Здесь мы представляем протокол, описывающий подготовку ядер клеток. После микродиссекции и ферментативной диссоциации сердечной ткани на отдельные клетки клетки-предшественники замораживали с последующим выделением чистых жизнеспособных клеток, которые использовали для секвенирования одноядерной РНК и одноядерного анализа на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным анализом секвенирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение ядер из клеток-предшественников сердца мышей для профилирования эпигенома и экспрессии генов при одноклеточном разрешении
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Развивающееся сердце представляет собой сложную структуру, содержащую различные клетки-предшественники, контролируемые сложными регуляторными механизмами. Изучение экспрессии генов и состояния хроматина отдельных клеток позволяет идентифицировать тип и состояние клеток. Подходы к секвенированию отдельных клеток выявили ряд важных характеристик гетерогенности клеток-предшественников сердца. Однако эти методы, как правило, ограничены свежей тканью, что ограничивает исследования с различными экспериментальными условиями, поскольку свежая ткань должна быть обработана сразу в одном и том же прогоне, чтобы уменьшить техническую изменчивость. Поэтому в этой области необходимы простые и гибкие процедуры для получения данных с помощью таких методов, как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq) и одноядерный анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (snATAC-seq). Здесь мы представляем протокол для быстрого выделения ядер для последующих одноядерных двойных омиков (комбинированные snRNA-seq и snATAC-seq). Этот метод позволяет выделять ядра из замороженных образцов клеток-предшественников сердца и может быть объединен с платформами, использующими микрофлюидные камеры.
Введение
Среди врожденных дефектов наиболее распространены врожденные пороки сердца (ВПС), встречающиеся примерно у 1% живорождений каждый год 1,2. Генетические мутации выявляются лишь в меньшинстве случаев, что означает, что в этиологии ИБС 2,3 участвуют другие причины, такие как нарушения регуляции генов. Развитие сердца представляет собой сложный процесс разнообразных и взаимодействующих типов клеток, что затрудняет идентификацию причинно-следственных некодирующих мутаций и их влияния на регуляцию генов. Органогенез сердца начинается с клеточных предшественн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедура на животных, принятая в этом исследовании, была одобрена комитетами по этике животных Университета Экс-Марсель (C2EA-14) и проводилась в соответствии с протоколами, утвержденными назначенным национальным этическим комитетом по экспериментам на животных (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Авторизация Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Настройка спаривания по времени перед вскрытием
- Чтобы получить эмбрионы мышей, выполните спаривание между взрослыми мышами за 9,5 дней до выделения области сердца. В этой процедуре использовались мыши дикого типа C57BL/6J в ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
По сравнению с приготовлением одноклеточных суспензий для одноклеточных подходов, приготовление одноядерных суспензий является гораздо более сложным и требует более высокой степени разрешения и обработки. Ключевым фактором успешного комбинирования snRNA-seq и snATAC-seq является чистая и неповрежденная суспензия ядер. Протокол эффективного выделения ядер должен быть адаптирован к каждому типу и состоянию ткани (свежей или замороженной). Здесь описан оптимизированный протокол выделения ядер из замороженных эмбриональных с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ клеточного состава развивающегося сердца с помощью комбинированных исследований snRNA-seq и snATAC-seq обеспечивает более глубокое понимание происхождения врожденных пороков сердца26. Несколько исследовательских лабораторий изучили влияние криоконсервации сердечной ткани на snRNA-seq27. Проведение snRNA-seq и snATAC-seq с использованием свежей микрорассеченной ткани из мышиных моделей заболеваний человека может быть логистически сложным при сравнении различных экспер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам раскрывать нечего.
Благодарности
Это исследование было поддержано ERA-CVD-2019 и ANR-JCJC-2020 SS. Мы благодарим Центр геномики и биоинформатики (GBiM) из лаборатории U 1251 / Marseille Medical Genetics и анонимных рецензентов за предоставленные ценные комментарии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2100 Биоанализатор Прибор | Agilent | No каталожный | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 наборов | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + пучок реагентов экспрессии генов, 4 rxn (включая буфер ядер 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Камеру подсчета клеток Countess | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No Каталожный номер | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | стерильный и безРНКазный |
| двойной индексный набор TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 мл конические центрифужные пробирки | Fisher Scientific | ||
| Falcon 50 мл конические центрифужные пробирки | Fisher Scientific | ||
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Термоинактивированный Высокочувствительный |
| набор ДНК | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ Набор для жизнеспособности/цитотоксичности | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Набор для удаления мертвых клеток: Микрогранулы Dead Cell Romoval, связывающий буфер 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartSits (30 & микро; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Хлорид магния (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS | Колонки Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No каталожного номера | |
| Пенициллин Стрептомицин (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40&микро; m | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Ингибитор горных пород | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Стандартная чашка Петри 90мм Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Стерильная вода двойной дистилляции | Thermofisher | R0582 | |
| Тризма гидрохлорид раствор (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Трипан Синий морилка (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Трипсин 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Наконечники для пипеток с широким отверстием и фильтром 200 мкм; l | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | Нет каталожного номера |
Ссылки
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
