Summary
ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。
Abstract
発達中の心臓は、複雑な調節機構によって制御される様々な前駆細胞を含む複雑な構造である。個々の細胞の遺伝子発現とクロマチン状態の検査は、細胞の種類と状態の識別を可能にします。シングルセルシーケンシングアプローチは、心臓前駆細胞の不均一性の多くの重要な特性を明らかにしました。ただし、これらの方法は一般に新鮮な組織に限定されており、技術的なばらつきを減らすために新鮮な組織を同じ実行で一度に処理する必要があるため、多様な実験条件での研究が制限されます。したがって、この分野では、一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、ハイスループットシーケンシングを備えたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの一核アッセイ(snATAC-seq)などの方法からデータを生成するための簡単で柔軟な手順が必要です。ここでは、後続の単一核デュアルオミクス(snRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)のために核を迅速に分離するためのプロトコルを紹介します。この方法は、心臓前駆細胞の凍結サンプルからの核の単離を可能にし、マイクロ流体チャンバーを使用するプラットフォームと組み合わせることができます。
Introduction
先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD 2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています6。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました6。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-seq(およびsnRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)と互換性のある信頼性の高い単核単細胞分離プロトコルについて説明します7,8,9。
ATAC-seqは、調節オープンクロマチン領域の同定とヌクレオソームの位置決めを可能にする堅牢な方法です10,11。この情報は、転写因子の位置、同一性、および活性に関する結論を引き出すために使用されます。リモデリング剤を含むクロマチン因子の活性、およびRNAポリメラーゼの転写活性は、クロマチン構造の定量的変化を測定するのに非常に感度が高いため、分析することができます1,2。したがって、ATAC-seqは、特定の細胞型における転写調節を制御するメカニズムを明らかにするための堅牢で公平なアプローチを提供します。ATAC-seqプロトコルは、単一細胞におけるクロマチンアクセシビリティを測定するためにも検証されており、細胞集団内のクロマチン構造のばらつきを明らかにしています10、12、13。
近年、単一細胞の分野で顕著な進歩がありましたが、主な困難は、これらの実験を実行するために必要な新鮮なサンプルの処理です14。この困難を回避するために、凍結心臓組織または細胞を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqなどの分析を行うことを目的として様々な試験が実施されてきた15,16。
シングルセルゲノミクスデータを解析するために、いくつかのプラットフォームが使用されてきた17。単一細胞遺伝子発現およびATACプロファイリングに広く使用されているプラットフォームは、複数のマイクロ流体液滴カプセル化のためのプラットフォームです17。これらのプラットフォームはマイクロ流体チャンバーを使用しているため、破片や凝集物がシステムを詰まらせ、データが使用できなくなる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、個々の細胞/核の正確な分離にかかっています。
ここで紹介するプロトコルは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqを使用した最近の研究と同様のアプローチを使用して、先天性心疾患を理解しています18、19、20、21、22、23。この手順では、新たにマイクロ解剖された心臓組織の酵素解離とそれに続くマウス心臓前駆細胞の凍結保存を利用します。解凍後、生細胞は精製され、核分離のために処理されます。この研究では、このプロトコルを使用して、マウス心臓前駆細胞の同じ核製剤からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを取得することに成功しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究で採用された動物の手順は、エクスマルセイユ大学の動物倫理委員会(C2EA-14)によって承認され、指定された動物実験のための国家倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。認可アパフィスN°33927-2021111715507212)。
1.解剖前の時限交配の設定
- マウス胚を作製するには、心臓領域単離の9.5日前に成体マウス間で時限交配を行う。この手順では、生後2〜6か月の野生型C57BL/6Jマウスを使用し、一晩で時限交配を行いました。
- 翌朝、雌のマウスに膣栓があるかどうかを確認します。プラグが胎児の日(E)0.5として識別された日を考えてみましょう。
2.組織調製と細胞分離
- 妊娠後9.5日目に生後2〜6か月の妊娠中の女性C57BL / 6JをCO2を介して安楽死させ、濃度を上げてから子宮頸部脱臼を行います。腹部の下部を70%エタノールできれいにします。
注:子宮頸部脱臼の前に麻酔薬を使用することは、その後のトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に影響を与える可能性のある環境変化に胚をさらすため、推奨されません。 - 腹部と腹膜をハサミで開きます。子宮角を視覚化し、鉗子を使用して両方の角を切除します。
- 1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に角を置きます。特定の容量は必要ありませんが、胚が培地に完全に浸されるように注意する必要があります。10cmのペトリ皿あたり約10mLの容量が適切です。
- 倍率5倍に設定した実体顕微鏡下で、鉗子を使用して、各胚から子宮内膜組織、胎盤、および卵黄嚢を取り除きます。
- 胚を1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に入れる。胚性心臓領域を、 図1に例示した概略胚に記載されるように、低温完全培地中で解剖する。
- 5匹のマウス胚から解剖した心臓領域を1.5 mLの微量遠心チューブにまとめてプールします。スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。
- スイングバケット遠心分離機でRTで1分間、300x g で遠心分離します。上清を除去し、組織培養グレードのPBSを1 mL加えて組織を洗浄します。
- 300 x g でRTで1分間遠心分離し、上清を取り除き、洗浄手順を繰り返して合計2回の洗浄を行います。洗浄を2回繰り返し、PBSを0.05%トリプシン/ EDTA(1x)に置き換えます。
- 組織消化のために、50 μLの0.25%トリプシン/EDTAを37°Cで10分間加えます。 ワイドオリフィスフィルターチップを使用した上下のジェスチャーにより、5分後に穏やかな機械的解離を適用します。
- トリプシン消化活性を不活性化するには、解離した細胞に350 μLの完全培地を添加します。再懸濁した細胞を40 μmの細胞ストレーナーに通します。
3.細胞カウントと生存率評価
注:細胞数と生存率は、単一細胞実験の成功にとって重要なパラメータです。snATAC-seqアプローチは、細胞数のわずかな変動に敏感です。細胞が少なすぎるとクロマチンが過剰に消化され、リード数が多くなり、アクセスできないクロマチン領域(ノイズ)がマッピングされます。同様に、細胞が多すぎると、配列決定が困難な高分子量の断片が生成されます。細胞および核濃度を正確に決定するために、細胞数および生存率を2つの異なる方法で評価した。
- 以下に説明するように、細胞計数のためのトリパンブルーアッセイを実行します。
- 0.4%トリパンブルー染色溶液をボルテックスし、室温2,000 x gで10秒間スピンし、10 μLをマイクロチューブに移します。
- ピペットを使用して細胞懸濁液を混合し、すでに分注された10 μLのトリパンブルー溶液に10 μLの懸濁液を加えます。ピペットで10回慎重に混合します。
- 染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドをカウンターに入れると、細胞濃度と生存率が自動的に計算されます。
- 以下に説明するように、蛍光ベースの死亡率評価を実行します。
注:このアッセイは、細胞生存率を評価するための蛍光色素(エチジウムホモ二量体-1、EthD-1、およびカルセインAM)の使用に基づいています。市販のキットを使用し、適切な準備と使用のためにプロバイダーの指示に従っていました。- 付属の2 mM EthD-1ストック溶液5 μLを滅菌組織培養グレードD-PBS1 mLに加え、5秒間ボルテックスして完全に混合することにより、10 μM EthD-1溶液を調製します。
- 付属の4 mMカルセインAMストック溶液2.5 μLを、すでに調製したEthD-1溶液に移します。完全な混合を確実にするために5秒間ボルテックス。
- 得られた10 μM EthD-1および10 μMカルセインAM作業溶液10 μLを10 μLの細胞懸濁液に加えます。
注:カルセインは水溶液中での加水分解の影響を非常に受けやすいため、この作業溶液を1日以内に使用してください。 - 染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドを自動蛍光セルカウンターに挿入します。GFPフィルターを使用して生細胞をカウントし、RFPフィルターを使用して死細胞をカウントします。
注:2つの計数法は同様の細胞数と生存率を与え、新たに解離した細胞の総数は、胚性心臓領域(0.06 mm3)あたり平均約20,000細胞と推定されました。
4.細胞凍結
- 細胞懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 チューブの底に触れずに上清を注意深く取り除き、ペレットを1 mLの冷やした凍結培地に再懸濁します。
- 細胞懸濁液を予冷したクライオバイアルに移し、クライオバイアルを予冷した凍結容器に入れます。
- 容器を-80 °Cで4時間から8時間置きます。クライオバイアルを液体窒素に移して、下流の単核RNAおよびATACシーケンシング実験を行います。
注意: クライオバイアルは、使用前にドライアイスで輸送する必要があります。私たちの経験では、細胞は細胞生存率を失うことなく、少なくとも6か月間液体窒素に保存することができます。氷晶の形成を防ぐために、保管温度は常に-150°C未満に保つ必要があります。
5.細胞の融解と死細胞の除去
- クライオバイアルを37°Cの水浴に1〜2分間入れます。小さな結晶がクライオバイアルに残っているときにそれを取り除きます。
- 予熱した(37°C)完全培地を1 mL加えます。ピペットで3回混ぜます。懸濁液を、10 mLの温かい完全培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。
- 細胞懸濁液全体を30 μmのストレーナーに通します。ストレーナーを1〜2 mLの温かい完全培地ですすぎ、フロースルーを同じ円錐形のチューブに集めます。
- 300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。PBSで1回洗浄し、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。
- 300 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを破壊することなく上清を除去します。
- 付属の磁気マイクロビーズ100 μLをペレットセルに加え、ワイドボアピペットチップを使用して5回ホモジナイズします。RTで15分間インキュベートします。
- その間に、磁気分離カラム(容量:1 x 107 〜2 x 108 セル)を500 μLの1x結合バッファーですすいでください。
- インキュベーションが完了したら、マイクロビーズを含む細胞懸濁液を500 μLの1x結合バッファーで希釈します。
- 細胞懸濁液(0.6 μL)を調製した磁気分離カラムに塗布します。フロースルーは負に選択された生細胞画分であり、磁気的に保持された画分は正に選択された死細胞です。
- 生細胞流出液を15 mL遠沈管に回収します。細胞懸濁液とカラムが入っていた1.5 mLマイクロチューブを2 mLの1x結合バッファーですすぎ、同じ15 mLチューブに流出液を回収します。
- 300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
- PBS-BSA溶液を1 mL加え、ワイドオリフィスピペットチップを使用して5回ピペッティングして穏やかに混合します。細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。
- 300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。
- 1 mLのPBS-BSAを加えてペレットを再懸濁し、洗浄ステップを繰り返して合計2回の洗浄を行います。
- 細胞を100 μLのPBS-BSA溶液に再懸濁します。10回ピペッティングして穏やかに混合します。
- 前述の方法を用いて細胞の濃度および生存率を決定する(ステップ3.1およびステップ3.2)。次の手順に進むには、セル数が ≥100,000 であることを確認します。代表的な結果については 、図2 を参照してください。
注:凍結保存は、生細胞の最初の出発物質の約40%の損失をもたらします。開始細胞数に応じて、磁気カラム上でビーズを分離すると細胞生存率が高くなりますが、細胞の総数は2倍から5倍に分割されます。死細胞を除去するためのカラムベースの磁気キットの利用は、十分な出発物質が利用可能な場合にのみ推奨されます。
6. 核の分離
注:snATACとsnRNA-seqの組み合わせは、清潔で無傷の核の懸濁液で行われます。使用する細胞タイプの溶解条件(溶解時間とNP40濃度)の最適化が推奨されます。最適な溶解時点と界面活性剤濃度は、核形態を乱すことなく溶解される細胞の最大数をもたらすものです。細胞/核の損失は、固定角度遠心分離機の代わりにスイングバケット遠心分離機を使用することで減らすことができます。プラスチックの核保持を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップと遠心チューブを使用することをお勧めします。これにより、核の回収率を高めることができます。ピペットチップと遠心チューブを5%BSAでコーティングすることは、より安価ですが、より時間のかかる代替手段です。
- 作業場所と材料を70%エタノールとRNase除去溶液で洗浄します。
- スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。 溶解バッファー、溶解希釈バッファー、0.1x 溶解バッファー、および洗浄バッファーを新たに調製します( 表1を参照)。氷上でバッファーを維持します。
- 細胞懸濁液をスイングバケット遠心分離機で4°Cで500 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットが外れないように、チューブの底に触れずにすべての上清をそっと取り除きます。
- 100 μLの冷却0.1x溶解バッファーを加えます。ピペッティングで10回穏やかに混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。
- 冷やした洗浄バッファー1 mLを加え、ピペッティングで5回穏やかに混ぜます。500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 核ペレットを乱すことなく上清を除去する。
- 冷やした洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、合計3回の洗浄を行います。希釈した核緩衝液を調製する。再懸濁後、核ストック溶液を氷上に置いておきます。
7. 単離核の質と量の評価
注:初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。冷却希釈核バッファーによる再懸濁量の計算は、ターゲット核回収率と、メーカーのユーザーガイドが推奨する対応する核ストック濃度に基づいています。この計算の例については、 補足プロトコル 1 を参照してください。
- 初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。
- 実際の核濃度を決定します。2 μLの核ストック溶液を8 μLの希釈核バッファーと混合し、事前に分注した10 μLのトリパンブルーまたはEthD-1/calceinAM作業溶液に加えます。自動セルカウンターを使用して核をカウントします。細胞の5%未満が生存可能であるはずです。代表的な結果については 、図3 を参照してください。
- 核ストックの容量と希釈された核バッファーの容量を計算して、転位反応の推奨濃度で5 μLの総容量を取得します(メーカーのユーザーガイドを参照)。直ちにユーザガイド17に従って転置反応に進む。
注:転位反応からATACおよびGEXライブラリの構築までのすべてのステップは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqの組み合わせ17に使用したキットのユーザーガイドに従って実行されました。
8. snRNA-seqおよびsnATAC-seqライブラリの品質解析
- 次世代シーケンシングに進む前に、最終的なsnATAC-seqおよび遺伝子発現GEXライブラリの品質とサイズ分布を検証してください。フラグメント解析システムを使用して、ライブラリで同定された配列の質と量を評価します。代表的な品質評価結果については 、図4 を参照してください。
注:snATAC-seqライブラリの最終的なトレースは、ヌクレオソーム巻上げの周期性を示す必要があり、サイズは200 bpから数Kbpの範囲である必要がありますが、遺伝子発現ライブラリのサイズは300 bpから600 bpの範囲である必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
シングルセルアプローチ用のシングルセル懸濁液の調製と比較して、単一核懸濁液の調製ははるかに困難であり、より高いレベルの分離と処理が必要です。snRNA-seqとsnATAC-seqの結合を成功させるための重要な要素は、クリーンで無傷の核懸濁液です。効率的な核分離のためのプロトコルは、各組織の種類と状態(新鮮または凍結)に適合させる必要があります。ここでは、凍結マウス胚性心臓細胞からの核の単離のために最適化されたプロトコルが記載されている。胚性心臓領域の解離と心臓細胞の解離から核の分離までのすべてのステップを 図1にまとめます。出発物質については、効率的な核単離のために、1 x 105-1 x 106 細胞の細胞数と細胞生存率>70%が推奨されます。 図2に示すように、融解後に死細胞を選別して除去するためにこのプロトコルで実行される追加のステップにより、有意に高い細胞生存率を有するよりクリーンな細胞懸濁液を得ることができ、出発サンプルの品質が向上しました。核の分離に加えて、このプロトコルは、単離された核の質と量を評価する方法に関する詳細情報を提供します(図3)。単離された核の質は、snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせたデータの質に大きく影響します。ここで、単離核の質は、核膜形態の評価により評価した。単離された核は、明視野顕微鏡下で図 3Cに示すように滑らかで均一に丸く見え、効果的な単離プロセスを示しています。より正確にするために、トリパンブルーと蛍光ベースの生存率評価用のキットを含む2つの異なる計数方法を使用して、細胞と核を定量しました。蛍光アッセイは、細胞の完全性および細胞内エステラーゼ活性に基づいて細胞生存率を決定するために使用されました。この色素溶液は、細胞内エステラーゼ活性を示す緑色蛍光カルセインAMと、細胞の完全性の喪失を反映する赤色蛍光エチジウムホモダイマー1を同時に可視化することにより、生細胞と死細胞を区別することができます。カウントに蛍光色素を使用すると、核と細胞の塊や破片を区別するのに役立ちます。このプロトコルを使用すると、 図3A、Bに示すように、細胞生存率は核分離前の80%〜90%から核分離後の<5%に移行しました。
我々の手順は、液体窒素中で新鮮な組織を直接凍結し、事前の酵素解離なしで溶解ステップを実行することを含む既存の方法と比較されました(補足プロトコル2および補足図1)。どちらの方法でより高品質の核懸濁液が得られるかを決定するために、両方のアプローチをテストしました。全胚性心臓組織を急速凍結すると、非溶解細胞の割合が高く、生細胞として検出され、不適切な細胞溶解が示されました(補足図1A)。凝集体および非個体細胞は、フィルターによる濾過にもかかわらず観察された(補足図1A、B)。
単離された核は、関節snATAC-seqおよびsnRNA-seqのライブラリを生成するために使用されました。 図4 は、遺伝子発現(GEX)ライブラリー、およびATACライブラリーの構築に用いたcDNAの品質管理結果を示す。品質管理は、自動電気泳動を用いて行った(図5A)。mRNA由来のcDNAを定量し、その後のGEXライブラリ構築に使用するのに十分な収量でした。300 bpから600 bpの範囲の高品質のGEXライブラリと、200 bpから7 kbpの範囲の周期的なヌクレオソーム巻上げを持つ高品質のATACライブラリが得られました。これらのライブラリをハイスループットシーケンシングによって配列決定し、単一核遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティの生成に成功しました(図5A)。これらの生データは、マウスE9.5心臓前駆細胞の転写およびエピジェネティックプロファイリングを生成するために、デマルチプレックスおよびバイオインフォマティクス分析の準備ができていました。SnRNA-seqおよびsnATAC-seqは、シングルゲノミクス用のSeuratツールキットを使用した教師なしクラスタリングを使用して、既知のマーカー遺伝子に基づいてクラスター化、同定、および標識されました24 。この初期解析により、E9.5で予想されるすべての心臓細胞型の存在が確認されました(図5B)。
上記の結果はすべて、凍結胚性心臓細胞から下流の単一核アプローチに適した核を単離する際のこのプロトコルの成功を裏付けています。
図1:snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせたプロファイリングのためのサンプル調製における主なステップの表現。 このフローチャートは、心臓組織の解離と心臓細胞の解離、細胞の凍結と融解、死細胞の除去による生細胞の精製、核の分離など、同じ細胞からのmRNAとクロマチンのアクセシビリティを同時に検出するために実行されるすべてのステップを要約したものです。略語:PBS =リン酸緩衝生理食塩水;BSA =ウシ血清アルブミン;RT =室温。BioRender.com で作成 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:死細胞選別後の最適化された融解細胞の生存率。 トリパンブルー排除色素を用いた死細胞除去前(上)および後(下)の自動セルカウンターを用いた細胞数および生存率を示す画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:核調製の品質管理。 (A,B)核単離前(上)および後(下)の自動セルカウンターを使用した細胞数と生存率を示す画像。2つの計数方法を使用した:(A)蛍光死亡率アッセイおよび(B)トリパンブルーアッセイ。(C)核分離の品質を示す画像。画像は、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡を使用して20倍(スケールバー= 50μm)で撮影されました。明視野画像(左)は核の形態を示しています。RFP(中央)は、膜の完全性を失った細胞、つまり単離された核を示しています。ここで生細胞のエステラーゼ活性を通常示すGFP(右)は、核懸濁液に生細胞がないことを裏付けています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:単一細胞遺伝子発現およびATACライブラリの品質管理。 cDNA(上)、GEXライブラリ(中央)、およびATACライブラリ(下)の品質とサイズ分布を示す自動電気泳動によるDNA分析。cDNA定量では、200 bpから8,900 bpの範囲のゾーンを選択し、バイオアナライザーがcDNA濃度を推定しました(pg / μL、赤い円)。GEXライブラリの構築を進めるのに十分なcDNA収量が得られました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:セルレンジャーソフトウェア25で評価されたサンプル性能。 (A)x軸のバーコードごとのピークとy軸のバーコードごとのRNA固有の分子識別子(UMI)の転位イベントを示す交差感度プロット。予想通り、細胞は主に右上隅にあり、RNAおよびATACデータが多い。細胞と非細胞(空のGEM、バックグラウンドシグナル)の間に明確な分離が観察されました。(B)scRNA-seq(左)およびscATAC-seq(右)で捕捉されたすべての細胞の代表的な均一多様体近似および投影(UMAP)プロットは、クラスター同一性によって色分けされ、細胞タイプに基づいてグループ化されています。クラスターの良好な分離が観察された。GEXとATACの共同生データは、解剖されたE9.5マウス胚性心臓領域からの7,000核の配列決定から得られた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:液体窒素中で直接新鮮組織を凍結する既存法からの核分離の品質管理。 (A)自動セルカウンターとトリパンブルーを排除色素として使用して単離された核数を示す画像(上)および40 μmストレーナーによるろ過前(上)と後(下)。非溶解細胞の高い割合が生細胞として検出された。20%の生細胞の検出は、不適切な細胞溶解を示しています。黒い矢印は集計を示します。(B)単離された核の品質を示す画像。画像は、明視野および蛍光顕微鏡を使用して、20倍(上部と中央に50 μmのスケールバー)および40倍(下部に25 μmのスケールバー)で撮影されました。明視野画像(左)は核の形態を示しています。RFP(右)は、膜の完全性を失った細胞、つまり単離された核を示しています。黒い矢印は、破片によって付着した原子核の多重項を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表1:手順で使用したバッファーと溶液の表。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足議定書1:単離された核の量の評価。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足プロトコル2:瞬間凍結組織からの核の分離。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせた研究による発達中の心臓の細胞組成の分析は、先天性心疾患の起源のより深い理解を提供します26。いくつかの研究所は、snRNA-seq27に対する心臓組織の凍結保存の効果を研究しています。ヒト疾患のマウスモデルから得られた新鮮な微小解剖組織を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqを実施することは、異なる実験条件を比較する際にロジスティック的に困難な場合があります。開発の特定の段階では、サンプル処理によってもたらされる技術的なばらつきを減らすために、対照群と実験群を同じ実行で処理する必要があることが困難の1つです。新鮮な組織の処理が不可能な場合は、結果に基づいて、胚の心臓組織全体を急速凍結するのではなく、解離させてから凍結保存することをお勧めします。一方の方法を他方よりも選択することは、心臓組織が丸ごと凍結している場合、融解後に生存可能な単一細胞を単離することがはるかに困難であるという事実に基づいています。ただし、組織解離プロトコルが最適化されていない場合は、組織全体をスナップフリーズする方がよい場合があります。この組織解離プロトコルは、細胞型バイアスなしで>90%の新鮮な生存細胞をもたらすことを考えると、解離とそれに続く凍結保存が好ましい。
このアプローチには、新鮮な組織の必要性を排除する凍結細胞の使用、および無傷の単一核の単離を可能にする単一細胞解離ステップの使用など、いくつかの利点があります。実際、これはダウンストリームのシングルセル解析にとって重要です。しかし、酵素的解離は細胞集団に転写バイアスを誘導する可能性がある。酵素細胞解離は細胞の微小環境を妨害し、したがって、ほとんどの細胞型で転写変化を誘導します28。これらの変化の主な決定要因は解離時間であり、細胞型29ではありません。解離誘発性アーティファクトを緩和するには、推奨される消化時間に従うことが重要です。多様な組織における公表された文献は、30分以下の消化時間が軽微な転写変化を誘導することを示している28,30。さらに、バイオインフォマティクスの介入は、データの歪みを最小限に抑えるために使用することができます31,32。
純粋で無傷の単一核を得ることは、単一核ゲノミクスにおいて最も重要な要素です。セルクラスターや有機デブリの存在によるシングルセルプラットフォームのマイクロ流体チャンバーの目詰まりは、データ品質の低下、またはより問題となる実験の失敗につながります。この手順では、既存のプロトコルを、酵素解離、凍結保存、および生存可能な心臓前駆細胞の精製を組み合わせることによって変更しました。私たちの手順では、FACSソーティングを必要とせずに純粋な核を単離することができます。この手順を用いて、凝集がなく、破片がほとんどなく、無傷の単一原子核である高品質の核懸濁液を得た。細胞単離ステップは、潜在的な核の凝集を避けるために重要です。実際、これは、大きなピペットチップを使用して穏やかなピペッティングを行うか、核をろ過することで回避できます。さまざまなステップでフィルターを使用し、その後光学顕微鏡で観察することで、このような問題を防ぐことができます。
ここで説明するプロトコルは、E9.5心臓前駆細胞から得られた同じ核調製物からのsnRNA-seqおよびsnATAC-seqプロファイリングに首尾よく使用されました。この方法は、先天性心疾患の妊娠中の野生型マウスとマウスモデルで使用できます。先天性心疾患は、心臓前駆細胞の分化、増殖、遊走、および生存を制御する経路の破壊によって発生する可能性があります33,34。これらの欠陥の起源をよりよく理解するために、この研究は特に先天性心疾患の影響を受ける主要な領域の前駆細胞、特に第2心臓野11と神経堤35の心臓前駆細胞が存在する胚期9.5に焦点を当てました。成体マウス心臓およびヒト心臓の細胞へのこの手順の適用は、特に細胞解離および溶解ステップの観点から、プロトコルの最適化を必要とする。
手動セルカウントと自動セルカウントの主な考慮事項は、コスト、労力、および精度です。自動カウンターは、手動カウントを実行するほとんどの熟練した科学者よりも高速です。特に多数のサンプルを扱う場合は、カウントを押して結果を表示できるだけで非常に便利です。核が単離されると、完全性の損失を避けるために迅速に処理する必要があるため、これは重要なポイントです。自動化システムの主な精度の利点は、これらのシステムがユーザー間またはラボ間のばらつきを排除することです。別の利点は、自動化されたシステムは通常、血球計算盤よりも広い視野を持っていることです。細胞/核の数または細胞/核の濃度が低い場合、この広い視野は確かに従来の手動方法よりも有利です。
非イオン性界面活性剤の濃度が高すぎると、高い割合のミトコンドリアDNA汚染が観察され得る。溶解バッファー中の濃度を下げることにより、核の収率を低下させることなくこの汚染を減らすことができます。最も満足のいく結果は、0.1%の界面活性剤を含む溶解バッファーを使用した実験で得られました。スイングバケットで核を回転させると、ペレット内のミトコンドリアの数を減らすこともできます。
核に対するTn5トランスポザーゼの適切な比率を持つことは、snATAC-seq13,14を成功させるために重要です。例えば、Tn5が多すぎると、クローズドクロマチンおよびシーケンシングライブラリの複雑さが低いために高いバックグラウンドをもたらす可能性があるが、サブリシスは完全なPCR増幅ライブラリをもたらさない可能性がある13。核の数を正確に決定するために、2つの相補的な方法を使用しました。
マルチモーダルオミクスデータセットは、複数のレベルのゲノム組織を同時に調査する機会を提供します9,36。RNAとATACの共同マルチモーダルアプローチは、上流の調節因子と下流の代謝遺伝子の研究を可能にし、単一細胞分解能での心臓発達の文脈における転写ネットワークとクロマチン構造の研究のための包括的なアプローチを提供します。この単一核単離プロトコルは、発現データセットとクロマチンデータセットの個別評価および共同評価の両方と互換性があります。クロマチンアクセシビリティは、特定のゲノム部位8、9、10、11、12、13における転写調節因子の活性を可能にするため、重要なエピジェネティックレベルの調節である。したがって、数十の可能な転写因子の同一性および標的部位に関する多数の情報が、クロマチンプロファイルのDNA配列によって提供される。snATAC-seqによって得られた情報とsnRNA発現プロファイリングの比較は、最も関連性の高い転写因子を特定するのに役立ち、Cut&Run37によってさらに分析することができます。この手順が関心のある研究者に役立ち、この強力な方法を研究に使用することを奨励することを願っています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、ERA-CVD-2019およびANR-JCJC-2020からSSの支援を受けて行われました。貴重なコメントを提供してくれたU 1251 /Marseille Medical Geneticsラボのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスファシリティ(GBiM)と匿名のレビューアに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
References
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
- Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome. Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).
- Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B.
- Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F.
- Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts. Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).
- Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
- Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications. Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).
- Stefanovic, S., et al. Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation. Elife. 9, e55124 (2020).
- Xu, W., et al. A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility. Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480 (2022).
- Pimpalwar, N., et al. Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart. Heliyon. 6 (12), 05810 (2020).
- 10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. 10x Genomics. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).
- Jia, G., et al. Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement. Nature Communications. 9 (1), 4877 (2018).
- Wang, L., et al. Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes. Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).
- Wang, Z., et al. Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution. Cell Reports. 35 (8), 109211 (2021).
- Ameen, M., et al. Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease. Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).
- Gao, R., et al. Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate. Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).
- Manivannan, S., et al. Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia. Communications Biology. 5 (1), 820 (2022).
- Cao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity. Nucleic Acids Research. 50 (21), e121 (2022).
- What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger (2023).
- Hill, M. C. Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease. Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).
- Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases. Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors. Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).
- Yang, Y., et al. SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection. Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097 (2021).
- Stefanovic, S., Christoffels, V. M. GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).
- Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. Development, proliferation, and growth of the mammalian heart. Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).
- Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42 (2021).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).
- Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor. Cellular Signalling. 96, 110361 (2022).
