie nucléaire; la RFP (à droite) montre les cellules qui ont perdu leur intégrité membranaire, c’est-à-dire les noyaux isolés. Les flèches noires indiquent des multiplets de noyaux attachés par des débris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau 1 : Tableau des tampons et des solutions utilisés dans la procédure. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Protocole complémentaire n° 1: évaluation de la quantité de noyaux isolés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Protocole additionnel 2: Isolement des noyaux des tissus surgelés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’analyse de la composition cellulaire du cœur en développement par des études combinées snRNA-seq et snATAC-seq permet de mieux comprendre l’origine des cardiopathies congénitales26. Plusieurs laboratoires de recherche ont étudié les effets de la cryoconservation des tissus cardiaques sur le snRNA-seq27. La réalisation de snRNA-seq et de snATAC-seq à l’aide de tissus micro-disséqués frais provenant de modèles murins de maladie humaine peut être difficile sur le plan logistique lors de la comparaison de différentes conditions expérimentales. Pour un stade de développement donné, une difficulté réside dans le fait que les groupes témoin et expérimental doivent être traités en même cycle afin de réduire la variabilité technique introduite par le traitement des échantillons. Lorsque le traitement de tissus frais n’est pas possible, il est recommandé, sur la base de nos résultats, de dissocier puis de cryoconserver plutôt que de surgeler l’ensemble du tissu cardiaque embryonnaire. Le choix d’une méthode plutôt que l’autre est basé sur le fait que si le tissu cardiaque est congelé entier, isoler les cellules individuelles viables après la décongélation est beaucoup plus difficile. Cependant, si le protocole de dissociation tissulaire n’est pas optimisé, il peut être préférable de congeler le tissu entier. La dissociation suivie d’une cryoconservation est préférable étant donné que ce protocole de dissociation tissulaire produit >90% de cellules viables fraîches sans biais de type cellulaire.
Cette approche présente plusieurs avantages, tels que l’utilisation de cellules congelées, ce qui élimine le besoin de tissus frais, et l’utilisation d’une étape de dissociation unicellulaire, qui permet d’isoler des noyaux uniques intacts; En effet, cela est essentiel pour l’analyse unicellulaire en aval. Cependant, la dissociation enzymatique peut induire un biais transcriptionnel dans les populations cellulaires. La dissociation cellulaire enzymatique interfère avec le microenvironnement cellulaire et, par conséquent, induit des changements transcriptionnels dans la plupart des types cellulaires28. Le principal déterminant de ces changements est le temps de dissociation, et non le type cellulaire29. Pour modérer les artefacts induits par la dissociation, il est important de suivre le temps de digestion recommandé. La littérature publiée dans divers tissus indique qu’un temps de digestion de 30 minutes ou moins induit des changements transcriptionnels mineurs 28,30. De plus, les interventions bioinformatiques pourraient être utilisées pour minimiser les distorsions des données31,32.
L’obtention de noyaux simples purs et intacts est le facteur le plus important de la génomique mononoyau. Le colmatage des chambres microfluidiques des plates-formes unicellulaires en raison de la présence d’amas cellulaires ou de débris organiques conduit à une mauvaise qualité des données ou, plus problématique, à un échec expérimental. Dans cette procédure, les protocoles existants ont été modifiés en combinant la dissociation enzymatique, la cryoconservation et la purification de cellules progénitrices cardiaques viables. Notre procédure permet d’isoler des noyaux purs sans avoir besoin de tri FACS. En utilisant cette procédure, nous avons obtenu une suspension nucléaire de haute qualité sans agglutination, presque pas de débris et des noyaux uniques intacts. L’étape d’isolement cellulaire est cruciale pour éviter l’agglutination potentielle des noyaux; En effet, cela peut être évité par un pipetage doux à l’aide de grandes pointes de pipettes ou en filtrant les noyaux. L’utilisation de filtres à différentes étapes et l’observation ultérieure au microscope optique peuvent prévenir de tels problèmes.
Le protocole décrit ici a été utilisé avec succès pour le profilage snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation de noyaux obtenue à partir de cellules progénitrices cardiaques E9.5. Cette méthode peut être utilisée chez les souris gravides de type sauvage par rapport aux modèles murins pour les malformations cardiaques congénitales. Les malformations cardiaques congénitales se produisent probablement en raison de la perturbation des voies qui contrôlent la différenciation, la multiplication, la migration et la survie des cellules progénitrices cardiaques33,34. Pour mieux comprendre l’origine de ces anomalies, cette étude s’est concentrée spécifiquement sur le stade embryonnaire 9.5, dans lequel les progéniteurs des principales zones touchées par les malformations cardiaques congénitales sont présents, en particulier les progéniteurs cardiaques du deuxième champ cardiaque11 et de la crête neurale35. L’application de cette procédure aux cellules du cœur de souris adulte et du cœur humain nécessite l’optimisation du protocole, notamment en termes d’étapes de dissociation cellulaire et de lyse.
Les principales considérations entre le comptage manuel et automatisé des cellules sont les coûts, la main-d’œuvre et la précision. Les compteurs automatisés sont plus rapides que la plupart des scientifiques qualifiés effectuant un comptage manuel. Surtout lorsqu’il s’agit d’un grand nombre d’échantillons, il est très avantageux de pouvoir simplement appuyer sur le nombre et afficher le résultat. C’est un point important car une fois les noyaux isolés, ils doivent être traités rapidement pour éviter la perte de leur intégrité. Le principal avantage de précision des systèmes automatisés est que ces systèmes éliminent la variabilité entre les utilisateurs ou les laboratoires. Un autre avantage est que les systèmes automatisés ont généralement un champ de vision plus large que les hémocytomètres. Lorsque le nombre de cellules/noyaux ou la concentration des cellules/noyaux sont plus faibles, ce champ de vision plus large est certainement un avantage par rapport à la méthode manuelle traditionnelle.
Un pourcentage élevé de contamination de l’ADN mitochondrial peut être observé lorsque la concentration du détergent non ionique est trop élevée. En diminuant sa concentration dans le tampon de lyse, cette contamination peut être réduite sans diminuer le rendement des noyaux. Les résultats les plus satisfaisants ont été obtenus dans nos expériences avec un tampon de lyse contenant 0,1% de détergent. Faire tourner les noyaux dans un seau pivotant peut également réduire le nombre de mitochondries dans la pastille.
Avoir un rapport approprié de la transposase Tn5 aux noyaux est crucial pour le succès du snATAC-seq13,14. Par exemple, avoir trop de Tn5 peut conduire à un fond élevé en raison de la chromatine fermée et de la faible complexité des bibliothèques de séquençage, alors que la sous-lyse peut ne pas aboutir à une bibliothèque amplifiée par PCRcomplète 13. Pour déterminer avec précision le nombre de noyaux, nous avons utilisé deux méthodes complémentaires.
Les ensembles de données omiques multimodales offrent la possibilité d’étudier simultanément plusieurs niveaux d’organisation génomique 9,36. L’approche multimodale conjointe ARN et ATAC permet l’étude des régulateurs en amont et des gènes métaboliques en aval et fournit une approche globale pour l’étude des réseaux transcriptionnels et de l’architecture de la chromatine dans le contexte du développement cardiaque à la résolution unicellulaire. Ce protocole d’isolement à noyau unique est compatible avec l’évaluation individuelle et conjointe des ensembles de données d’expression et de chromatine. L’accessibilité de la chromatine est un niveau épigénétique important de régulation car elle permet l’activité des régulateurs transcriptionnels sur des sites génomiques spécifiques 8,9,10,11,12,13. Une multitude d’informations sur l’identité et les sites cibles de dizaines de facteurs de transcription possibles sont ainsi fournies par la séquence d’ADN dans le profil de chromatine. La comparaison des informations obtenues par snATAC-seq avec le profilage de l’expression de l’ARNns peut aider à identifier les facteurs de transcription les plus pertinents, qui peuvent ensuite être analysés plus en détail par Cut&Run37. Nous espérons que cette procédure aidera les chercheurs intéressés et les encouragera à utiliser cette méthode puissante pour leurs recherches.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par ERA-CVD-2019 et ANR-JCJC-2020 à SS. Nous remercions l’installation de génomique et de bioinformatique (GBiM) du laboratoire U 1251/Marseille Medical Genetics et les examinateurs anonymes pour leurs précieux commentaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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