Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65328
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 1
1Center for Cardiovascular Disease & Nutrition, U1263, Aix-Marseille University, 2Marseille Medical Genetics, U1251, Aix-Marseille University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف تحضير نوى الخلية. بعد التشريح المجهري والتفكك الأنزيمي للأنسجة القلبية إلى خلايا مفردة ، تم تجميد الخلايا السلفية ، تليها عزل الخلايا النقية القابلة للحياة ، والتي تم استخدامها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تحليلات تسلسل عالية الإنتاجية.

Abstract

القلب النامي هو هيكل معقد يحتوي على خلايا سلفية مختلفة تتحكم فيها آليات تنظيمية معقدة. يسمح فحص التعبير الجيني وحالة الكروماتين للخلايا الفردية بتحديد نوع الخلية وحالتها. كشفت مناهج تسلسل الخلية الواحدة عن عدد من الخصائص المهمة لعدم تجانس الخلايا السلفية القلبية. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرق بشكل عام على الأنسجة الطازجة ، مما يحد من الدراسات ذات الظروف التجريبية المتنوعة ، حيث يجب معالجة الأنسجة الطازجة مرة واحدة في نفس الجري لتقليل التباين التقني. لذلك ، هناك حاجة إلى إجراءات سهلة ومرنة لإنتاج البيانات من طرق مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ومقايسة النواة المفردة للكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة transposase مع تسلسل عالي الإنتاجية (snATAC-seq) في هذا المجال. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل النوى بسرعة للنواة المزدوجة أحادية النوى اللاحقة (الجمع بين snRNA-seq و snATAC-seq). تسمح هذه الطريقة بعزل النوى من العينات المجمدة للخلايا السلفية القلبية ويمكن دمجها مع المنصات التي تستخدم غرف الموائع الدقيقة.

Introduction

من بين العيوب الخلقية ، عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي الأكثر شيوعا ، وتحدث في حوالي 1٪ من المواليد الأحياء كلعام 1,2. يتم تحديد الطفرات الجينية في أقلية فقط من الحالات ، مما يعني أن الأسباب الأخرى ، مثل التشوهات في تنظيم الجينات ، متورطة في مسببات أمراض القلبالتاجية 2,3. تطور القلب هو عملية معقدة من أنواع الخلايا المتنوعة والمتفاعلة ، مما يجعل تحديد الطفرات السببية غير المشفرة وتأثيراتها على تنظيم الجينات أمرا صعبا. يبدأ تكوين الأعضاء في القلب بالسلف الخلوي الذي يؤدي إلى ظهور أنواع فرعية مختلفة من خلايا القلب ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب والخلايا الليفية وخلايا القلب والشغاف 4,5. يظهر علم الجينوم أحادي الخلية كطريقة رئيسية لدراسة نمو القلب وتقييم تأثير عدم التجانس الخلوي في الصحة والمرض6. سهل تطوير طرق متعددة الأوميكس للقياس المتزامن للمعلمات المختلفة وتوسيع خطوط الأنابيب الحسابية اكتشاف أنواع الخلايا والأنواع الفرعية في القلب الطبيعي والمريض6. توضح هذه المقالة بروتوكول عزل أحادي النواة موثوق به للخلايا السلفية القلبية المجمدة التي تم الحصول عليها من أجنة الفئران المتوافقة مع snRNA-seq و snATAC-seq (بالإضافة إلى snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة)7،8،9.

ATAC-seq هي طريقة قوية تسمح بتحديد مناطق الكروماتين المفتوحة التنظيمية ووضع النيوكليوسومات10,11. تستخدم هذه المعلومات لاستخلاص استنتاجات حول موقع عوامل النسخ وهويتها ونشاطها. وبالتالي ، يمكن تحليل نشاط عوامل الكروماتين ، بما في ذلك أجهزة إعادة التشكيل ، وكذلك نشاط النسخ لبوليميراز الحمض النووي الريبي ، لأن الطريقة حساسة للغاية لقياس التغيرات الكمية في بنية الكروماتين 1,2. وبالتالي ، يوفر ATAC-seq نهجا قويا ومحايدا للكشف عن الآليات التي تتحكم في تنظيم النسخ في نوع معين من الخلايا. كما تم التحقق من صحة بروتوكولات ATAC-seq لقياس إمكانية الوصول إلى الكروماتين في الخلايا المفردة ، مما يكشف عن التباين في بنية الكروماتين داخل مجموعات الخلايا10،12،13.

على الرغم من حدوث تقدم ملحوظ في مجال الخلايا المفردة في السنوات الأخيرة ، إلا أن الصعوبة الرئيسية تكمن في معالجة العينات الجديدة اللازمة لإجراء هذه التجارب14. للتحايل على هذه الصعوبة ، تم إجراء اختبارات مختلفة بهدف إجراء تحليلات مثل snRNA-seq و snATAC-seq مع أنسجة أو خلايا القلب المجمدة15,16.

تم استخدام العديد من المنصات لتحليل بيانات الجينوم أحادية الخلية17. المنصات المستخدمة على نطاق واسع للتعبير الجيني أحادي الخلية وتنميط ATAC هي منصات لتغليف قطرات الموائع الدقيقةالمتعددة 17. نظرا لأن هذه المنصات تستخدم غرف الموائع الدقيقة ، يمكن للحطام أو الركام أن يسد النظام ، مما يؤدي إلى بيانات غير قابلة للاستخدام. وبالتالي ، فإن نجاح دراسات الخلية الواحدة يعتمد على العزل الدقيق للخلايا / النوى الفردية.

يستخدم البروتوكول المقدم هنا نهجا مشابها للدراسات الحديثة باستخدام snRNA-seq و snATAC-seq لفهم عيوب القلب الخلقية18،19،20،21،22،23. يستخدم هذا الإجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة القلب التي تم تشريحها حديثا متبوعا بالحفظ بالتبريد للخلايا السلفية القلبية للفئران. بعد ذوبان الجليد ، يتم تنقية الخلايا القابلة للحياة ومعالجتها للعزل النووي. في هذا العمل ، تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للحصول على بيانات snRNA-seq و snATAC-seq من نفس التحضير النووي للخلايا السلفية القلبية للفأر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراء الحيواني المعتمد في هذه الدراسة من قبل لجان أخلاقيات الحيوان بجامعة إيكس مرسيليا (C2EA-14) وتم تنفيذه وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية الوطنية المعينة للتجارب على الحيوانات (Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; تفويض Apafis رقم 33927-2021111715507212).

1. إعداد التزاوج الموقوت قبل التشريح

  1. لتوليد أجنة الفئران ، قم بإجراء تزاوج محدد الوقت بين الفئران البالغة قبل 9.5 أيام من عزل منطقة القلب. في هذا الإجراء ، تم استخدام الفئران من النوع البري C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 2-6 أشهر ، وتم إجراء التزاوج الموقوت بين عشية وضحاها.
  2. في صباح اليوم التالي ، تحقق مما إذا كانت الفئران الإناث لديها سدادة مهبلية. ضع في اعتبارك اليوم الذي يتم فيه تحديد القابس على أنه يوم جنيني (E) 0.5.

2. تحضير الأنسجة وعزل الخلايا

  1. القتل الرحيم للإناث الحوامل C57BL / 6J البالغة من العمر 2-6 أشهر في اليوم 9.5 بعد الحمل عبر ثاني أكسيد الكربون2 مع تركيز متزايد يليه خلع عنق الرحم. تنظيف الجزء السفلي من البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام التخدير قبل خلع عنق الرحم لأن هذا من شأنه أن يعرض الأجنة للتغيرات البيئية التي يمكن أن تؤثر على الدراسات النسخية وفوق الجينية اللاحقة.
  2. افتح البطن والبريتوني بالمقص. تصور قرون الرحم ، واستخدام ملقط لاستئصال كلا القرنين.
  3. ضع القرون في طبق بتري يحتوي على وسط بارد كامل مع 1٪ FBS. على الرغم من عدم الحاجة إلى حجم محدد ، يجب توخي الحذر لضمان غمر الأجنة تماما في الوسط. حجم تقريبي من 10 مل لكل طبق بتري 10 سم مناسب.
  4. تحت المجهر المجسم المحدد عند التكبير 5x واستخدام الملقط ، قم بإزالة أنسجة بطانة الرحم والمشيمة وكيس الصفار من كل جنين.
  5. ضع الأجنة في طبق بتري مع وسط كامل بارد مع 1٪ FBS. تشريح منطقة القلب الجنينية ، كما هو موضح في الجنين التخطيطي الموضح في الشكل 1 ، في وسط كامل بارد.
  6. تجمع معا مناطق القلب التي تم تشريحها من خمسة أجنة فئران في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي دلو التأرجح Prechill إلى 4 °C.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300× ز لمدة 1 دقيقة في RT في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح. إزالة طاف ، وغسل الأنسجة عن طريق إضافة 1 مل من PBS درجة زراعة الأنسجة.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 1 دقيقة في RT. قم بإزالة المادة الطافية ، وكرر خطوات الغسيل لما مجموعه غسلتين. كرر الغسيل مرتين ، مع استبدال PBS ب 0.05٪ تربسين / EDTA (1x).
  9. لهضم الأنسجة، أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين/إيديتا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ضع تفككا ميكانيكيا لطيفا بعد 5 دقائق عن طريق الإيماءات لأعلى ولأسفل باستخدام طرف مرشح واسع الفتحة.
  10. قم بتعطيل نشاط هضم التربسين عن طريق إضافة 350 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى الخلايا المنفصلة. مرر الخلايا المعاد تعليقها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.

3. عد الخلايا وتقييم الجدوى

ملاحظة: يعد عدد الخلايا وقابليتها للحياة معلمات حاسمة لنجاح تجارب الخلية الواحدة. نهج snATAC-seq حساس للاختلافات الطفيفة في رقم الخلية. يؤدي عدد قليل جدا من الخلايا إلى الإفراط في هضم الكروماتين ، مما يؤدي إلى عدد أكبر من القراءات ورسم خرائط لمناطق الكروماتين التي يتعذر الوصول إليها (الضوضاء). وبالمثل ، فإن وجود عدد كبير جدا من الخلايا يولد شظايا عالية الوزن الجزيئي يصعب تسلسلها. من أجل التحديد الدقيق لتركيزات الخلية والنوى ، تم تقييم عدد الخلايا وصلاحيتها بطريقتين مختلفتين.

  1. قم بإجراء اختبار التريبان الأزرق لعد الخلايا ، كما هو موضح أدناه.
    1. دوامة 0.4٪ محلول تلطيخ أزرق تريبان ، تدور لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة عند 2000 × جم ، وتنقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب صغير.
    2. باستخدام ماصة ، امزج تعليق الخلية ، وأضف 10 ميكرولتر من التعليق إلى 10 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق المقتبس بالفعل. تخلط بعناية 10 مرات مع ماصة.
    3. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا الملطخة إلى شريحة العد. ضع الشريحة في العداد لحساب تركيز الخلية وصلاحيتها تلقائيا.
  2. قم بإجراء تقييم قائم على التألق للوفيات كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يعتمد هذا الفحص على استخدام الأصباغ الفلورية (ethidium homodimer-1 و EthD-1 و calcein AM) لتقييم صلاحية الخلية. واستخدمت مجموعة أدوات متاحة تجاريا، واتبعت تعليمات مقدم الخدمة من أجل الإعداد والاستخدام المناسبين.
    1. قم بإعداد محلول EthD-1 10 ميكرومتر عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من محلول مخزون EthD-1 2 mM المزود إلى 1 مل من D-PBS من درجة زراعة الأنسجة المعقمة ، ودوامة لمدة 5 ثوان لضمان الخلط الكامل.
    2. انقل 2.5 ميكرولتر من محلول مخزون الكالسيين AM 4 مللي متر المزود إلى محلول EthD-1 المعد بالفعل. دوامة لمدة 5 ثوان لضمان الخلط الكامل.
    3. أضف 10 ميكرولتر من محلول العمل الناتج 10 ميكرومتر EthD-1 و 10 ميكرومتر Calcein AM إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
      ملاحظة: الكالسيين شديد التأثر بالتحلل المائي في المحاليل المائية ، لذلك استخدم محلول العمل هذا في غضون 1 يوم.
    4. انقل 10 ميكرولتر من الخلايا الملطخة إلى شريحة العد. أدخل الشريحة في عداد الخلايا الفلورية الآلي. عد الخلايا الحية باستخدام مرشح GFP والخلايا الميتة باستخدام مرشح RFP.
      ملاحظة: أعطت طريقتا العد عددا مماثلا للخلايا وقابلية للحياة ، وقدر العدد الإجمالي للخلايا المنفصلة حديثا بحوالي 20000 خلية لكل منطقة قلب جنينية (0.06 مم3).

4. تجميد الخلايا

  1. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون لمس قاع الأنبوب ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط التجميد المبرد.
  2. انقل تعليق الخلية إلى كريوفيال مبرد مسبقا ، وضع المبرد في وعاء تجميد مبرد مسبقا.
  3. ضع الحاوية في -80 درجة مئوية لمدة 4 ساعات إلى 8 ساعات. نقل cryovial إلى النيتروجين السائل لتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة و ATAC.
    ملاحظة: يجب نقل المبرد على الثلج الجاف قبل الاستخدام. في تجربتنا ، يمكن تخزين الخلايا في النيتروجين السائل لمدة 6 أشهر على الأقل دون فقدان صلاحية الخلية. يجب أن تبقى درجة حرارة التخزين أقل من -150 درجة مئوية في جميع الأوقات لمنع تكوين بلورات الثلج.

5. ذوبان الخلايا وإزالة الخلايا الميتة

  1. ضع الكريوفيال في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة. قم بإزالته عندما تبقى بلورة صغيرة في cryovial.
  2. أضف 1 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). تخلط مع ماصة ثلاث مرات. انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من الوسط الكامل الدافئ.
  3. مرر تعليق الخلية بالكامل على مصفاة 30 ميكرومتر. شطف مصفاة مع 1-2 مل من وسط كامل دافئ ، وجمع التدفق في نفس الأنبوب المخروطي.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، وإزالة طاف. اغسل مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية دون تعطيل بيليه الخلية.
  6. أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات المغناطيسية المتوفرة إلى الخلايا المحببة ، وقم بالتجانس خمس مرات باستخدام طرف ماصة عريض التجويف. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  7. في غضون ذلك ، شطف عمود الفصل المغناطيسي (السعة: 1 × 107 إلى 2 × 108 خلايا) مع 500 ميكرولتر من 1x عازلة ملزمة.
  8. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بتخفيف تعليق الخلية الذي يحتوي على الميكروبيدات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1x.
  9. ضع تعليق الخلية (0.6 ميكرولتر) على عمود الفصل المغناطيسي المعد. التدفق من خلال هو جزء الخلية الحية المختار سالبا ، والجزء المحتفظ به مغناطيسيا هو الخلايا الميتة المختارة بشكل إيجابي.
  10. اجمع النفايات السائلة للخلايا الحية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اشطف الأنبوب الصغير سعة 1.5 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية والعمود ب 2 مل من المخزن المؤقت للربط 1x ، واجمع النفايات السائلة في نفس الأنبوب سعة 15 مل.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية.
  12. أضف 1 مل من محلول PBS-BSA ، واخلطه برفق عن طريق سحب خمس مرات باستخدام طرف ماصة عريض الفتحة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية.
  14. أضف 1 مل من PBS-BSA لإعادة تعليق الحبيبات ، وكرر خطوة الغسيل لما مجموعه غسلتين.
  15. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول PBS-BSA. تخلط برفق عن طريق سحب الماصة 10 مرات.
  16. تحديد تركيز الخلايا وصلاحيتها باستخدام الطرق الموصوفة سابقا (الخطوة 3.1 والخطوة 3.2). للمتابعة إلى الخطوة التالية ، تأكد من أن عدد الخلايا يبلغ ≥100000 خلية. انظر الشكل 2 للاطلاع على النتائج التمثيلية.
    ملاحظة: يؤدي الحفظ بالتبريد إلى فقدان ما يقرب من 40٪ من المواد الأولية الأولية للخلايا الحية. اعتمادا على عدد الخلايا الأولية ، يؤدي فصل الخرزة على عمود مغناطيسي إلى قابلية عالية للبقاء للخلية ولكنه يقسم العدد الإجمالي للخلايا بمقدار ضعفين إلى خمسة أضعاف. ينصح باستخدام مجموعة مغناطيسية قائمة على العمود لإزالة الخلايا الميتة فقط عند توفر مواد أولية كافية.

6. عزل النوى

ملاحظة: يتم تنفيذ snATAC و snRNA-seq مجتمعة مع تعليق نوى نظيفة وسليمة. يوصى بتحسين ظروف التحلل (وقت التحلل وتركيز NP40) لنوع الخلية المستخدم. النقطة الزمنية المثلى للتحلل وتركيز المنظفات هي تلك التي تؤدي إلى تحليل أكبر عدد ممكن من الخلايا دون تعطيل التشكل النووي. يمكن تقليل فقدان الخلايا / النوى باستخدام جهاز طرد مركزي دلو متأرجح بدلا من جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية. لتقليل احتباس النوى على البلاستيك ، يوصى باستخدام أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظ وأنابيب الطرد المركزي. هذا يمكن أن يزيد من استعادة النوى. يعد طلاء أطراف الماصة وأنابيب الطرد المركزي بنسبة 5٪ BSA بديلا أقل تكلفة ولكنه يستغرق وقتا طويلا.

  1. نظف مكان العمل والمواد باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول إزالة RNase.
  2. أجهزة الطرد المركزي دلو التأرجح Prechill إلى 4 °C. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل حديثا ، والمخزن المؤقت لتخفيف التحلل ، والمخزن المؤقت للتحلل 0.1x ، والمخزن المؤقت للغسيل (انظر الجدول 1). الحفاظ على المخازن المؤقتة على الجليد.
  3. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. قم بإزالة كل المادة الطافية برفق دون لمس قاع الأنبوب لتجنب إزاحة حبيبات الخلية.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل المبرد 0.1x. تخلط بلطف عن طريق سحب 10 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
  5. أضف 1 مل من محلول الغسيل المبرد ، واخلطه برفق عن طريق السحب خمس مرات. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات النوى.
  6. كرر الغسلات باستخدام عازل غسيل مبرد لما مجموعه ثلاث غسلات. تحضير العازلة نوى مخففة. بعد التعليق ، احتفظ بمحلول مخزون النوى على الجليد.

7. تقييمات الجودة والكمية للنوى المعزولة

ملاحظة: استنادا إلى العدد الأولي للخلايا وتقدير فقدان النوى بنسبة 50٪ تقريبا أثناء تحلل الخلية، أعد تعليق العدد المناسب من الخلايا في المخزن المؤقت للنوى المخففة على البارد. يعتمد حساب حجم إعادة التعليق باستخدام المخزن المؤقت للنوى المخففة المبردة على استعادة النوى المستهدفة وتركيزات مخزون النوى المقابلة الموصى بها في دليل مستخدم الشركة المصنعة. انظر مثالا على هذا الحساب في البروتوكول التكميلي 1.

  1. استنادا إلى عدد الخلايا الأولي وتقدير ما يقرب من 50٪ من فقدان النوى أثناء تحلل الخلية ، أعد تعليق العدد المناسب من الخلايا في المخزن المؤقت للنوى المخففة على البارد.
  2. تحديد تركيز النوى الفعلي. امزج 2 ميكرولتر من محلول مخزون النوى مع 8 ميكرولتر من محلول النوى المخفف وأضف المزيج إلى 10 ميكرولتر من محلول العمل الأزرق المريبان أو EthD-1 / calceinAM. عد النوى باستخدام عداد خلية آلي. أقل من 5٪ من الخلايا يجب أن تكون قابلة للحياة. انظر الشكل 3 للاطلاع على النتائج التمثيلية.
  3. احسب حجم مخزون النوى وحجم المخزن المؤقت للنوى المخففة للحصول على حجم إجمالي قدره 5 ميكرولتر عند التركيز الموصى به لتفاعل التبديل (راجع دليل مستخدم الشركة المصنعة). انتقل فورا إلى تفاعل التحويل وفقا لدليل المستخدم17.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات من تفاعل التحويل إلى إنشاء مكتبات ATAC و GEX وفقا لدليل المستخدم للمجموعة المستخدمة في snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة17.

8. تحليل جودة مكتبات snRNA-seq و snATAC-seq

  1. قبل الانتقال إلى تسلسل الجيل التالي ، تحقق من صحة توزيع الجودة والحجم لمكتبات snATAC-seq النهائية والتعبير الجيني GEX. تقييم جودة وكمية التسلسلات المحددة في المكتبات باستخدام أنظمة تحليل الشظايا. انظر الشكل 4 للاطلاع على نتائج تقييم الجودة التمثيلية.
    ملاحظة: يجب أن يظهر التتبع النهائي لمكتبات snATAC-seq دورية لف النيوكليوسوم ، ويجب أن تتراوح الأحجام من 200 bp إلى عدة Kbp ، بينما يجب أن تتراوح الأحجام في مكتبة التعبير الجيني من 300 bp إلى 600 bp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بالمقارنة مع إعداد معلقات أحادية الخلية لنهج الخلية الواحدة ، فإن إعداد معلقات أحادية النوى أكثر صعوبة ويتطلب درجة أعلى من الدقة والمعالجة. العامل الرئيسي لنجاح snRNA-seq و snATAC-seq هو تعليق نوى نظيف وسليم. يجب تكييف بروتوكول عزل النوى الفعال مع كل نوع من الأنسجة وحالتها (طازجة أو مجمدة). هنا ، يتم وصف بروتوكول محسن لعزل النوى من خلايا القلب الجنينية للفأر المجمدة. يلخص الشكل 1 جميع الخطوات من تشريح المنطقة القلبية الجنينية وتفكك الخلايا القلبية إلى عزل النوى. بالنسبة للمادة الأولية ، يوصى بعدد خلايا 1 × 105-1 × 106 خلايا وصلاحية الخلية >70٪ لعزل النوى بكفاءة. كما هو موضح في الشكل 2 ، فإن الخطوة الإضافية التي يتم إجراؤها في هذا البروتوكول لفرز الخلايا الميتة وإزالتها بعد الذوبان سمحت بالحصول على معلق خلية أنظف مع صلاحية أعلى بكثير للخلية ولتحسين جودة عينة البداية. بالإضافة إلى عزل النوى، يوفر هذا البروتوكول معلومات مفصلة حول كيفية تقييم نوعية وكمية النوى المعزولة (الشكل 3). تؤثر جودة النوى المعزولة بشكل كبير على جودة البيانات المجمعة snRNA-seq و snATAC-seq ؛ هنا ، تم تقييم جودة النوى المعزولة من خلال تقييم مورفولوجيا الغشاء النووي. بدت النوى المعزولة ناعمة ومستديرة بشكل موحد ، كما هو موضح في الشكل 3C ، تحت المجهر برايت فيلد ، مما يشير إلى عملية عزل فعالة. لمزيد من الدقة ، تم استخدام طريقتين مختلفتين للعد ، بما في ذلك التريبان الأزرق ومجموعة للتقييم القائم على الفلورة للصلاحية ، لتحديد كمية الخلايا والنوى. تم استخدام مقايسة التألق لتحديد صلاحية الخلية بناء على السلامة الخلوية ونشاط الإستراز داخل الخلايا. يسمح محلول الصبغة هذا بتمييز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة عن طريق تصور الكالسيين الفلوري الأخضر AM في وقت واحد ، مما يشير إلى نشاط الإستراز داخل الخلايا ، والإيثيديوم الفلوري الأحمر homodimer 1 ، والذي يعكس فقدان السلامة الخلوية. يساعد استخدام صبغة الفلورسنت للعد على تمييز النوى عن كتل الخلايا والحطام. باستخدام هذا البروتوكول ، انتقلت صلاحية الخلية من 80٪ -90٪ قبل عزل النوى إلى <5٪ بعد عزل النوى ، كما هو موضح في الشكل 3 أ ، ب.

تمت مقارنة الإجراء الخاص بنا بالطريقة الحالية ، والتي تتضمن تجميد الأنسجة الطازجة مباشرة في النيتروجين السائل وإجراء خطوة التحلل دون تفكك إنزيمي مسبق (البروتوكول التكميلي 2 والشكل التكميلي 1). تم اختبار كلا النهجين لتحديد الطريقة التي تعطي تعليقا أفضل جودة للنواة. أدى التجميد المفاجئ للأنسجة القلبية الجنينية الكاملة إلى ظهور نسبة عالية من الخلايا غير المحللة التي تم اكتشافها على أنها حية ، مما يشير إلى تحلل الخلايا غير المناسب (الشكل التكميلي 1 أ). لوحظت الركام والخلايا غير الفردية على الرغم من الترشيح من خلال المرشحات (الشكل التكميلي 1 أ ، ب).

تم استخدام النوى المعزولة لتوليد مكتبات ل snATAC-seq المشترك و snRNA-seq. يوضح الشكل 4 نتائج مراقبة الجودة ل cDNA المستخدم في بناء مكتبة التعبير الجيني (GEX) ومكتبة ATAC. تم إجراء مراقبة الجودة باستخدام الكهربائي الآلي (الشكل 5 أ). تم تحديد كمية الحمض النووي cDNA المشتق من mRNA ، وكان العائد كافيا للاستخدام اللاحق في بناء مكتبة GEX. تم الحصول على مكتبة GEX عالية الجودة تتراوح من ~ 300 bp إلى 600 bp ومكتبة ATAC عالية الجودة مع لف نيوكليوسوم دوري يتراوح من 200 bp إلى 7 kbp. تم تسلسل هذه المكتبات عن طريق التسلسل عالي الإنتاجية وولدت بنجاح التعبير الجيني أحادي النواة وإمكانية الوصول إلى الكروماتين (الشكل 5 أ). كانت هذه البيانات الأولية جاهزة لفك تعدد الإرسال وتحليلها المعلوماتية الحيوية لتوليد التنميط النسخي واللاجيني للخلايا السلفية القلبية E9.5 للفأر. تم تجميع SnRNA-seq و snATAC-seq وتحديدهما وتصنيفهما بناء على جينات العلامات المعروفة باستخدام التجميع غير الخاضع للإشراف مع مجموعة أدوات Seurat لعلم الجينوم الفردي24 . أكد هذا التحليل الأولي وجود جميع أنواع خلايا القلب المتوقعة عند E9.5 (الشكل 5B).

تدعم جميع النتائج المذكورة أعلاه نجاح هذا البروتوكول في عزل النوى المناسبة لنهج النوى المفردة النهائية من خلايا القلب الجنينية المجمدة.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل الخطوات الرئيسية في تحضير العينة للتنميط المشترك snRNA-seq و snATAC-seq. يلخص هذا المخطط الانسيابي جميع الخطوات ، بما في ذلك تشريح أنسجة القلب وتفكك خلايا القلب ، وتجميد الخلايا وذوبانها ، وتنقية الخلايا الحية عن طريق إزالة الخلايا الميتة ، وعزل النوى ، التي يتم إجراؤها للكشف المتزامن عن إمكانية الوصول إلى mRNA والكروماتين من نفس الخلية. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ BSA = ألبومين مصل البقر ؛ RT = درجة حرارة الغرفة. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صلاحية الخلايا المذابة المحسنة بعد فرز الخلايا الميتة. صور توضح عدد الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد خلية آلي قبل (أعلى) وبعد (أسفل) إزالة الخلايا الميتة باستخدام صبغة استبعاد التريبان الزرقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مراقبة جودة تحضير النوى. (أ ، ب) صور توضح عدد الخلايا وصلاحيتها باستخدام عداد خلية آلي قبل عزل النوى (العلوي) وبعده (السفلي). تم استخدام طريقتين للعد: (أ) مقايسة الوفيات الفلورية و (ب) مقايسة التريبان الأزرق. ج: صور توضح جودة عزل النوى. تم التقاط الصور بمعدل 20x (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) باستخدام المجهر الساطع والفلوري. تظهر صورة برايتفيلد (على اليسار) التشكل النووي. يظهر RFP (الأوسط) الخلايا التي فقدت سلامة غشائها ، وبعبارة أخرى ، نوى معزولة ؛ و GFP (يمين) الذي يشير عادة إلى نشاط الإستراز للخلايا الحية هنا يؤكد عدم وجود خلايا حية في تعليق النوى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مراقبة جودة التعبير الجيني أحادي الخلية ومكتبات ATAC. تحليل الحمض النووي مع الرحلان الكهربائي الآلي الذي يوضح توزيع جودة وحجم cDNA (أعلى) ومكتبة GEX (وسط) ومكتبة ATAC (أسفل). بالنسبة للقياس الكمي ل cDNA ، تم اختيار المنطقة التي تتراوح من 200 bp إلى 8,900 bp ، وقدر المحلل الحيوي تركيز cDNA (في pg / μL ؛ الدائرة الحمراء). تم الحصول على عائد cDNA كاف للمضي قدما في بناء مكتبة GEX. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تم تقييم أداء العينة باستخدام برنامج Cell Ranger25. (أ) مخطط الحساسية المتقاطعة الذي يوضح أحداث التحويل في القمم لكل رمز شريطي على المحور السيني والمعرفات الجزيئية الفريدة للحمض النووي الريبي (UMIs) لكل رمز شريطي على المحور ص. كما هو متوقع ، توجد الخلايا بشكل أساسي في الزاوية العلوية اليمنى ، مع بيانات عالية من الحمض النووي الريبي و ATAC. لوحظ فصل واضح بين الخلايا وغير الخلايا (GEMs الفارغة ، إشارة الخلفية). (ب) مخطط تمثيلي موحد للتقريب والإسقاط (UMAP) لجميع الخلايا الملتقطة في scRNA-seq (يسار) و scATAC-seq (يمين) ملونة حسب هوية الكتلة ومجمعة بناء على أنواع الخلايا. لوحظ فصل جيد للمجموعات. تم الحصول على البيانات الخام المشتركة GEX و ATAC من تسلسل 7000 نواة من منطقة القلب الجنيني للفأر E9.5 التي تم تشريحها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مراقبة جودة عزل النوى عن الطريقة الحالية التي تتضمن تجميد الأنسجة الطازجة مباشرة في النيتروجين السائل. (أ) صور توضح عدد النوى المعزولة باستخدام عداد خلية آلي وأزرق تريبان كصبغة استبعاد قبل الترشيح (العلوي) وبعده (السفلي) من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. تم الكشف عن نسبة عالية من الخلايا غير المحللة على أنها حية. يشير اكتشاف 20٪ من الخلايا الحية إلى تحلل الخلايا غير المناسب. تشير الأسهم السوداء إلى المجاميع. ب: صور توضح نوعية النوى المعزولة. تم التقاط الصور بمعدل 20 ضعفا (أعلى ووسط بشريط مقياس 50 ميكرومتر) و 40 ضعفا (أسفل بشريط مقياس 25 ميكرومتر) باستخدام المجهر الساطع والفلوري. تظهر صورة برايتفيلد (على اليسار) التشكل النووي. يظهر RFP (يمين) الخلايا التي فقدت سلامة غشائها ، وبعبارة أخرى ، نوى معزولة. تشير الأسهم السوداء إلى مضاعفات النوى المرتبطة بالحطام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول 1: جدول المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في الإجراء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

البروتوكول التكميلي 1: تقييم كمية النوى المعزولة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

البروتوكول التكميلي 2: عزل النوى من الأنسجة المجمدة فلاش. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر تحليل التركيب الخلوي للقلب النامي من خلال دراسات snRNA-seq و snATAC-seq مجتمعة فهما أعمق لأصل أمراض القلب الخلقية26. درست العديد من مختبرات الأبحاث آثار حفظ أنسجة القلب بالتبريد على snRNA-seq27. يمكن أن يكون إجراء snRNA-seq و snATAC-seq باستخدام أنسجة تشريح دقيقة جديدة من نماذج الفئران للأمراض البشرية أمرا صعبا من الناحية اللوجستية عند مقارنة الظروف التجريبية المختلفة. بالنسبة لمرحلة معينة من التطوير ، تتمثل إحدى الصعوبات في أنه يجب معالجة المجموعات الضابطة والتجريبية في نفس المدى لتقليل التباين التقني الناتج عن معالجة العينات. عندما تكون معالجة الأنسجة الطازجة غير ممكنة ، يوصى ، بناء على نتائجنا ، بفصل الأنسجة القلبية الجنينية بأكملها ثم حفظها بالتبريد بدلا من تجميدها المفاجئ. يعتمد اختيار طريقة واحدة على الأخرى على حقيقة أنه إذا تم تجميد أنسجة القلب بالكامل ، فإن عزل الخلايا المفردة القابلة للحياة بعد الذوبان يكون أكثر صعوبة. ومع ذلك ، إذا لم يتم تحسين بروتوكول تفكك الأنسجة ، فقد يكون من الأفضل تجميد الأنسجة بالكامل. يفضل التفكك متبوعا بالحفظ بالتبريد نظرا لأن بروتوكول تفكك الأنسجة هذا ينتج >90٪ خلايا جديدة قابلة للحياة بدون تحيز لنوع الخلية.

هذا النهج له فوائد عديدة ، مثل استخدام الخلايا المجمدة ، مما يلغي الحاجة إلى الأنسجة الطازجة ، واستخدام خطوة تفكك الخلية الواحدة ، والتي تسمح بعزل نوى واحدة سليمة ؛ في الواقع ، هذا أمر بالغ الأهمية لتحليل الخلية المفردة النهائية. ومع ذلك ، قد يؤدي التفكك الأنزيمي إلى التحيز النسخي في مجموعات الخلايا. يتداخل تفكك الخلايا الأنزيمية مع البيئة المكروية الخلوية ، وبالتالي يؤدي إلى تغييرات نسخية في معظم أنواع الخلايا28. المحدد الأساسي لهذه التغييرات هو وقت التفكك ، وليس نوع الخلية29. لتخفيف القطع الأثرية التي يسببها التفكك ، من المهم اتباع وقت الهضم الموصى به. تشير الأدبيات المنشورة في الأنسجة المتنوعة إلى أن وقت الهضم البالغ 30 دقيقة أو أقل يؤدي إلى تغييرات طفيفة في النسخ28,30. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تدخلات المعلوماتية الحيوية لتقليل تشوهات البيانات31,32.

يعد الحصول على نوى مفردة نقية وسليمة أهم عامل في علم الجينوم أحادي النواة. يؤدي انسداد غرف الموائع الدقيقة لمنصات الخلية الواحدة بسبب وجود مجموعات الخلايا أو الحطام العضوي إلى ضعف جودة البيانات أو ، بشكل أكثر إشكالية ، إلى فشل تجريبي. في هذا الإجراء ، تم تعديل البروتوكولات الحالية من خلال الجمع بين التفكك الأنزيمي ، والحفظ بالتبريد ، وتنقية الخلايا السلفية القلبية القابلة للحياة. يسمح الإجراء الخاص بنا بعزل النوى النقية دون الحاجة إلى فرز FACS. باستخدام هذا الإجراء ، حصلنا على تعليق نووي عالي الجودة بدون تكتل ، ولا يوجد حطام تقريبا ، ونوى مفردة سليمة. خطوة عزل الخلية ضرورية لتجنب تكتل النوى المحتمل. في الواقع ، يمكن تجنب ذلك عن طريق السحب اللطيف باستخدام أطراف ماصة كبيرة أو عن طريق تصفية النوى. يمكن أن يمنع استخدام المرشحات في خطوات مختلفة والمراقبة اللاحقة تحت المجهر الضوئي مثل هذه المشكلات.

تم استخدام البروتوكول الموصوف هنا بنجاح في التنميط snRNA-seq و snATAC-seq من نفس إعداد النوى التي تم الحصول عليها من الخلايا السلفية القلبية E9.5. يمكن استخدام هذه الطريقة في الفئران البرية الحوامل مقابل نماذج الفئران لعيوب القلب الخلقية. من المحتمل أن تحدث عيوب القلب الخلقية بسبب اضطراب المسارات التي تتحكم في تمايز الخلايا السلفية القلبية وتكاثرها وهجرتها وبقائها على قيد الحياة33,34. لفهم أصل هذه العيوب بشكل أفضل ، ركزت هذه الدراسة بشكل خاص على المرحلة الجنينية 9.5 ، حيث توجد أسلاف المناطق الرئيسية المتأثرة بعيوب القلب الخلقية ، ولا سيما أسلاف القلب في مجال القلب الثاني11 والقمة العصبية35. يتطلب تطبيق هذا الإجراء على خلايا قلب الفأر البالغ وقلب الإنسان تحسين البروتوكول ، لا سيما فيما يتعلق بخطوات تفكك الخلايا وتحللها.

الاعتبارات الرئيسية بين عد الخلايا اليدوي والآلي هي التكاليف والعمالة والدقة. العدادات الآلية أسرع من معظم العلماء المهرة الذين يقومون بالعد اليدوي. خاصة عند التعامل مع عدد كبير من العينات ، من المفيد جدا أن تكون قادرا على الضغط ببساطة على العد وعرض النتيجة. هذه نقطة مهمة لأنه بمجرد عزل النوى ، يجب معالجتها بسرعة لتجنب فقدان سلامتها. تتمثل فائدة الدقة الأساسية للأنظمة الآلية في أن هذه الأنظمة تقضي على التباين بين المستخدمين أو المختبرات. ميزة أخرى هي أن الأنظمة الآلية عادة ما يكون لها مجال رؤية أكبر من أجهزة قياس الدم. عندما يكون عدد الخلايا / النوى أو تركيز الخلايا / النوى أقل ، فإن مجال الرؤية الأكبر هذا هو بالتأكيد ميزة على الطريقة اليدوية التقليدية.

يمكن ملاحظة نسبة عالية من تلوث الحمض النووي للميتوكوندريا عندما يكون تركيز المنظف غير الأيوني مرتفعا جدا. من خلال تقليل تركيزه في مخزن التحلل ، يمكن تقليل هذا التلوث دون تقليل عائد النوى. تم الحصول على النتائج الأكثر إرضاء في تجاربنا مع مخزن مؤقت للتحلل يحتوي على 0.1٪ منظف. يمكن أن يؤدي تدوير النوى في دلو متأرجح أيضا إلى تقليل عدد الميتوكوندريا في الحبيبات.

يعد وجود نسبة مناسبة من ترانسبوزاز Tn5 إلى النوى أمرا بالغ الأهمية لنجاح snATAC-seq13,14. على سبيل المثال ، قد يؤدي وجود الكثير من Tn5 إلى خلفية عالية بسبب الكروماتين المغلق وانخفاض تعقيد مكتبات التسلسل ، في حين أن التحلل الفرعي قد لا يؤدي إلى مكتبة كاملة لتضخيم PCR13. لتحديد عدد النوى بدقة، استخدمنا طريقتين متكاملتين.

توفر مجموعات بيانات omics متعددة الوسائط الفرصة للتحقيق في مستويات متعددة من التنظيم الجينومي في وقت واحد 9,36. يتيح النهج متعدد الوسائط المشترك للحمض النووي الريبي و ATAC دراسة منظمات المنبع والجينات الأيضية النهائية ويوفر نهجا شاملا لدراسة شبكات النسخ وبنية الكروماتين في سياق تطور القلب بدقة الخلية الواحدة. يتوافق هذا البروتوكول الخاص بعزل النوى الواحدة مع كل من التقييم الفردي والمشترك لمجموعات بيانات التعبير والكروماتين. تعد إمكانية الوصول إلى الكروماتين مستوى مهما من التنظيم اللاجيني لأنه يتيح نشاط منظمات النسخ في مواقع جينومية محددة8،9،10،11،12،13. وبالتالي ، يتم توفير العديد من المعلومات حول الهوية والمواقع المستهدفة لعشرات عوامل النسخ المحتملة من خلال تسلسل الحمض النووي في ملف تعريف الكروماتين. يمكن أن تساعد مقارنة المعلومات التي تم الحصول عليها بواسطة snATAC-seq مع تنميط تعبير snRNA في تحديد عوامل النسخ الأكثر صلة ، والتي يمكن بعد ذلك تحليلها بشكل أكبر بواسطة Cut &Run37. نأمل أن يساعد هذا الإجراء الباحثين المهتمين ويشجعهم على استخدام هذه الطريقة القوية لأبحاثهم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل ERA-CVD-2019 و ANR-JCJC-2020 إلى SS. نشكر مرفق علم الجينوم والمعلوماتية الحيوية (GBiM) من مختبر U 1251 / Marseille Medical Genetics والمراجعين المجهولين على تقديم تعليقات قيمة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent No catalog number
5M Sodium chloride (NaCl) Sigma 59222C-500ML 
BSA 10%  Sigma A1595-50ML
Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000230
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) 10X Genomics 1000285
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess III FL Thermofisher No catalog number
Digitonin (5%) Thermofisher BN2006
DMSO Sigma D2650-5x5ML
DNA LoBind Tubes  Eppendorf 22431021
D-PBS Thermofisher 14190094 Sterile and RNase-free
Dual Index Kit TT Set A 96 rxns 10X Genomics 1000215
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  352096
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  10788561
HI-FBS Thermofisher A3840001 Heat inactivated
High sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Igepal CA-630 Sigma I8896-50ML
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher L3224
MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X Miltenyi Biotec 130-090-101
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M1028-100ML
Milieu McCoy 5A  Thermofisher 16600082
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
NovaSeq 6000 S2 Illumina No catalog number
Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) Thermofisher 15070063
PluriStrainer Mini 40µm PluriSelect V-PM15-2021-12
Rock inhibitor Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005
Single Index Kit N Set A, 96 rxn 10X Genomics 1000212
Standard 90mm Petri dish Sterilin Thermofisher 101R20
Sterile double-distilled water Thermofisher R0582
Trizma Hydrochloride solution (HCl) Sigma T2194-100ML 
Trypan Blue stain (0.4%) Invitrogen T10282
Trypsin 0.05% - EDTA 1X Thermofisher 25300054
Tween20 Sigma P9416-50ML 
Wide orifice filtered pipette tips 200 μl Labcon 1152-965-008-9
ZEISS SteREO Discovery.V8 ZEISS No catalog number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  2. Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
  3. Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
  4. Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).
  5. Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. Development of the human heart. American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).
  6. Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
  7. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  8. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  9. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
  11. Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
  12. Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
  13. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  14. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  15. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
  16. Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
  17. 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
  18. Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
  19. Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
  20. Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
  21. Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
  22. Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
  23. Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
  24. Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
  25. What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
  26. Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
  27. Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
  28. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
  29. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  30. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  31. Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
  32. Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
  33. Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
  34. Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
  35. Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
  36. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
  37. Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 195 ، إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، تنميط التعبير الجيني ، snRNA-seq و snATAC-seq ، الخلايا السلفية القلبية ، تنظيم الجينات
عزل النوى من الخلايا السلفية القلبية للفأر من أجل التنميط فوق الجينوم والتعبير الجيني بدقة خلية واحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibrahim, S., Robert, C., Humbert,… More

Ibrahim, S., Robert, C., Humbert, C., Ferreira, C., Collod, G., Stefanovic, S. Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution. J. Vis. Exp. (195), e65328, doi:10.3791/65328 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter