Summary
Qui, presentiamo un protocollo che descrive la preparazione dei nuclei cellulari. Dopo la microdissezione e la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco in singole cellule, le cellule progenitrici sono state congelate, seguite dall'isolamento di cellule vitali pure, che sono state utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo e dal test a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con analisi di sequenziamento ad alto rendimento.
Abstract
Il cuore in via di sviluppo è una struttura complessa contenente varie cellule progenitrici controllate da complessi meccanismi di regolazione. L'esame dell'espressione genica e dello stato della cromatina delle singole cellule consente l'identificazione del tipo e dello stato cellulare. Gli approcci di sequenziamento a singola cellula hanno rivelato una serie di importanti caratteristiche dell'eterogeneità delle cellule progenitrici cardiache. Tuttavia, questi metodi sono generalmente limitati al tessuto fresco, il che limita gli studi con diverse condizioni sperimentali, poiché il tessuto fresco deve essere trattato contemporaneamente nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica. Pertanto, in quest'area sono necessarie procedure semplici e flessibili per produrre dati da metodi quali il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (snATAC-seq). Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei per i successivi nuclei singoli dual-omici (combinati snRNA-seq e snATAC-seq). Questo metodo consente l'isolamento di nuclei da campioni congelati di cellule progenitrici cardiache e può essere combinato con piattaforme che utilizzano camere microfluidiche.
Introduction
Tra i difetti alla nascita, i difetti cardiaci congeniti (CHD) sono i più comuni, che si verificano in circa l'1% dei nati vivi ogni anno 1,2. Le mutazioni genetiche sono identificate solo in una minoranza di casi, il che implica che altre cause, come anomalie nella regolazione genica, sono coinvolte nell'eziologia della CHD 2,3. Lo sviluppo cardiaco è un processo complesso di tipi cellulari diversi e interagenti, che rende difficile l'identificazione delle mutazioni causali non codificanti e dei loro effetti sulla regolazione genica. L'organogenesi del cuore inizia con progenitori cellulari che danno origine a diversi sottotipi di cellule cardiache, tra cui cellule miocardiche, fibroblasti, epicardiche ed endocardiche 4,5. La genomica unicellulare sta emergendo come metodo chiave per studiare lo sviluppo del cuore e valutare l'impatto dell'eterogeneità cellulare nella salute e nella malattia6. Lo sviluppo di metodi multi-omici per la misurazione simultanea di diversi parametri e l'espansione di pipeline computazionali ha facilitato la scoperta di tipi e sottotipi cellulari nel cuore normale e malato6. Questo articolo descrive un protocollo affidabile di isolamento a singolo nucleo per cellule progenitrici cardiache congelate ottenute da embrioni di topo che è compatibile con snRNA-seq e snATAC-seq a valle (così come snRNA-seq e snATAC-seq combinati)7,8,9.
ATAC-seq è un metodo robusto che consente l'identificazione delle regioni regolatorie della cromatina aperta e il posizionamento dei nucleosomi10,11. Queste informazioni vengono utilizzate per trarre conclusioni sulla posizione, l'identità e l'attività dei fattori di trascrizione. L'attività dei fattori cromatinici, compresi i rimodellatori, così come l'attività trascrizionale della RNA polimerasi, possono quindi essere analizzate poiché il metodo è altamente sensibile per misurare i cambiamenti quantitativi nella struttura della cromatina 1,2. Pertanto, ATAC-seq fornisce un approccio robusto e imparziale per scoprire i meccanismi che controllano la regolazione trascrizionale in un tipo specifico di cellula. I protocolli ATAC-seq sono stati anche validati per misurare l'accessibilità della cromatina in singole cellule, rivelando variabilità nell'architettura della cromatina all'interno delle popolazioni cellulari10,12,13.
Sebbene negli ultimi anni vi siano stati notevoli progressi nel campo delle singole cellule, la difficoltà principale è l'elaborazione dei campioni freschi necessari per eseguire questi esperimenti14. Per aggirare questa difficoltà, sono stati effettuati vari test con l'obiettivo di condurre analisi come snRNA-seq e snATAC-seq con tessuto cardiaco congelato o cellule15,16.
Diverse piattaforme sono state utilizzate per analizzare i dati genomici di singole cellule17. Le piattaforme ampiamente utilizzate per l'espressione genica di singole cellule e il profilo ATAC sono piattaforme per l'incapsulamento multiplo di goccioline microfluidiche17. Poiché queste piattaforme utilizzano camere microfluidiche, detriti o aggregati possono ostruire il sistema, con conseguente inutilizzabilità dei dati. Pertanto, il successo degli studi su singole cellule dipende dall'isolamento accurato delle singole cellule / nuclei.
Il protocollo qui presentato utilizza un approccio simile a studi recenti che utilizzano snRNA-seq e snATAC-seq per comprendere i difetti cardiaci congeniti 18,19,20,21,22,23. Questa procedura utilizza la dissociazione enzimatica del tessuto cardiaco appena microdissecato seguito dalla crioconservazione delle cellule progenitrici cardiache di topo. Dopo lo scongelamento, le cellule vitali vengono purificate e lavorate per l'isolamento nucleare. In questo lavoro, questo protocollo è stato utilizzato con successo per ottenere dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione nucleare di cellule progenitrici cardiache di topo.
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Protocol
La procedura animale adottata in questo studio è stata approvata dai comitati etici animali dell'Università di Aix-Marseille (C2EA-14) ed è stata eseguita secondo protocolli approvati dal comitato etico nazionale per la sperimentazione animale (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; Autorizzazione Apafis N°33927-2021111715507212).
1. Impostare l'accoppiamento temporizzato prima della dissezione
- Per generare embrioni di topo, eseguire un accoppiamento temporizzato tra topi adulti 9,5 giorni prima dell'isolamento della regione cardiaca. In questa procedura, sono stati utilizzati topi selvatici C57BL / 6J di età compresa tra 2 e 6 mesi e l'accoppiamento temporizzato è stato eseguito durante la notte.
- La mattina dopo, controlla se i topi femmina hanno un tappo vaginale. Si consideri il giorno in cui la spina viene identificata come giorno embrionale (E) 0,5.
2. Preparazione dei tessuti e isolamento cellulare
- Eutanasia C57BL/6J femmina incinta di 2-6 mesi al giorno 9,5 post-concepimento tramite CO2 con una concentrazione crescente seguita da lussazione cervicale. Pulire la parte inferiore dell'addome con etanolo al 70%.
NOTA: L'uso di anestetici prima della lussazione cervicale non è raccomandato in quanto ciò esporrebbe gli embrioni a cambiamenti ambientali che potrebbero influire sui successivi studi trascrittomici ed epigenomici. - Apri l'addome e il peritoneo con le forbici. Visualizza le corna uterine e usa una pinza per asportare entrambe le corna.
- Mettere le corna in una capsula di Petri contenente mezzo completo freddo con 1% FBS. Sebbene non sia richiesto un volume specifico, è necessario prestare attenzione per garantire che gli embrioni siano completamente immersi nel mezzo. Un volume approssimativo di 10 ml per capsula di Petri di 10 cm è appropriato.
- Sotto lo stereomicroscopio impostato a ingrandimento 5x e usando una pinza, rimuovere il tessuto endometriale, la placenta e il sacco vitellino da ciascun embrione.
- Mettere gli embrioni in una capsula di Petri con mezzo completo freddo con 1% FBS. Sezionare la regione cardiaca embrionale, come descritto sull'embrione schematico illustrato nella Figura 1, in mezzo completo a freddo.
- Raggruppa insieme le regioni cardiache sezionate da cinque embrioni di topo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Prechill centrifughe a tazze oscillanti a 4 °C.
- Centrifugare a 300x g per 1 minuto a RT in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere il surnatante e lavare i tessuti aggiungendo 1 ml di PBS per coltura tissutale.
- Centrifugare a 300 x g per 1 minuto a RT. Rimuovere il surnatante e ripetere i passaggi di lavaggio per un totale di due lavaggi. Ripetere il lavaggio due volte, sostituendo il PBS con tripsina/EDTA allo 0,05% (1x).
- Per la digestione dei tessuti, aggiungere 50 μL di tripsina/EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C. Applicare una leggera dissociazione meccanica dopo 5 minuti con gesti su e giù utilizzando una punta del filtro a orifizio largo.
- Inattivare l'attività di digestione della tripsina aggiungendo 350 μL di mezzo completo alle cellule dissociate. Far passare le cellule risospese attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
3. Conteggio delle cellule e valutazione della vitalità
NOTA: Il conteggio delle cellule e la vitalità sono parametri critici per il successo degli esperimenti su singole cellule. L'approccio snATAC-seq è sensibile a piccole variazioni nel numero di cellule. Troppe poche cellule portano a un'eccessiva digestione della cromatina, che si traduce in un numero maggiore di letture e nella mappatura di regioni di cromatina inaccessibili (rumore). Allo stesso modo, avere troppe cellule genera frammenti ad alto peso molecolare che sono difficili da sequenziare. Per la determinazione accurata delle concentrazioni di cellule e nuclei, il conteggio delle cellule e la vitalità sono stati valutati con due diversi metodi.
- Eseguire un test del blu tripano per il conteggio delle cellule, come descritto di seguito.
- Soluzione colorante al blu tripano allo 0,4%, centrifugare per 10 s a temperatura ambiente a 2.000 x g e trasferire 10 μL in un microtubo.
- Utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare e aggiungere 10 μL di sospensione ai 10 μL di soluzione di tripano blu già aliquotati. Mescolare accuratamente 10 volte con una pipetta.
- Trasferire 10 μL delle cellule colorate in un vetrino di conteggio. Posizionare il vetrino nel contatore per calcolare automaticamente la concentrazione e la vitalità della cella.
- Eseguire una valutazione della mortalità basata sulla fluorescenza come descritto di seguito.
NOTA: Questo test si basa sull'uso di coloranti fluorescenti (omodimero di etidio-1, EthD-1 e calceina AM) per valutare la vitalità cellulare. È stato utilizzato un kit disponibile in commercio e sono state seguite le istruzioni del fornitore per la preparazione e l'uso appropriati.- Preparare una soluzione di EthD-1 da 10 μM aggiungendo 5 μL della soluzione madre di 2 mM EthD-1 fornita a 1 mL di D-PBS sterile di grado di coltura tissutale e vortice per 5 s per garantire una miscelazione completa.
- Trasferire 2,5 μL della soluzione madre di calceina AM da 4 mM fornita alla soluzione di EthD-1 già preparata. Vortice per 5 s per garantire una miscelazione completa.
- Aggiungere 10 μL della soluzione di lavoro risultante di EthD-1 e 10 μM di calceina AM a 10 μL di sospensione cellulare.
NOTA: La calceina è altamente suscettibile all'idrolisi in soluzioni acquose, quindi utilizzare questa soluzione di lavoro entro 1 giorno. - Trasferire 10 μL delle cellule colorate su un vetrino di conteggio. Inserire il vetrino nel contatore automatico delle celle fluorescenti. Contare le celle vive usando un filtro GFP e le celle morte con un filtro RFP.
NOTA: I due metodi di conteggio hanno fornito conteggi cellulari e vitalità simili, e il numero totale di cellule appena dissociate è stato stimato in media intorno a 20.000 cellule per regione cardiaca embrionale (0,06 mm3).
4. Congelamento delle cellule
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante senza toccare il fondo del tubo e risospendere il pellet in 1 ml di mezzo di congelamento refrigerato.
- Trasferire la sospensione cellulare in un crioviale pre-raffreddato e posizionare il crioviale in un contenitore di congelamento pre-raffreddato.
- Posizionare il contenitore a -80 ◦C per 4-8 ore. Trasferire il crioviale in azoto liquido per esperimenti di sequenziamento a valle di RNA a singolo nucleo e ATAC.
NOTA: Il crioviale deve essere trasportato su ghiaccio secco prima dell'uso. Nella nostra esperienza, le cellule possono essere conservate in azoto liquido per almeno 6 mesi senza perdita di vitalità cellulare. La temperatura di conservazione deve essere mantenuta sempre al di sotto di -150 °C per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio.
5. Scongelamento delle cellule e rimozione delle cellule morte
- Mettere i crioviali a bagnomaria a 37 °C per 1-2 min. Rimuoverlo quando un piccolo cristallo rimane nel crioviale.
- Aggiungere 1 mL di mezzo completo preriscaldato (37 °C). Mescolare con una pipetta tre volte. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di mezzo completo caldo.
- Far passare l'intera sospensione cellulare su un filtro da 30 μm. Risciacquare il filtro con 1-2 ml di mezzo completo caldo e raccogliere il flusso nello stesso tubo conico.
- Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare una volta con PBS e trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 ml.
- Centrifugare a 300 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
- Aggiungere 100 μL delle microsfere magnetiche fornite alle celle pellettate e omogeneizzare cinque volte utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro. Incubare per 15 minuti a RT.
- Nel frattempo, sciacquare la colonna di separazione magnetica (capacità: 1 x 10da 7 a 2 x 108 celle) con 500 μL di 1x tampone legante.
- Una volta completata l'incubazione, diluire la sospensione cellulare contenente le microsfere con 500 μL di tampone legante 1x.
- Applicare la sospensione cellulare (0,6 μL) alla colonna di separazione magnetica preparata. Il flow-through è la frazione di cellule vive selezionata negativamente e la frazione trattenuta magneticamente è costituita dalle cellule morte selezionate positivamente.
- Raccogliere l'effluente della cella viva in una provetta da centrifuga da 15 ml. Risciacquare il microtubo da 1,5 mL che conteneva la sospensione cellulare e la colonna con 2 mL di tampone legante 1x e raccogliere l'effluente nello stesso tubo da 15 ml.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
- Aggiungere 1 mL della soluzione PBS-BSA e mescolare delicatamente mediante pipettaggio cinque volte utilizzando una punta per pipetta a orifizio largo. Trasferire la sospensione cellulare in un microtubo da 1,5 ml.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare.
- Aggiungere 1 mL di PBS-BSA per risospendere il pellet e ripetere la fase di lavaggio per un totale di due lavaggi.
- Risospendere le cellule in 100 μL di soluzione PBS-BSA. Mescolare delicatamente pipettando 10 volte.
- Determinare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando i metodi precedentemente descritti (fase 3.1 e fase 3.2). Per procedere al passaggio successivo, assicurarsi di un conteggio delle cellule di ≥100.000 cellule. Vedere la Figura 2 per i risultati rappresentativi.
NOTA: La crioconservazione comporta una perdita di circa il 40% del materiale di partenza iniziale delle cellule vive. A seconda del numero iniziale di celle, la separazione delle perle su una colonna magnetica si traduce in un'elevata vitalità cellulare, ma divide il numero totale di cellule da due a cinque volte. L'utilizzo di un kit magnetico a colonna per rimuovere le cellule morte è consigliato solo quando è disponibile materiale di partenza sufficiente.
6. Isolamento dei nuclei
NOTA: snATAC e snRNA-seq combinati vengono eseguiti con una sospensione di nuclei puliti e intatti. Si raccomanda l'ottimizzazione delle condizioni di lisi (tempo di lisi e concentrazione di NP40) per il tipo di cellula utilizzato. Il timepoint ottimale di lisi e la concentrazione del detergente sono quelli che determinano il massimo numero di cellule in lisatura senza interrompere la morfologia nucleare. La perdita di cellule/nuclei può essere ridotta utilizzando una centrifuga a secchio oscillante invece di una centrifuga ad angolo fisso. Per ridurre al minimo la ritenzione dei nuclei sulle materie plastiche, si consiglia di utilizzare puntali per pipette a bassa ritenzione e provette da centrifuga. Questo può aumentare il recupero dei nuclei. Il rivestimento delle punte delle pipette e delle provette da centrifuga con BSA al 5% è un'alternativa meno costosa ma più dispendiosa in termini di tempo.
- Pulire il luogo di lavoro e i materiali con una soluzione di rimozione di etanolo e RNasi al 70%.
- Prechill centrifughe a tazze oscillanti a 4 °C. Preparare il tampone di lisi, il tampone di diluizione di lisi, il tampone di lisi 0,1x e il tampone di lavaggio (vedere Tabella 1). Mantenere i buffer sul ghiaccio.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C in una centrifuga a secchio oscillante. Rimuovere delicatamente tutto il surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il pellet cellulare.
- Aggiungere 100 μL di tampone di lisi raffreddato 0,1x. Mescolare delicatamente pipettando 10 volte. Incubare per 5 minuti su ghiaccio.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio refrigerato e mescolare delicatamente mediante pipettaggio cinque volte. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet dei nuclei.
- Ripetere i lavaggi con tampone refrigerato per un totale di tre lavaggi. Preparare il tampone dei nuclei diluiti. Dopo la risospensione, mantenere la soluzione madre di nuclei su ghiaccio.
7. Valutazioni qualitative e quantitative dei nuclei isolati
NOTA: Sulla base della conta iniziale delle cellule e stimando circa il 50% della perdita di nuclei durante la lisi cellulare, risospendere il numero appropriato di cellule nel tampone dei nuclei diluiti a freddo. Il calcolo del volume di risospensione con tampone per nuclei diluiti refrigerati si basa sul recupero mirato dei nuclei e sulle corrispondenti concentrazioni di scorte di nuclei raccomandate dalla guida per l'utente del produttore. Si veda un esempio di questo calcolo nel protocollo addizionale 1.
- Sulla base del conteggio iniziale delle cellule e stimando circa il 50% della perdita di nuclei durante la lisi cellulare, risospendere il numero appropriato di cellule nel tampone dei nuclei diluiti a freddo.
- Determinare la concentrazione effettiva dei nuclei. Mescolare 2 μL di soluzione madre di nuclei con 8 μL di tampone per nuclei diluiti e aggiungere la miscela ai 10 μL pre-aliquotati di soluzione di lavoro di tripano blu o EthD-1/calceinAM. Contare i nuclei utilizzando un contatore di celle automatico. Meno del 5% delle cellule dovrebbe essere vitale. Vedere la Figura 3 per i risultati rappresentativi.
- Calcolare il volume dello stock di nuclei e il volume del tampone di nuclei diluiti per ottenere un volume totale di 5 μL alla concentrazione raccomandata per la reazione di trasposizione (fare riferimento alla guida per l'utente del produttore). Procedere immediatamente alla reazione di trasposizione secondo la guida per l'utente17.
NOTA: Tutte le fasi dalla reazione di trasposizione alla costruzione delle librerie ATAC e GEX sono state eseguite secondo la guida utente del kit utilizzato per snRNA-seq e snATAC-seq combinati17.
8. Analisi di qualità delle librerie snRNA-seq e snATAC-seq
- Prima di procedere al sequenziamento di nuova generazione, convalidare la qualità e la distribuzione dimensionale delle librerie finali snATAC-seq e GEX di espressione genica. Valutare la qualità e la quantità delle sequenze identificate nelle librerie utilizzando sistemi di analisi dei frammenti. Vedere la Figura 4 per i risultati rappresentativi della valutazione della qualità.
NOTA: La traccia finale delle librerie snATAC-seq dovrebbe mostrare la periodicità dell'avvolgimento del nucleosoma e le dimensioni dovrebbero variare da 200 bp a diversi Kbp, mentre le dimensioni nella libreria di espressione genica dovrebbero variare da 300 bp a 600 bp.
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Representative Results
Rispetto alla preparazione di sospensioni a singola cellula per approcci a singola cellula, la preparazione di sospensioni a nucleo singolo è molto più impegnativa e richiede un grado più elevato di risoluzione ed elaborazione. Il fattore chiave per il successo combinato di snRNA-seq e snATAC-seq è una sospensione di nuclei puliti e intatti. Il protocollo per un isolamento efficiente dei nuclei deve essere adattato a ciascun tipo di tessuto e condizione (fresco o congelato). Qui viene descritto un protocollo ottimizzato per l'isolamento dei nuclei da cellule cardiache embrionali di topo congelate. Tutti i passaggi dalla dissezione della regione cardiaca embrionale e dalla dissociazione delle cellule cardiache all'isolamento dei nuclei sono riassunti nella Figura 1. Per il materiale di partenza, si raccomanda un conteggio delle cellule di 1 x 105-1 x 106 cellule e una vitalità cellulare >70% per un isolamento efficiente dei nuclei. Come mostrato nella Figura 2, il passaggio aggiuntivo eseguito in questo protocollo per ordinare e rimuovere le cellule morte dopo lo scongelamento ha permesso di ottenere una sospensione cellulare più pulita con una vitalità cellulare significativamente più elevata e di migliorare la qualità del campione di partenza. Oltre all'isolamento dei nuclei, questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come valutare la qualità e la quantità dei nuclei isolati (Figura 3). La qualità dei nuclei isolati influisce notevolmente sulla qualità dei dati combinati snRNA-seq e snATAC-seq; Qui, la qualità dei nuclei isolati è stata valutata dalla valutazione della morfologia della membrana nucleare. I nuclei isolati apparivano lisci e uniformemente rotondi, come mostrato in Figura 3C, al microscopio a campo chiaro, indicando un efficace processo di isolamento. Per una maggiore precisione, sono stati utilizzati due diversi metodi di conteggio, tra cui il blu di tripano e un kit per la valutazione della vitalità basata sulla fluorescenza, per quantificare le cellule e i nuclei. Il saggio di fluorescenza è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare in base all'integrità cellulare e all'attività dell'esterasi intracellulare. Questa soluzione colorante consente di distinguere le cellule vive dalle cellule morte visualizzando simultaneamente la calceina fluorescente verde AM, che indica l'attività dell'esterasi intracellulare, e l'omodimero fluorescente di etidio rosso 1, che riflette la perdita di integrità cellulare. L'uso di un colorante fluorescente per il conteggio aiuta a distinguere i nuclei da grumi e detriti cellulari. Utilizzando questo protocollo, la vitalità cellulare è passata dall'80% -90% prima dell'isolamento dei nuclei al <5% dopo l'isolamento dei nuclei, come mostrato nella Figura 3A,B.
La nostra procedura è stata confrontata con il metodo esistente, che prevede il congelamento del tessuto fresco direttamente in azoto liquido e l'esecuzione della fase di lisatura senza previa dissociazione enzimatica (protocollo supplementare 2 e figura supplementare 1). Entrambi gli approcci sono stati testati per determinare quale metodo fornisce una sospensione di nuclei di migliore qualità. Il congelamento istantaneo dell'intero tessuto cardiaco embrionale ha dato origine a un'alta percentuale di cellule non lisate rilevate come vive, indicando una lisi cellulare inappropriata (Figura supplementare 1A). Sono stati osservati aggregati e cellule non individuali nonostante la filtrazione attraverso filtri (Figura supplementare 1A,B).
I nuclei isolati sono stati utilizzati per generare librerie per snATAC-seq e snRNA-seq congiunti. La Figura 4 illustra i risultati del controllo di qualità del cDNA utilizzato per la costruzione della libreria di espressione genica (GEX) e della libreria ATAC. Il controllo di qualità è stato eseguito utilizzando l'elettroforesi automatizzata (Figura 5A). I cDNA derivati dall'mRNA sono stati quantificati e la resa è stata sufficiente per il successivo utilizzo nella costruzione della libreria GEX. Sono state ottenute una libreria GEX di alta qualità che va da ~300 bp a 600 bp e una libreria ATAC di alta qualità con avvolgimento periodico del nucleosoma che va da 200 bp a 7 kbp. Queste librerie sono state sequenziate mediante sequenziamento ad alto rendimento e hanno generato con successo l'espressione genica del singolo nucleo e l'accessibilità alla cromatina (Figura 5A). Questi dati grezzi erano pronti per essere demultiplexati e analizzati bioinformaticamente per generare profili trascrizionali ed epigenetici delle cellule progenitrici cardiache E9.5 del topo. SnRNA-seq e snATAC-seq sono stati raggruppati, identificati ed etichettati sulla base di geni marcatori noti utilizzando clustering non supervisionato con il toolkit Seurat per la genomica singola24 . Questa analisi iniziale ha confermato la presenza di tutti i tipi di cellule cardiache attesi a E9.5 (Figura 5B).
Tutti i risultati di cui sopra supportano il successo di questo protocollo nell'isolamento di nuclei adatti per approcci a singoli nuclei a valle da cellule cardiache embrionali congelate.
Figura 1: Rappresentazione delle fasi principali nella preparazione del campione per il profilo combinato di snRNA-seq e snATAC-seq. Questo diagramma di flusso riassume tutti i passaggi, tra cui la dissezione del tessuto cardiaco e la dissociazione delle cellule cardiache, il congelamento e lo scongelamento delle cellule, la purificazione delle cellule vive rimuovendo le cellule morte e l'isolamento dei nuclei, che vengono effettuati per la rilevazione simultanea dell'accessibilità di mRNA e cromatina dalla stessa cellula. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; BSA = albumina sierica bovina; RT = temperatura ambiente. Creato con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Viabilità delle celle scongelate ottimizzate dopo la selezione delle cellule morte. Immagini che mostrano il conteggio delle cellule e la vitalità utilizzando un contatore automatico delle cellule prima (in alto) e dopo (in basso) la rimozione delle cellule morte utilizzando il colorante di esclusione del blu tripano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Controllo di qualità della preparazione dei nuclei. (A,B) Immagini che mostrano il conteggio delle cellule e la vitalità utilizzando un contatore automatico delle cellule prima (in alto) e dopo (in basso) l'isolamento dei nuclei. Sono stati utilizzati due metodi di conteggio: (A) il saggio di mortalità fluorescente e (B) il saggio del blu tripano. (C) Immagini che mostrano la qualità dell'isolamento dei nuclei. Le immagini sono state scattate a 20x (barra di scala = 50 μm) utilizzando microscopia a campo chiaro e fluorescenza. L'immagine in campo chiaro (a sinistra) mostra la morfologia nucleare; la RFP (al centro) mostra le cellule che hanno perso la loro integrità di membrana, in altre parole, nuclei isolati; e la GFP (a destra) che normalmente indica l'attività esterasi delle cellule vive qui conferma l'assenza di cellule vive nella sospensione dei nuclei. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Controllo di qualità dell'espressione genica monocellulare e delle librerie ATAC. Analisi del DNA con elettroforesi automatizzata che mostra la qualità e la distribuzione dimensionale del cDNA (in alto), della libreria GEX (al centro) e della libreria ATAC (in basso). Per la quantificazione del cDNA, è stata selezionata la zona compresa tra 200 bp e 8.900 bp e il bioanalizzatore ha stimato la concentrazione di cDNA (in pg / μL; cerchio rosso). È stata ottenuta una resa di cDNA sufficiente per procedere con la costruzione della libreria GEX. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Prestazioni del campione valutate con il software Cell Ranger25. (A) Grafico della sensibilità incrociata che mostra gli eventi di trasposizione in picchi per codice a barre sull'asse x e identificatori molecolari univoci (UMI) di RNA per codice a barre sull'asse y. Come previsto, le cellule si trovano principalmente nell'angolo in alto a destra, con alti dati di RNA e ATAC. È stata osservata una netta separazione tra le cellule e le non cellule (GEM vuoti, segnale di fondo). (B) Grafico UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) rappresentativo di tutte le cellule catturate in scRNA-seq (a sinistra) e scATAC-seq (a destra) colorate per identità del cluster e raggruppate in base ai tipi di cellule. È stata osservata una buona separazione dei cluster. I dati grezzi congiunti di GEX e ATAC sono stati ottenuti dal sequenziamento di 7.000 nuclei dalla regione cardiaca embrionale del topo E9.5 sezionata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Controllo di qualità dell'isolamento dei nuclei dal metodo esistente che comporta il congelamento del tessuto fresco direttamente in azoto liquido. (A) Immagini che mostrano il conteggio dei nuclei isolati utilizzando un contatore automatico di cellule e il blu di tripano come colorante di esclusione prima (in alto) e dopo (in basso) la filtrazione attraverso un filtro da 40 μm. Un'alta percentuale di cellule non lisate è stata rilevata come viva. Il rilevamento del 20% di cellule vive indica una lisi cellulare inappropriata. Le frecce nere indicano gli aggregati. (B) Immagini che mostrano la qualità dei nuclei isolati. Le immagini sono state scattate a 20x (superiore e centrale con una barra di scala di 50 μm) e 40x (in basso con una barra di scala di 25 μm) utilizzando microscopia a campo chiaro e fluorescenza. L'immagine in campo chiaro (a sinistra) mostra la morfologia nucleare; la RFP (a destra) mostra le cellule che hanno perso la loro integrità di membrana, in altre parole, nuclei isolati. Le frecce nere indicano multipli di nuclei attaccati da detriti. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella 1: Tabella dei buffer e delle soluzioni utilizzate nella procedura. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Protocollo addizionale 1: Valutazione della quantità dei nuclei isolati. Clicca qui per scaricare questo file.
Protocollo complementare n. 2: Isolamento dei nuclei da tessuto congelato. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'analisi della composizione cellulare del cuore in via di sviluppo mediante studi combinati snRNA-seq e snATAC-seq fornisce una comprensione più profonda dell'origine della cardiopatia congenita26. Diversi laboratori di ricerca hanno studiato gli effetti della crioconservazione dei tessuti cardiaci sull'snRNA-seq27. Condurre snRNA-seq e snATAC-seq utilizzando tessuto fresco micro-sezionato da modelli murini di malattia umana può essere logisticamente impegnativo quando si confrontano diverse condizioni sperimentali. Per un dato stadio di sviluppo, una difficoltà è che i gruppi di controllo e sperimentali devono essere elaborati nello stesso ciclo per ridurre la variabilità tecnica introdotta dall'elaborazione del campione. Quando la lavorazione di tessuti freschi non è possibile, si raccomanda, in base ai nostri risultati, di dissociare e quindi crioconservare piuttosto che congelare a scatto l'intero tessuto cardiaco embrionale. La scelta di un metodo rispetto all'altro si basa sul fatto che se il tessuto cardiaco è congelato intero, isolare singole cellule vitali dopo lo scongelamento è molto più impegnativo. Tuttavia, se il protocollo di dissociazione tissutale non è ottimizzato, potrebbe essere meglio congelare l'intero tessuto. La dissociazione seguita dalla crioconservazione è preferibile dato che questo protocollo di dissociazione tissutale produce il >90% di cellule vitali fresche senza bias del tipo di cellula.
Questo approccio ha diversi vantaggi, come l'uso di cellule congelate, che elimina la necessità di tessuto fresco, e l'uso di una fase di dissociazione unicellulare, che consente l'isolamento di singoli nuclei intatti; In effetti, questo è fondamentale per l'analisi a valle di una singola cella. Tuttavia, la dissociazione enzimatica può indurre bias trascrizionale nelle popolazioni cellulari. La dissociazione enzimatica delle cellule interferisce con il microambiente cellulare e, quindi, induce cambiamenti trascrizionali nella maggior parte dei tipi cellulari28. Il determinante principale di questi cambiamenti è il tempo di dissociazione, non il tipo di cellula29. Per moderare gli artefatti indotti dalla dissociazione è importante seguire il tempo di digestione raccomandato. La letteratura pubblicata in diversi tessuti indica che un tempo di digestione di 30 minuti o meno induce lievi cambiamenti trascrizionali28,30. Inoltre, gli interventi bioinformatici potrebbero essere utilizzati per ridurre al minimo le distorsioni dei dati31,32.
Ottenere singoli nuclei puri e intatti è il fattore più importante nella genomica a singolo nucleo. L'intasamento delle camere microfluidiche delle piattaforme monocellulari dovuto alla presenza di cluster cellulari o detriti organici porta a una scarsa qualità dei dati o, più problematicamente, a un fallimento sperimentale. In questa procedura, i protocolli esistenti sono stati modificati combinando la dissociazione enzimatica, la crioconservazione e la purificazione delle cellule progenitrici cardiache vitali. La nostra procedura consente l'isolamento di nuclei puri senza la necessità di selezionare FACS. Utilizzando questa procedura, abbiamo ottenuto una sospensione nucleare di alta qualità senza aggregazione, quasi senza detriti e singoli nuclei intatti. La fase di isolamento cellulare è fondamentale per evitare potenziali aggregazioni dei nuclei; In effetti, questo può essere evitato con un pipettaggio delicato utilizzando punte di pipette di grandi dimensioni o filtrando i nuclei. L'uso di filtri in diverse fasi e la successiva osservazione al microscopio ottico possono prevenire tali problemi.
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato con successo per la profilazione di snRNA-seq e snATAC-seq dalla stessa preparazione di nuclei ottenuta da cellule progenitrici cardiache E9.5. Questo metodo può essere utilizzato in topi selvatici in gravidanza rispetto a modelli murini per difetti cardiaci congeniti. I difetti cardiaci congeniti si verificano probabilmente a causa dell'interruzione delle vie che controllano la differenziazione, la moltiplicazione, la migrazione e la sopravvivenza delle cellule progenitrici cardiache33,34. Per comprendere meglio l'origine di questi difetti, questo studio si è concentrato specificamente sullo stadio embrionale 9.5, in cui sono presenti i progenitori delle principali aree colpite da difetti cardiaci congeniti, in particolare i progenitori cardiaci del secondo campo cardiaco11 e della cresta neurale35. L'applicazione di questa procedura alle cellule del cuore di topo adulto e del cuore umano richiede l'ottimizzazione del protocollo, in particolare in termini di fasi di dissociazione cellulare e lisi.
Le considerazioni principali tra il conteggio manuale e automatizzato delle celle sono i costi, la manodopera e l'accuratezza. I contatori automatici sono più veloci della maggior parte degli scienziati esperti che eseguono un conteggio manuale. Soprattutto quando si tratta di un gran numero di campioni, è di grande beneficio poter semplicemente premere conteggio e visualizzare il risultato. Questo è un punto importante perché una volta isolati i nuclei, devono essere elaborati rapidamente per evitare la perdita della loro integrità. Il principale vantaggio di accuratezza dei sistemi automatizzati è che questi sistemi eliminano la variabilità tra utenti o laboratori. Un altro vantaggio è che i sistemi automatizzati hanno in genere un campo visivo più ampio rispetto agli emocitometri. Quando il numero di cellule/nuclei o la concentrazione delle cellule/nuclei sono inferiori, questo campo visivo più ampio è certamente un vantaggio rispetto al metodo manuale tradizionale.
Un'alta percentuale di contaminazione del DNA mitocondriale può essere osservata quando la concentrazione del detergente non ionico è troppo elevata. Diminuendo la sua concentrazione nel tampone di lisi, questa contaminazione può essere ridotta senza diminuire la resa dei nuclei. I risultati più soddisfacenti sono stati ottenuti nei nostri esperimenti con un tampone di lisi contenente lo 0,1% di detergente. Girare i nuclei in un secchio oscillante può anche ridurre il numero di mitocondri nel pellet.
Avere un rapporto appropriato tra Tn5 trasposasi e nuclei è fondamentale per il successo di snATAC-seq13,14. Ad esempio, avere troppo Tn5 può portare a uno sfondo elevato a causa della cromatina chiusa e della bassa complessità delle librerie di sequenziamento, mentre la sub-lisi potrebbe non risultare in una libreria completa amplificata da PCR13. Per determinare con precisione il numero di nuclei, abbiamo usato due metodi complementari.
I set di dati di omica multimodale offrono l'opportunità di studiare più livelli di organizzazione genomica contemporaneamente 9,36. L'approccio multimodale congiunto di RNA e ATAC consente lo studio dei regolatori a monte e dei geni metabolici a valle e fornisce un approccio completo per lo studio delle reti trascrizionali e dell'architettura della cromatina nel contesto dello sviluppo cardiaco alla risoluzione di una singola cellula. Questo protocollo per l'isolamento di singoli nuclei è compatibile con la valutazione individuale e congiunta dei set di dati di espressione e cromatina. L'accessibilità della cromatina è un importante livello epigenetico di regolazione perché consente l'attività dei regolatori trascrizionali in specifici siti genomici 8,9,10,11,12,13. Una moltitudine di informazioni sull'identità e sui siti target di dozzine di possibili fattori di trascrizione sono, quindi, fornite dalla sequenza del DNA nel profilo della cromatina. Il confronto delle informazioni ottenute da snATAC-seq con il profilo di espressione di snRNA può aiutare a identificare i fattori di trascrizione più rilevanti, che possono poi essere ulteriormente analizzati da Cut&Run37. Speriamo che questa procedura aiuti i ricercatori interessati e li incoraggi a utilizzare questo potente metodo per le loro ricerche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da ERA-CVD-2019 e ANR-JCJC-2020 a SS. Ringraziamo la struttura di genomica e bioinformatica (GBiM) del laboratorio di genetica medica U 1251 / Marsiglia e i revisori anonimi per aver fornito preziosi commenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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