Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.
Abstract
Развивающееся сердце представляет собой сложную структуру, содержащую различные клетки-предшественники, контролируемые сложными регуляторными механизмами. Изучение экспрессии генов и состояния хроматина отдельных клеток позволяет идентифицировать тип и состояние клеток. Подходы к секвенированию отдельных клеток выявили ряд важных характеристик гетерогенности клеток-предшественников сердца. Однако эти методы, как правило, ограничены свежей тканью, что ограничивает исследования с различными экспериментальными условиями, поскольку свежая ткань должна быть обработана сразу в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость. Поэтому в этой области необходимы простые и гибкие процедуры для получения данных с помощью таких методов, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и одноядерный анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (snATAC-seq). Здесь мы представляем протокол для быстрого выделения ядер для последующих одноядерных двойных омиков (комбинированные snRNA-seq и snATAC-seq). Этот метод позволяет выделять ядра из замороженных образцов клеток-предшественников сердца и может быть объединен с платформами, использующими микрофлюидные камеры.
Introduction
Среди врожденных дефектов наиболее распространены врожденные пороки сердца (ВПС), встречающиеся примерно у 1% живорождений каждый год 1,2. Генетические мутации выявляются лишь в меньшинстве случаев, что означает, что в этиологии ИБС 2,3 участвуют другие причины, такие как нарушения регуляции генов. Развитие сердца представляет собой сложный процесс разнообразных и взаимодействующих типов клеток, что затрудняет идентификацию причинно-следственных некодирующих мутаций и их влияния на регуляцию генов. Органогенез сердца начинается с клеточных предшественников, дающих начало различным подтипам сердечных клеток, включая клетки миокарда, фибробластов, эпикардиальных и эндокардиальных клеток 4,5. Одноклеточная геномика становится ключевым методом изучения развития сердца и оценки влияния клеточной гетерогенности на здоровье и болезни6. Разработка мультиомических методов одновременного измерения различных параметров и расширение вычислительных конвейеров облегчили открытие типов и подтипов клеток в нормальном и больном сердце6. В данной статье описывается надежный протокол выделения одного ядра для замороженных клеток-предшественников сердца, полученных из эмбрионов мышей, который совместим с нРНК-секвенированием и snATAC-секвенированием (а также snRNA-seq и snATAC-seq вместе взятыми)7,8,9.
ATAC-seq - это надежный метод, который позволяет идентифицировать регуляторные открытые области хроматина и позиционировать нуклеосомы10,11. Эта информация используется для того, чтобы сделать выводы о расположении, идентичности и активности факторов транскрипции. Таким образом, можно проанализировать активность хроматиновых факторов, в том числе ремоделиров, а также транскрипционную активность РНК-полимеразы, поскольку метод является высокочувствительным для измерения количественных изменений структуры хроматина 1,2. Таким образом, ATAC-seq обеспечивает надежный и беспристрастный подход к раскрытию механизмов, контролирующих регуляцию транскрипции в определенном типе клеток. Протоколы ATAC-seq также были проверены для измерения доступности хроматина в отдельных клетках, что выявило вариабельность архитектуры хроматина в клеточных популяциях10,12,13.
Несмотря на то, что в последние годы были достигнуты заметные успехи в области одиночных клеток, основная трудность заключается в обработке свежих образцов, необходимых для проведения этих экспериментов14. Чтобы обойти эту трудность, были проведены различные тесты с целью проведения таких анализов, как snRNA-seq и snATAC-seq с замороженной сердечной тканью или клетками15,16.
Для анализа данных одноклеточной геномики использовалось несколько платформ17. Широко используемые платформы для экспрессии одноклеточных генов и профилирования ATAC являются платформами для инкапсуляции множественных микрофлюидных капель17. Поскольку эти платформы используют микрофлюидные камеры, мусор или агрегаты могут засорить систему, что приведет к непригодным для использования данным. Таким образом, успех одноклеточных исследований зависит от точного выделения отдельных клеток/ядер.
Представленный здесь протокол использует подход, аналогичный недавним исследованиям с использованием snRNA-seq и snATAC-seq для понимания врожденных пороков сердца 18,19,20,21,22,23. В этой процедуре используется ферментативная диссоциация свежеиссеченной микрорассеченной сердечной ткани с последующей криоконсервацией клеток-предшественников сердца мыши. После размораживания жизнеспособные клетки очищаются и обрабатываются для ядерной изоляции. В данной работе этот протокол был успешно использован для получения данных snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же ядерного препарата клеток-предшественников сердца мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура на животных, принятая в этом исследовании, была одобрена комитетами по этике животных Университета Экс-Марсель (C2EA-14) и проводилась в соответствии с протоколами, утвержденными назначенным национальным этическим комитетом по экспериментам на животных (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Авторизация Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Настройка спаривания по времени перед вскрытием
- Чтобы получить эмбрионы мышей, выполните спаривание между взрослыми мышами за 9,5 дней до выделения области сердца. В этой процедуре использовались мыши дикого типа C57BL/6J в возрасте 2-6 месяцев, а спаривание проводилось в течение ночи.
- На следующее утро проверьте, есть ли у самок мышей вагинальная пробка. Рассмотрим день, когда пробка идентифицирована как эмбриональный день (E) 0,5.
2. Подготовка тканей и выделение клеток
- Усыпить беременную женщину в возрасте 2-6 месяцев C57BL/6J на 9,5-й день после зачатия с помощью CO2 с возрастающей концентрацией с последующей дисконтацией шейки матки. Очистите нижнюю часть живота 70% этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование анестетиков перед вывихом шейки матки не рекомендуется, так как это подвергнет эмбрионы изменениям окружающей среды, которые могут повлиять на последующие транскриптомные и эпигеномные исследования. - Вскройте живот и брюшину ножницами. Визуализируйте рога матки и используйте щипцы, чтобы иссечь оба рога.
- Поместите рога в чашку Петри, содержащую холодную полную среду с 1% FBS. Хотя никакого конкретного объема не требуется, необходимо позаботиться о том, чтобы эмбрионы были полностью погружены в среду. Подходит приблизительный объем 10 мл на 10-сантиметровую чашку Петри.
- Под стереомикроскопом с 5-кратным увеличением и с помощью щипцов удалите ткань эндометрия, плаценту и желточный мешок из каждого эмбриона.
- Поместите эмбрионы в чашку Петри с холодной полной средой с 1% FBS. Препарируют эмбриональную область сердца, как описано на схеме эмбриона, показанной на рисунке 1, в холодной полной среде.
- Объедините области сердца, препарированные у пяти эмбрионов мышей, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Предварительное охлаждение качающихся ковшовых центрифуг до 4 °C.
- Центрифуга при 300x g в течение 1 мин при RT в центрифуге с качающимся ведром. Удалите надосадочную жидкость и промойте ткани, добавив 1 мл PBS для культивирования тканей.
- Центрифуга при 300 x g в течение 1 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и повторите этапы стирки, в общей сложности две стирки. Повторите стирку дважды, заменив PBS 0,05% трипсином/ЭДТА (1x).
- Для тканевого переваривания добавьте 50 мкл 0,25% трипсина/ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° C. Через 5 минут нанесите мягкую механическую диссоциацию жестами вверх и вниз с помощью наконечника фильтра с широким отверстием.
- Инактивируйте активность расщепления трипсина, добавляя 350 мкл полной среды к диссоциированным клеткам. Пропустите ресуспендированные клетки через клеточный фильтр размером 40 мкм.
3. Подсчет клеток и оценка жизнеспособности
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток и жизнеспособность являются критическими параметрами для успеха экспериментов с отдельными клетками. Подход snATAC-seq чувствителен к незначительным изменениям числа ячеек. Слишком малое количество клеток приводит к чрезмерному перевариванию хроматина, что приводит к большему количеству считываний и картированию недоступных областей хроматина (шум). Точно так же наличие слишком большого количества клеток генерирует высокомолекулярные фрагменты, которые трудно секвенировать. Для точного определения концентраций клеток и ядер количество клеток и жизнеспособность оценивали двумя разными методами.
- Проведите анализ трипанового синего для подсчета клеток, как описано ниже.
- Вортекс 0,4% раствор для окрашивания трипановым синим, отжим в течение 10 с при комнатной температуре при 2,000 x g и переведите 10 мкл в микропробирку.
- С помощью пипетки перемешивают клеточную суспензию и добавляют 10 мкл суспензии к уже аликвотированным 10 мкл раствора трипанового синего. Тщательно перемешайте 10 раз пипеткой.
- Перенесите 10 мкл окрашенных клеток в счетное стекло. Поместите слайд в счетчик, чтобы автоматически рассчитать концентрацию и жизнеспособность клеток.
- Проведите оценку смертности на основе флуоресценции, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ основан на использовании флуоресцентных красителей (гомодимер этидия-1, EthD-1 и кальцеин AM) для оценки жизнеспособности клеток. Был использован коммерчески доступный комплект, и были соблюдены инструкции поставщика по соответствующей подготовке и использованию.- Приготовьте 10 мкМ раствора EthD-1, добавив 5 мкл поставляемого 2 мМ исходного раствора EthD-1 к 1 мл стерильного D-PBS для культуры тканей и встряхните в течение 5 с, чтобы обеспечить полное перемешивание.
- Перенесите 2,5 мкл поставляемого 4 мМ исходного раствора кальцеина AM в уже приготовленный раствор EthD-1. Вихрь в течение 5 с для обеспечения полного перемешивания.
- Добавьте 10 мкл полученного рабочего раствора 10 мкМ EthD-1 и 10 мкМ кальцеина AM к 10 мкл клеточной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кальцеин очень чувствителен к гидролизу в водных растворах, поэтому используйте этот рабочий раствор в течение 1 дня. - Перенесите 10 мкл окрашенных клеток на счетное стекло. Вставьте слайд в автоматический счетчик флуоресцентных ячеек. Подсчитайте живые клетки с помощью фильтра GFP и мертвые клетки с фильтром RFP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два метода подсчета дали одинаковое количество клеток и жизнеспособность, а общее количество свежедиссоциированных клеток оценивалось в среднем примерно в 20 000 клеток на эмбриональную область сердца (0,06 мм3).
4. Замораживание ячеек
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь дна пробирки, и ресуспендируйте гранулу в 1 мл охлажденной морозильной среды.
- Перенесите клеточную суспензию в предварительно охлажденный криовиал и поместите криовиальную в предварительно охлажденный морозильный контейнер.
- Поместите контейнер при температуре −80 °C на срок от 4 до 8 часов. Переведите криовиал на жидкий азот для последующих экспериментов по секвенированию одноядерных РНК и ATAC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Криовиал следует транспортировать на сухом льду перед использованием. По нашему опыту, клетки могут храниться в жидком азоте не менее 6 месяцев без потери жизнеспособности клеток. Температура хранения должна постоянно поддерживаться ниже −150 °C, чтобы предотвратить образование кристаллов льда.
5. Размораживание клеток и удаление мертвых клеток
- Поместите криовиалы на водяную баню с температурой 37 °C на 1-2 минуты. Удалите его, когда крошечный кристалл останется в криовиале.
- Добавьте 1 мл предварительно подогретой (37 °C) готовой среды. Смешайте пипеткой три раза. Перенесите суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл теплой полной среды.
- Пропустите всю клеточную суспензию через сетчатый фильтр 30 мкм. Промойте ситечко 1-2 мл теплой полной среды и соберите проточный фильтр в ту же коническую трубку.
- Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и удалить надосадочную жидкость. Промойте один раз PBS и перенесите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугу при 300 x g в течение 5 мин и удалите надосадочную жидкость, не разрушая клеточную гранулу.
- Добавьте 100 мкл прилагаемых магнитных микрошариков в гранулированные ячейки и гомогенизируйте пять раз, используя наконечник пипетки с широким отверстием. Инкубировать в течение 15 минут при РТ.
- Тем временем промойте колонну магнитной сепарации (емкость: от 1 x 107 до 2 x 108 ячеек) 500 мкл 1x связывающего буфера.
- После завершения инкубации разбавьте клеточную суспензию, содержащую микрогранулы, 500 мкл 1x связывающего буфера.
- Нанесите суспензию ячейки (0,6 мкл) на подготовленную магнитную сепарационную колонну. Проточная фракция представляет собой отрицательно выбранную фракцию живых клеток, а магнитно-удерживаемая фракция представляет собой положительно отобранные мертвые клетки.
- Соберите стоки живых клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промойте микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую клеточную суспензию, и колонку 2 мл 1x связывающего буфера и соберите сточные воды в ту же пробирку объемом 15 мл.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
- Добавьте 1 мл раствора PBS-BSA и аккуратно перемешайте, пипеткой пять раз с помощью наконечника пипетки с широким отверстием. Перенесите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
- Добавьте 1 мл PBS-BSA, чтобы ресуспендировать гранулы, и повторите этап промывки, в общей сложности две стирки.
- Ресуспендируют клетки в 100 мкл раствора PBS-BSA. Аккуратно перемешайте, пипеткой 10 раз.
- Определяют концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью ранее описанных методов (этап 3.1 и шаг 3.2). Чтобы перейти к следующему шагу, убедитесь, что количество ячеек составляет ≥100 000 ячеек. Репрезентативные результаты см. на рисунке 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация приводит к потере примерно 40% исходного материала живых клеток. В зависимости от начального количества ячеек разделение шариков на магнитном столбе приводит к высокой жизнеспособности клеток, но делит общее количество клеток в два-пять раз. Использование магнитного комплекта на основе колонки для удаления мертвых клеток рекомендуется только при наличии достаточного исходного материала.
6. Выделение ядер
ПРИМЕЧАНИЕ: snATAC и snRNA-seq в сочетании выполняются с помощью суспензии чистых и интактных ядер. Рекомендуется оптимизация условий лизиса (время лизиса и концентрация NP40) для используемого типа клеток. Оптимальные сроки лизиса и концентрация детергента - это те, которые приводят к лизиру максимального количества клеток без нарушения ядерной морфологии. Потеря клеток/ядер может быть уменьшена с помощью центрифуги с качающимся ведром вместо центрифуги с фиксированным углом. Чтобы свести к минимуму задержку ядер на пластмассах, рекомендуется использовать наконечники пипеток с низким удержанием и центрифужные пробирки. Это может увеличить восстановление ядер. Покрытие наконечников пипеток и центрифужных пробирок 5% BSA является менее дорогой, но более трудоемкой альтернативой.
- Очистите рабочее место и материалы 70% раствором для удаления этанола и РНКазы.
- Предварительное охлаждение качающихся ковшовых центрифуг до 4 °C. Свежеприготовленный буфер для лизиса, буфер для разбавления лизиса, буфер для лизиса 0,1x и буфер для промывки (см. Таблицу 1). Поддерживайте буферы на льду.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C в центрифуге с качающимся ведром. Аккуратно удалите всю надосадочную жидкость, не касаясь дна трубки, чтобы избежать смещения клеточной гранулы.
- Добавьте 100 мкл охлажденного 0,1-кратного лизисного буфера. Аккуратно перемешайте, пипеткой 10 раз. Инкубировать 5 минут на льду.
- Добавьте 1 мл охлажденного буфера для стирки и аккуратно перемешайте пипеткой пять раз. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу ядер.
- Повторите стирки с охлажденным буфером для стирки, всего три стирки. Приготовьте буфер для разбавленных ядер. После ресуспендирования держите раствор запаса ядер на льду.
7. Качественные и количественные оценки выделенных ядер
ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на исходном количестве клеток и оценивая потерю примерно 50% ядер во время лизиса клеток, ресуспендируйте соответствующее количество клеток в буфере ядер холодного разбавления. Расчет объема ресуспензии с буфером охлажденных разбавленных ядер основан на целевом извлечении ядер и соответствующих концентрациях запасов ядер, рекомендованных руководством пользователя завода-изготовителя. Пример этого расчета приведен в Дополнительном протоколе 1.
- Основываясь на исходном количестве клеток и оценивая примерно 50% потери ядер во время лизиса клеток, ресуспендируют соответствующее количество клеток в буфере ядер холодного разбавления.
- Определите фактическую концентрацию ядер. Смешайте 2 мкл исходного раствора ядер с 8 мкл разбавленного буфера ядер и добавьте смесь к предварительно аликвотированным 10 мкл трипанового синего или рабочего раствора EthD-1 / кальцеина. Подсчитайте ядра с помощью автоматического счетчика клеток. Менее 5% клеток должны быть жизнеспособными. Репрезентативные результаты см. на рисунке 3 .
- Рассчитайте объем запаса ядер и объем буфера разбавленных ядер, чтобы получить общий объем 5 мкл при рекомендуемой концентрации для реакции транспозиции (см. Руководство пользователя производителя). Немедленно приступайте к реакции транспозиции в соответствии с руководствомпользователя 17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы от реакции транспозиции до построения библиотек ATAC и GEX были выполнены в соответствии с руководством пользователя набора, используемого для snRNA-seq и snATAC-seq вместе17.
8. Анализ качества библиотек snRNA-seq и snATAC-seq
- Прежде чем приступить к секвенированию следующего поколения, проверьте качество и распределение по размерам окончательных библиотек snATAC-seq и экспрессии генов GEX. Оцените качество и количество последовательностей, идентифицированных в библиотеках, с помощью систем анализа фрагментов. Репрезентативные результаты оценки качества см. на рисунке 4 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная трассировка библиотек snATAC-seq должна показывать периодичность намотки нуклеосом, а размеры должны варьироваться от 200.н. до нескольких Кбит/с, тогда как размеры в библиотеке экспрессии генов должны варьироваться от 300.н. до 600.н.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По сравнению с приготовлением одноклеточных суспензий для одноклеточных подходов, приготовление одноядерных суспензий является гораздо более сложным и требует более высокой степени разрешения и обработки. Ключевым фактором успешного комбинирования snRNA-seq и snATAC-seq является чистая и неповрежденная суспензия ядер. Протокол эффективного выделения ядер должен быть адаптирован к каждому типу и состоянию ткани (свежей или замороженной). Здесь описан оптимизированный протокол выделения ядер из замороженных эмбриональных сердечных клеток мыши. Все этапы от диссекции эмбриональной области сердца и диссоциации сердечных клеток до выделения ядер обобщены на рисунке 1. Для исходного материала рекомендуется количество клеток 1 x 105-1 x 106 клеток и жизнеспособность клеток >70% для эффективного выделения ядер. Как показано на рисунке 2, дополнительный этап, выполняемый в этом протоколе для сортировки и удаления мертвых клеток после оттаивания, позволил получить более чистую клеточную суспензию со значительно более высокой жизнеспособностью клеток и улучшить качество исходного образца. В дополнение к выделению ядер этот протокол предоставляет подробную информацию о том, как оценить качество и количество выделенных ядер (рис. 3). Качество изолированных ядер сильно влияет на качество комбинированных данных snRNA-seq и snATAC-seq; Здесь качество выделенных ядер оценивали путем оценки морфологии ядерной мембраны. Изолированные ядра оказались гладкими и равномерно круглыми, как показано на рисунке 3C, при светлопольной микроскопии, что указывает на эффективный процесс выделения. Для большей точности использовались два разных метода подсчета, в том числе трипановый синий и набор для оценки жизнеспособности на основе флуоресценции для количественной оценки клеток и ядер. Флуоресцентный анализ был использован для определения жизнеспособности клеток на основе клеточной целостности и активности внутриклеточной эстеразы. Этот раствор красителя позволяет отличать живые клетки от мертвых, одновременно визуализируя зеленый флуоресцентный кальцеин AM, который указывает на внутриклеточную активность эстеразы, и красный флуоресцентный гомодимер этидия 1, который отражает потерю клеточной целостности. Использование флуоресцентного красителя для подсчета помогает отличить ядра от клеточных скоплений и мусора. Используя этот протокол, жизнеспособность клеток прошла от 80%-90% до выделения ядер до <5% после выделения ядер, как показано на рисунке 3A,B.
Наша процедура была сравнена с существующим методом, который включает замораживание свежей ткани непосредственно в жидком азоте и выполнение стадии лизинга без предварительной ферментативной диссоциации (Дополнительный протокол 2 и Дополнительный рисунок 1). Оба подхода были протестированы, чтобы определить, какой метод дает более качественную суспензию ядер. Мгновенное замораживание всей эмбриональной сердечной ткани привело к высокому проценту нелизированных клеток, обнаруженных как живых, что указывает на ненадлежащий лизис клеток (дополнительный рисунок 1A). Агрегаты и неиндивидуальные клетки наблюдались, несмотря на фильтрацию через фильтры (дополнительный рисунок 1A, B).
Выделенные ядра были использованы для создания библиотек для совместных snATAC-seq и snRNA-seq. На рисунке 4 показаны результаты контроля качества кДНК, используемой для построения библиотеки экспрессии генов (GEX), и библиотеки ATAC. Контроль качества проводили с помощью автоматизированного электрофореза (рис. 5А). КДНК, полученные из мРНК, были количественно определены, и выход был достаточным для последующего использования в построении библиотеки GEX. Была получена высококачественная библиотека GEX в диапазоне от ~300.н. до 600.н. и высококачественная библиотека ATAC с периодической нуклеосомной намоткой в диапазоне от 200.н. до 7 кбит/с. Эти библиотеки были секвенированы с помощью высокопроизводительного секвенирования и успешно сгенерировали экспрессию одноядерных генов и доступность хроматина (рис. 5A). Эти необработанные данные были готовы к демультиплексированию и биоинформационному анализу для создания транскрипционного и эпигенетического профилирования клеток-предшественников сердца мыши E9.5. SnRNA-seq и snATAC-seq были кластеризованы, идентифицированы и помечены на основе известных маркерных генов с использованием неконтролируемой кластеризации с инструментарием Seurat для одиночной геномики24 . Этот первоначальный анализ подтвердил наличие всех ожидаемых типов сердечных клеток при E9.5 (рис. 5B).
Все вышеперечисленные результаты подтверждают успех этого протокола в выделении ядер, которые подходят для последующих подходов к одиночным ядрам из замороженных эмбриональных сердечных клеток.
Рисунок 1: Представление основных этапов пробоподготовки для комбинированного профилирования snRNA-seq и snATAC-seq. Эта блок-схема повторяет все этапы, включая диссекцию сердечной ткани и диссоциацию сердечных клеток, замораживание и размораживание клеток, очистку живых клеток путем удаления мертвых клеток и выделение ядер, которые выполняются для одновременного обнаружения доступности мРНК и хроматина из одной клетки. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; BSA = бычий сывороточный альбумин; RT = комнатная температура. Создано с помощью BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Жизнеспособность оптимизированных размороженных клеток после сортировки мертвых клеток. Изображения, показывающие количество и жизнеспособность клеток с использованием автоматического счетчика клеток до (вверху) и после (внизу) удаления мертвых клеток с использованием красителя исключения трипанового синего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Контроль качества подготовки ядер. (A, B) Изображения, показывающие количество и жизнеспособность клеток с использованием автоматического счетчика клеток до (вверху) и после (нижнего) выделения ядер. Использовались два метода подсчета: (А) флуоресцентный анализ смертности и (Б) анализ трипанового синего. (C) Изображения, показывающие качество выделения ядер. Изображения были получены в 20 раз (масштабная линейка = 50 мкм) с использованием светлопольной и флуоресцентной микроскопии. На изображении светлого поля (слева) показана ядерная морфология; RFP (посередине) показывает клетки, потерявшие целостность мембраны, другими словами, изолированные ядра; и GFP (справа), который обычно указывает на эстеразную активность живых клеток, здесь подтверждает отсутствие живых клеток в суспензии ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Контроль качества экспрессии одноклеточных генов и библиотек ATAC. Анализ ДНК с помощью автоматизированного электрофореза, показывающий качество и распределение по размерам кДНК (вверху), библиотеки GEX (посередине) и библиотеки ATAC (внизу). Для количественного определения кДНК была выбрана зона в диапазоне от 200.н. до 8 900.н., и биоанализатор оценил концентрацию кДНК (в пг/мкл; красный кружок). Был получен достаточный выход кДНК для продолжения строительства библиотеки GEX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Производительность образца, оцененная с помощью программного обеспечения Cell Ranger25. (A) График перекрестной чувствительности, показывающий события транспозиции в пиках на штрих-код по оси x и уникальные молекулярные идентификаторы РНК (UMI) на штрих-код по оси y. Как и ожидалось, клетки в основном расположены в правом верхнем углу с высокими данными РНК и ATAC. Наблюдалось четкое разделение между клетками и неклетками (пустые GEM, фоновый сигнал). (B) Репрезентативный график аппроксимации и проекции равномерного многообразия (UMAP) всех захваченных клеток в scRNA-seq (слева) и scATAC-seq (справа), окрашенных по идентичности кластеров и сгруппированных по типам клеток. Наблюдалось хорошее разделение гроздей. Совместные необработанные данные GEX и ATAC были получены путем секвенирования 7000 ядер из рассеченной эмбриональной области сердца мыши E9.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Контроль качества выделения ядер из существующего метода, включающего замораживание свежей ткани непосредственно в жидком азоте. (A) Изображения, показывающие количество изолированных ядер с использованием автоматического счетчика клеток и трипанового синего в качестве исключающего красителя до (вверху) и после (внизу) фильтрации через сетчатый фильтр 40 мкм. Высокий процент нелизированных клеток был обнаружен как живой. Обнаружение 20% живых клеток указывает на ненадлежащий лизис клеток. Черные стрелки обозначают агрегаты. (B) Изображения, показывающие качество изолированных ядер. Изображения были получены в 20-кратном (верхнее и среднее с масштабной линейкой 50 мкм) и 40-кратном (нижнее с масштабной линейкой 25 мкм) с использованием светлопольной и флуоресцентной микроскопии. Изображение светлого поля (слева) показывает ядерную морфологию; RFP (справа) показывает клетки, потерявшие целостность мембраны, другими словами, изолированные ядра. Черные стрелки указывают на множество ядер, прикрепленных обломками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Таблица 1: Таблица буферов и растворов, используемых в процедуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительный протокол 1: Оценка количества выделенных ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный протокол 2: Выделение ядер из замороженных тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ клеточного состава развивающегося сердца с помощью комбинированных исследований snRNA-seq и snATAC-seq обеспечивает более глубокое понимание происхождения врожденных пороков сердца26. Несколько исследовательских лабораторий изучили влияние криоконсервации сердечной ткани на snRNA-seq27. Проведение snRNA-seq и snATAC-seq с использованием свежей микрорассеченной ткани из мышиных моделей заболеваний человека может быть логистически сложным при сравнении различных экспериментальных условий. Для данной стадии развития одна из трудностей заключается в том, что контрольная и экспериментальная группы должны быть обработаны в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость, вызванную обработкой образцов. Когда обработка свежей ткани невозможна, рекомендуется, основываясь на наших результатах, диссоциировать, а затем криоконсервировать, а не замораживать всю эмбриональную сердечную ткань. Выбор одного метода перед другим основан на том, что если сердечная ткань заморожена целиком, выделение жизнеспособных единичных клеток после оттаивания гораздо сложнее. Однако, если протокол диссоциации тканей не оптимизирован, возможно, лучше заморозить ткань целиком. Диссоциация с последующей криоконсервацией предпочтительна, учитывая, что этот протокол диссоциации тканей дает >90% свежих жизнеспособных клеток без смещения клеточного типа.
Этот подход имеет несколько преимуществ, таких как использование замороженных клеток, что устраняет потребность в свежей ткани, и использование стадии диссоциации одной клетки, которая позволяет изолировать интактные одиночные ядра; Действительно, это имеет решающее значение для последующего анализа отдельных клеток. Однако ферментативная диссоциация может вызвать смещение транскрипции в клеточных популяциях. Ферментативная диссоциация клеток влияет на клеточное микроокружение и, таким образом, индуцирует транскрипционные изменения в большинстве типов клеток28. Основным фактором, определяющим эти изменения, является время диссоциации, а не типклетки 29. Чтобы смягчить артефакты, вызванные диссоциацией, важно соблюдать рекомендуемое время пищеварения. Опубликованная литература по различным тканям указывает на то, что время переваривания 30 мин или менее вызывает незначительные транскрипционные изменения28,30. Кроме того, биоинформационные вмешательства могут быть использованы для минимизации искажений данных31,32.
Получение чистых и интактных одиночных ядер является наиболее важным фактором в одноядерной геномике. Засорение микрофлюидных камер одноклеточных платформ из-за присутствия клеточных кластеров или органического мусора приводит к низкому качеству данных или, что более проблематично, к провалу эксперимента. В этой процедуре существующие протоколы были модифицированы путем объединения ферментативной диссоциации, криоконсервации и очистки жизнеспособных клеток-предшественников сердца. Наша процедура позволяет выделять чистые ядра без необходимости сортировки FACS. Используя эту процедуру, мы получили высококачественную ядерную суспензию без слипания, почти без мусора и неповрежденные единичные ядра. Этап выделения клеток имеет решающее значение для предотвращения слипания потенциальных ядер; Действительно, этого можно избежать, щадя пипетку с использованием больших наконечников пипеток или фильтруя ядра. Использование фильтров на разных этапах и последующее наблюдение под световым микроскопом может предотвратить такие проблемы.
Описанный здесь протокол был успешно использован для профилирования snRNA-seq и snATAC-seq из одного и того же препарата ядер, полученного из клеток-предшественников сердца E9.5. Этот метод может быть использован на беременных мышах дикого типа по сравнению с мышиными моделями врожденных пороков сердца. Врожденные пороки сердца, вероятно, возникают из-за нарушения путей, которые контролируют дифференцировку, размножение, миграцию и выживание клеток-предшественников сердца33,34. Чтобы лучше понять происхождение этих дефектов, это исследование было сосредоточено конкретно на эмбриональной стадии 9.5, на которой присутствуют предшественники основных областей, пораженных врожденными пороками сердца, в частности сердечные предшественники второго сердечного поля11 и нервного гребня35. Применение этой процедуры к клеткам сердца взрослой мыши и сердца человека требует оптимизации протокола, особенно с точки зрения этапов диссоциации и лизиса клеток.
Основными соображениями между ручным и автоматическим подсчетом ячеек являются затраты, трудозатраты и точность. Автоматические счетчики работают быстрее, чем большинство квалифицированных ученых, выполняющих ручной подсчет. Особенно при работе с большим количеством образцов очень полезно иметь возможность просто нажать счетчик и просмотреть результат. Это важный момент, потому что, как только ядра выделены, они должны быть быстро обработаны, чтобы избежать потери их целостности. Основное преимущество автоматизированных систем в области точности заключается в том, что эти системы устраняют различия между пользователями или лабораториями. Еще одним преимуществом является то, что автоматизированные системы обычно имеют большее поле зрения, чем гемоцитометры. Когда количество клеток/ядер или концентрация клеток/ядер ниже, это большее поле зрения, безусловно, является преимуществом по сравнению с традиционным ручным методом.
Высокий процент загрязнения митохондриальной ДНК может наблюдаться, когда концентрация неионогенного детергента слишком высока. Уменьшая его концентрацию в буфере лизиса, это загрязнение может быть уменьшено без уменьшения выхода ядер. Наиболее удовлетворительные результаты были получены в наших экспериментах с лизисным буфером, содержащим 0,1% моющего средства. Вращение ядер в поворотном ведре также может уменьшить количество митохондрий в грануле.
Наличие соответствующего соотношения транспозазы Tn5 к ядрам имеет решающее значение для успешного snATAC-seq13,14. Например, наличие слишком большого количества Tn5 может привести к высокому фону из-за закрытого хроматина и низкой сложности библиотек секвенирования, тогда как сублиз может не привести к полной ПЦР-амплифицированной библиотеке13. Чтобы точно определить количество ядер, мы использовали два взаимодополняющих метода.
Мультимодальные наборы омиксных данных дают возможность исследовать несколько уровней геномной организацииодновременно 9,36. Совместный мультимодальный подход РНК и ATAC позволяет изучать восходящие регуляторы и нисходящие метаболические гены и обеспечивает комплексный подход к изучению транскрипционных сетей и архитектуры хроматина в контексте развития сердца с разрешением в одной клетке. Этот протокол выделения одноядерных ядер совместим как с индивидуальной, так и с совместной оценкой экспрессии и наборов данных хроматина. Доступность хроматина является важным эпигенетическим уровнем регуляции, поскольку она обеспечивает активность регуляторов транскрипции на определенных участкахгенома 8,9,10,11,12,13. Таким образом, множество информации об идентичности и целевых сайтах десятков возможных факторов транскрипции обеспечивается последовательностью ДНК в профиле хроматина. Сравнение информации, полученной с помощью snATAC-seq, с профилированием экспрессии snRNA может помочь определить наиболее релевантные факторы транскрипции, которые затем могут быть дополнительно проанализированы с помощью Cut&Run37. Мы надеемся, что эта процедура поможет заинтересованным исследователям и побудит их использовать этот мощный метод для своих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано ERA-CVD-2019 и ANR-JCJC-2020 SS. Мы благодарим Центр геномики и биоинформатики (GBiM) из лаборатории U 1251 / Marseille Medical Genetics и анонимных рецензентов за предоставленные ценные комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
