Summary
여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.
Abstract
발달중인 심장은 복잡한 조절 메커니즘에 의해 제어되는 다양한 전구 세포를 포함하는 복잡한 구조입니다. 개별 세포의 유전자 발현 및 염색질 상태를 검사하면 세포 유형 및 상태를 확인할 수 있습니다. 단일 세포 시퀀싱 접근법은 심장 전구 세포 이질성의 여러 가지 중요한 특성을 밝혀냈습니다. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 신선한 조직으로 제한되어 기술적 변동성을 줄이기 위해 신선한 조직을 동일한 실행에서 한 번에 처리해야하기 때문에 다양한 실험 조건의 연구를 제한합니다. 따라서 이 분야에서는 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq) 및 고처리량 시퀀싱(snATAC-seq)을 통한 트랜스포사제 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석과 같은 방법에서 데이터를 생성하는 쉽고 유연한 절차가 필요합니다. 여기에서 우리는 후속 단일 핵 이중 오믹스(결합된 snRNA-seq 및 snATAC-seq)에 대해 핵을 신속하게 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 심장 전구 세포의 냉동 샘플에서 핵을 분리 할 수 있으며 미세 유체 챔버를 사용하는 플랫폼과 결합 할 수 있습니다.
Introduction
선천적 결함 중 선천성 심장 결함 (CHD)이 가장 흔하며 매년 출생의 약 1 %에서 발생합니다 1,2. 유전적 돌연변이는 소수의 경우에만 확인되며, 이는 유전자 조절의 이상과 같은 다른 원인이 CHD 2,3의 병인에 관여함을 의미합니다. 심장 발달은 다양하고 상호 작용하는 세포 유형의 복잡한 과정으로, 인과적 비암호화 돌연변이와 유전자 조절에 미치는 영향을 식별하기가 어렵습니다. 심장의 기관 형성은 심근, 섬유아세포, 심외막 및 심내막 세포를 포함한 심장 세포의 다양한 아형을 생성하는 세포 전구체에서 시작됩니다 4,5. 단세포 유전체학(single-cell genomics)은 심장 발달을 연구하고 세포 이질성이 건강과 질병에 미치는 영향을 평가하는 핵심 방법으로 부상하고 있다6. 다양한 파라미터를 동시에 측정하기 위한 다중 오믹스 분석법의 개발과 전산 파이프라인의 확장은 정상 및 병든 심장에서 세포 유형 및 아형의 발견을 용이하게 했다6. 이 기사는 다운스트림 snRNA-seq 및 snATAC-seq(snRNA-seq 및 snATAC-seq 결합)7,8,9와 호환되는 마우스 배아에서 얻은 냉동 심장 전구 세포에 대한 신뢰할 수 있는 단일 핵 분리 프로토콜에 대해 설명합니다.
ATAC-seq는 조절 개방 염색질 영역의 식별과 뉴클레오솜10,11의 위치를 허용하는 강력한 방법입니다. 이 정보는 전사 인자의 위치, 정체성 및 활동에 대한 결론을 도출하는 데 사용됩니다. 리모델러를 포함한 염색질 인자의 활성과 RNA 중합효소의 전사 활성은 염색질 구조 1,2의 정량적 변화를 측정하는 데 매우 민감하기 때문에 분석할 수 있습니다. 따라서 ATAC-seq는 특정 세포 유형에서 전사 조절을 제어하는 메커니즘을 밝히기 위한 강력하고 공정한 접근 방식을 제공합니다. ATAC-seq 프로토콜은 또한 단일 세포에서 염색질 접근성을 측정하기 위해 검증되었으며, 세포 집단10,12,13 내에서 염색질 구조의 가변성을 나타냅니다.
최근 몇 년 동안 단일세포 분야에서 괄목할 만한 발전이 있었지만, 가장 큰 어려움은 이러한 실험을 수행하는데 필요한 신선한 시료를 처리하는 것이다14. 이러한 어려움을 피하기 위해, 냉동 심장 조직 또는 세포15,16을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq와 같은 분석을 수행하기 위해 다양한 테스트가 수행되었습니다.
단세포 유전체학 데이터를 분석하기 위해 여러 플랫폼이 사용되었다17. 단세포 유전자 발현 및 ATAC 프로파일링을 위해 널리 사용되는 플랫폼은 다중 미세유체 액적 캡슐화를 위한 플랫폼이다17. 이러한 플랫폼은 미세 유체 챔버를 사용하기 때문에 파편이나 응집체가 시스템을 막아 사용할 수 없는 데이터를 생성할 수 있습니다. 따라서 단일 세포 연구의 성공 여부는 개별 세포/핵의 정확한 분리에 달려 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 선천성 심장 결함 18,19,20,21,22,23을 이해하기 위해 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 사용하는 최근 연구와 유사한 접근 방식을 사용합니다. 이 절차는 갓 미세 해부된 심장 조직의 효소 해리에 이어 마우스 심장 전구 세포의 냉동 보존을 활용합니다. 해동 후, 생존 가능한 세포는 핵 분리를 위해 정제되고 처리된다. 이 연구에서, 이 프로토콜은 마우스 심장 전구 세포의 동일한 핵 제제로부터 snRNA-seq 및 snATAC-seq 데이터를 얻기 위해 성공적으로 사용되었다.
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Protocol
본 연구에서 채택된 동물 시술은 엑스마르세유 대학교(C2EA-14)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 국가 동물 실험 윤리 위원회(Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche; 승인 Apafis N°33927-2021111715507212).
1. 해부 전 시간 정합 설정
- 마우스 배아를 생성하려면 심장 영역 분리 9.5일 전에 성인 마우스 사이에 시간 제한 교미를 수행합니다. 이 절차에서는 생후 2-6개월의 야생형 C57BL/6J 마우스를 사용하고 하룻밤 동안 시간 교미를 수행했습니다.
- 다음날 아침, 암컷 쥐에게 질 플러그가 있는지 확인하십시오. 플러그가 배아일(E) 0.5로 식별되는 날을 고려하십시오.
2. 조직 준비 및 세포 분리
- 수태 후 2-6개월된 임산부 C57BL/6J를 CO2를 통해 9.5일째에 안락사시키고 농도가 증가한 후 경추 탈구가 뒤따릅니다. 복부의 아래 부분을 70 % 에탄올로 청소하십시오.
참고: 자궁경부 탈구 전에 마취제를 사용하면 배아가 후속 전사체 및 후성유전체 연구에 영향을 미칠 수 있는 환경 변화에 노출될 수 있으므로 권장하지 않습니다. - 가위로 복부와 복막을 엽니 다. 자궁 뿔을 시각화하고 집게를 사용하여 양쪽 뿔을 절제합니다.
- 1% FBS가 함유된 차가운 완전 배지가 들어 있는 페트리 접시에 뿔을 놓습니다. 특정 부피가 필요하지는 않지만 배아가 배지에 완전히 잠기도록 주의해야 합니다. 10cm 페트리 접시 당 대략 10mL의 부피가 적절합니다.
- 5배 배율로 설정된 실체현미경 하에서 겸자를 사용하여 각 배아에서 자궁내막 조직, 태반 및 난황낭을 제거합니다.
- 배아를 1% FBS가 함유된 차가운 완전 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 그림 1에 설명된 대로 배아 심장 영역을 차가운 완전 배지에서 해부합니다.
- 5개의 마우스 배아에서 해부된 심장 영역을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 함께 모았습니다. 스윙 버킷 원심분리기를 4°C로 예냉 냉각합니다.
- 스윙 버킷 원심분리기의 RT에서 300x g 에서 1분 동안 원심분리기. 상층액을 제거하고, 조직 배양 등급 PBS 1 mL를 첨가하여 조직을 세척하였다.
- RT에서 300 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세척 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다. PBS를 0.05% 트립신/EDTA(1x)로 교체하여 세척을 두 번 반복합니다.
- 조직 분해를 위해 37°C에서 10분 동안 0.25% 트립신/EDTA 50μL를 추가합니다. 넓은 오리피스 필터 팁을 사용하여 위아래 제스처로 5분 후에 부드러운 기계적 해리를 적용합니다.
- 해리된 세포에 350 μL의 완전 배지를 추가하여 트립신 소화 활성을 비활성화합니다. 재현탁된 세포를 40μm 세포 여과기를 통해 통과시킵니다.
3. 세포 계수 및 생존력 평가
참고: 세포 수와 생존력은 단일 세포 실험의 성공을 위한 중요한 매개변수입니다. snATAC-seq 접근법은 세포 수의 사소한 변화에 민감합니다. 세포가 너무 적으면 염색질이 과도하게 소화되어 판독 횟수가 증가하고 접근할 수 없는 염색질 영역(노이즈)이 매핑됩니다. 마찬가지로, 세포가 너무 많으면 염기서열을 분석하기 어려운 고분자량 단편이 생성됩니다. 세포 및 핵 농도의 정확한 측정을 위해, 세포 수 및 생존율을 두 가지 상이한 방법에 의해 평가하였다.
- 아래에 설명된 대로 세포 계수를 위해 트립판 블루 분석을 수행합니다.
- 0.4% 트리판 블루 염색 용액을 볼텍스(vortex)하고, 2,000 x g의 실온에서 10초 동안 회전시키고, 10 μL를 마이크로튜브에 옮긴다.
- 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 혼합하고 이미 분취된 10μL의 트리판 블루 용액에 10μL의 현탁액을 추가합니다. 피펫으로 조심스럽게 10 번 섞는다.
- 염색된 세포 10μL를 계수 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 카운터에 놓으면 세포 농도와 생존력이 자동으로 계산됩니다.
- 아래에 설명된 대로 형광 기반 사망률 평가를 수행합니다.
참고: 이 분석은 세포 생존율을 평가하기 위해 형광 염료(에티듐 호모다이머-1, EthD-1 및 칼세인 AM)의 사용을 기반으로 합니다. 시중에서 판매되는 키트를 사용했으며 적절한 준비 및 사용을 위해 공급자의 지침을 따랐습니다.- 제공된 2mM EthD-1 원액 5μL를 멸균 조직 배양 등급 D-PBS 1mL에 첨가하여 10μM EthD-1 용액을 준비하고 완전한 혼합을 보장하기 위해 5초 동안 볼텍스합니다.
- 공급된 4mM 칼세인 AM 원액 2.5μL를 이미 제조된 EthD-1 용액으로 옮깁니다. 완전한 혼합을 보장하기 위해 5초 동안 소용돌이.
- 생성된 10μL EthD-1 및 10μM 칼세인 AM 작업 용액 10μL를 10μL의 세포 현탁액에 추가합니다.
알림: Calcein은 수용액에서 가수분해에 매우 취약하므로 1일 이내에 이 작업 용액을 사용하십시오. - 염색된 세포 10μL를 계수 슬라이드에 옮깁니다. 슬라이드를 자동 형광 세포 계수기에 삽입합니다. GFP 필터를 사용하여 살아있는 세포를 세고 RFP 필터로 죽은 세포를 계산합니다.
참고: 두 가지 계수 방법은 유사한 세포 수와 생존력을 제공했으며 새로 해리된 세포의 총 수는 배아 심장 영역(0.06mm3)당 평균 약 20,000개의 세포로 추정되었습니다.
4. 세포 동결
- 세포 현탁액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리한다. 튜브 바닥을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 1mL의 냉장 냉동 매체에 재현탁합니다.
- 세포 현탁액을 예냉된 극저온으로 옮기고 극저온 냉동을 예냉된 냉동 용기에 넣습니다.
- 용기를 -80 ◦C에 4시간에서 8시간 동안 놓습니다. 다운스트림 단일 핵 RNA 및 ATAC 시퀀싱 실험을 위해 극저온 이온을 액체 질소로 옮깁니다.
알림: 극저온 액체는 사용 전에 드라이아이스로 운반해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, 세포는 세포 생존력의 손실없이 적어도 6 개월 동안 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 보관 온도는 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 항상 -150 °C 이하로 유지되어야 합니다.
5. 세포 해동 및 죽은 세포 제거
- 극저온 액체를 37°C 수조에 1-2분 동안 두십시오. 극저온에 작은 결정이 남아 있으면 제거하십시오.
- 예열된(37°C) 완전 배지 1mL를 추가합니다. 피펫과 세 번 섞는다. 현탁액을 10mL의 따뜻한 완전 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 전체 세포 현탁액을 30μm 스트레이너 위로 통과시킵니다. 1-2mL의 따뜻한 완전 배지로 여과기를 헹구고 동일한 원뿔형 튜브에 흐름을 수집합니다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. PBS로 1회 세척하고, 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상청액을 제거한다.
- 제공된 자성 마이크로비드 100μL를 펠렛 세포에 추가하고 광경 피펫 팁을 사용하여 5회 균질화합니다. RT에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 그 동안 자기 분리 컬럼(용량: 1 x 107 내지 2 x 108 셀)을 500 μL의 1x 결합 완충액으로 헹굽니다.
- 인큐베이션이 완료되면 마이크로비드가 포함된 세포 현탁액을 500μL의 1x 결합 완충액으로 희석합니다.
- 세포 현탁액(0.6 μL)을 제조된 자기 분리 컬럼에 적용한다. flow-through는 음성으로 선택된 살아있는 세포 분획이고, 자기적으로 유지된 분획은 긍정적으로 선택된 죽은 세포이다.
- 15mL 원심분리기 튜브에 살아있는 세포 유출물을 수집합니다. 세포 현탁액과 컬럼이 들어 있는 1.5mL 마이크로튜브를 2mL의 1x 결합 완충액으로 헹구고 동일한 15mL 튜브에 폐수를 수집합니다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
- PBS-BSA 용액 1mL를 넣고 와이드 오리피스 피펫 팁을 사용하여 5회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
- 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
- PBS-BSA 1mL를 첨가하여 펠릿을 재현탁하고 세척 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다.
- PBS-BSA 용액 100μL에 세포를 재현탁합니다. 피펫팅으로 10회 부드럽게 섞는다.
- 앞서 기술된 방법(단계 3.1 및 단계 3.2)을 사용하여 세포의 농도 및 생존율을 결정한다. 다음 단계로 진행하려면 셀 수가 ≥100,000개인지 확인합니다. 대표적인 결과는 그림 2 를 참조하십시오.
참고: 냉동 보존은 살아있는 세포의 초기 출발 물질의 약 40%를 손실합니다. 시작 세포 수에 따라 마그네틱 컬럼에서 비드 분리하면 세포 생존율이 높지만 총 세포 수를 2배에서 5배로 나눕니다. 죽은 세포를 제거하기 위한 컬럼 기반 자기 키트의 사용은 충분한 출발 물질을 사용할 수 있는 경우에만 권장됩니다.
6. 핵 분리
참고: snATAC 및 snRNA-seq 결합은 깨끗하고 손상되지 않은 핵의 현탁액으로 수행됩니다. 사용된 세포 유형에 대한 용해 조건(용해 시간 및 NP40 농도)의 최적화가 권장됩니다. 최적의 용해 시점과 세제 농도는 핵 형태를 방해하지 않고 용해되는 최대 세포 수를 초래하는 것입니다. 세포/핵의 손실은 고정각 원심분리기 대신 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 줄일 수 있습니다. 플라스틱의 핵 보유를 최소화하려면 저보유 피펫 팁과 원심분리기 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 핵 회수를 증가시킬 수 있습니다. 피펫 팁과 원심분리기 튜브를 5% BSA로 코팅하는 것은 비용이 적게 들지만 시간이 많이 소요되는 대안입니다.
- 70% 에탄올과 RNase 제거 용액으로 작업장과 재료를 청소합니다.
- 스윙 버킷 원심분리기를 4°C로 예냉 냉각합니다. 용해 완충액, 용해 희석 완충액, 0.1x 용해 완충액 및 세척 완충액을 새로 준비합니다( 표 1 참조). 얼음 위에 버퍼를 유지하십시오.
- 세포 현탁액을 스윙 버킷 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다. 세포 펠릿이 빠지지 않도록 튜브 바닥을 건드리지 않고 모든 상층액을 부드럽게 제거합니다.
- 100 μL의 냉각된 0.1x 용해 완충액을 추가합니다. 피펫팅으로 10회 부드럽게 혼합합니다. 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
- 식힌 세척 버퍼 1mL를 넣고 5회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 4 °C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거합니다.
- 식힌 세척 버퍼로 세척을 반복하여 총 3회 세척합니다. 희석된 핵 완충액을 준비합니다. 재현탁 후 핵 원액을 얼음 위에 보관하십시오.
7. 분리된 핵의 품질 및 수량 평가
참고: 초기 세포 수를 기반으로 세포 용해 중 약 50%의 핵 손실을 추정하고 저온 희석 핵 완충액에 적절한 수의 세포를 재현탁합니다. 냉각된 희석된 핵 완충액을 사용한 재현탁 부피의 계산은 표적 핵 회수율과 제조업체의 사용자 가이드에서 권장하는 해당 핵 스톡 농도를 기반으로 합니다. 보충 프로토콜 1에서 이 계산의 예를 참조하십시오.
- 초기 세포 수를 기반으로 세포 용해 중 약 50%의 핵 손실을 추정하고 적절한 수의 세포를 저온 희석 핵 완충액에 재현탁합니다.
- 실제 핵 농도를 결정합니다. 2 μL의 핵 저장 용액과 8 μL의 희석된 핵 완충액을 혼합하고 미리 분취된 10 μL의 트리판 블루 또는 EthD-1/calceinAM 작업 용액에 혼합물을 추가합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 핵을 계산합니다. 세포의 5% 미만이 생존해야 합니다. 대표적인 결과는 그림 3 을 참조하십시오.
- 핵 스톡의 부피와 희석된 핵 완충액의 부피를 계산하여 전치 반응에 권장되는 농도에서 총 부피 5μL를 얻습니다(제조업체의 사용 설명서 참조). 사용자 가이드17에 따라 즉시 전위 반응을 진행하십시오.
참고: 전치 반응에서 ATAC 및 GEX 라이브러리의 구성까지의 모든 단계는 snRNA-seq 및 snATAC-seq 조합에 사용된 키트의 사용자 가이드에 따라 수행되었습니다17.
8. snRNA-seq 및 snATAC-seq 라이브러리의 품질 분석
- 차세대 염기서열 분석을 진행하기 전에 최종 snATAC-seq 및 유전자 발현 GEX 라이브러리의 품질 및 크기 분포를 검증합니다. 단편 분석 시스템을 사용하여 라이브러리에서 식별된 염기서열의 품질과 양을 평가합니다. 대표적인 품질 평가 결과는 그림 4 를 참조하십시오.
참고: snATAC-seq 라이브러리의 최종 추적은 뉴클레오솜 감기의 주기성을 나타내야 하며 크기는 200bp에서 수 Kbp 범위여야 하는 반면 유전자 발현 라이브러리의 크기는 300bp에서 600bp 범위여야 합니다.
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Representative Results
단세포 접근법을 위한 단세포 현탁액의 준비와 비교할 때, 단핵 현탁액의 준비는 훨씬 더 까다롭고 더 높은 수준의 분해능과 처리가 필요합니다. snRNA-seq와 snATAC-seq의 성공적인 결합을 위한 핵심 요소는 깨끗하고 손상되지 않은 핵 현탁액입니다. 효율적인 핵 분리를 위한 프로토콜은 각 조직 유형 및 상태(신선 또는 냉동)에 맞게 조정되어야 합니다. 여기서, 냉동 마우스 배아 심장 세포로부터 핵을 분리하기 위해 최적화된 프로토콜이 설명된다. 배아 심장 부위 해부 및 심장 세포 해리에서 핵 분리에 이르는 모든 단계가 그림 1에 요약되어 있습니다. 출발 물질의 경우, 효율적인 핵 분리를 위해 1 x 105-1 x 106 세포의 세포 수와 세포 생존율 >70%가 권장됩니다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 해동 후 죽은 세포를 분류 및 제거하기 위해 이 프로토콜에서 수행된 추가 단계는 상당히 높은 세포 생존율을 갖는 더 깨끗한 세포 현탁액을 얻고 출발 샘플의 품질을 개선시키는 것을 허용하였다. 핵 분리 외에도 이 프로토콜은 분리된 핵의 품질과 양을 평가하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공합니다(그림 3). 분리된 핵의 품질은 snRNA-seq 및 snATAC-seq 결합 데이터의 품질에 큰 영향을 미칩니다. 여기서, 분리된 핵의 품질은 핵막 형태의 평가에 의해 평가되었다. 분리된 핵은 명시야 현미경 검사에서 그림 3C에서 볼 수 있듯이 매끄럽고 균일하게 둥글게 나타났으며, 이는 효과적인 분리 과정을 나타냅니다. 정확도를 높이기 위해 세포와 핵을 정량화하기 위해 트리판 블루와 형광 기반 생존력 평가를 위한 키트를 포함한 두 가지 계수 방법이 사용되었습니다. 형광 분석은 세포 무결성 및 세포내 에스테라아제 활성에 기초하여 세포 생존율을 결정하기 위해 사용되었다. 이 염료 용액은 세포 내 에스테라아제 활성을 나타내는 녹색 형광 칼세인 AM과 세포 무결성 손실을 반영하는 적색 형광 에티듐 호모다이머 1을 동시에 시각화하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있습니다. 계수를 위해 형광 염료를 사용하면 핵을 세포 덩어리 및 파편과 구별하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 세포 생존율은 그림 3A, B와 같이 핵 분리 전 80%-90%에서 핵 분리 후 <5%로 전달되었습니다.
우리의 절차는 신선한 조직을 액체 질소에서 직접 동결하고 사전 효소 해리 없이 용해 단계를 수행하는 기존 방법과 비교되었습니다(보충 프로토콜 2 및 보충 그림 1). 두 가지 접근법 모두 어떤 방법이 더 나은 품질의 핵 현탁액을 제공하는지 결정하기 위해 테스트되었습니다. 전체 배아 심장 조직을 스냅 동결하면 용해되지 않은 세포의 비율이 높은 비율로 살아있는 것으로 검출되어 부적절한 세포 용해를 나타냅니다(보충 그림 1A). 응집체 및 비개별 세포는 필터를 통한 여과에도 불구하고 관찰되었습니다(보충 그림 1A, B).
분리된 핵은 관절 snATAC-seq 및 snRNA-seq에 대한 라이브러리를 생성하는 데 사용되었습니다. 도 4 는 유전자 발현(GEX) 라이브러리 및 ATAC 라이브러리의 구축에 사용된 cDNA의 품질 관리 결과를 예시한다. 품질 관리는 자동 전기영동을 사용하여 수행되었습니다(그림 5A). mRNA-유래된 cDNA를 정량화하였고, 수율은 GEX 라이브러리 구축에 후속 사용하기에 충분하였다. ~300 bp 내지 600 bp 범위의 고품질 GEX 라이브러리 및 200 bp 내지 7 kbp 범위의 주기적 뉴클레오솜 와인딩을 갖는 고품질 ATAC 라이브러리가 얻어졌다. 이러한 라이브러리는 고처리량 시퀀싱에 의해 시퀀싱되었으며 단일 핵 유전자 발현 및 염색질 접근성을 성공적으로 생성했습니다(그림 5A). 이러한 원시 데이터는 마우스 E9.5 심장 전구 세포의 전사 및 후성유전학적 프로파일링을 생성하기 위해 역다중화 및 생물정보학적 분석이 준비되었습니다. SnRNA-seq 및 snATAC-seq는 단일 게놈을 위한 Seurat 툴킷과 함께 감독되지 않은 클러스터링을 사용하여 알려진 마커 유전자를 기반으로 클러스터링, 식별 및 표지되었습니다24 . 이 초기 분석은 E9.5에서 예상되는 모든 심장 세포 유형의 존재를 확인했습니다(그림 5B).
위의 모든 결과는 냉동 배아 심장 세포에서 다운스트림 단일 핵 접근에 적합한 핵을 분리하는 데 있어 이 프로토콜의 성공을 뒷받침합니다.
그림 1: 결합된 snRNA-seq 및 snATAC-seq 프로파일링을 위한 시료 전처리의 주요 단계 표현. 이 순서도는 심장 조직 해부 및 심장 세포 해리, 세포 동결 및 해동, 죽은 세포를 제거하여 살아있는 세포 정제, 동일한 세포에서 mRNA 및 염색질 접근성을 동시에 검출하기 위해 수행되는 핵 분리를 포함한 모든 단계를 요약합니다. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; BSA = 소 혈청 알부민; RT = 실온. 만든 프로그램 BioRender.com 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 죽은 세포 분류 후 최적화된 해동된 세포의 생존율. 트리판 블루 배제 염료를 사용한 죽은 세포 제거 전(위)과 후(아래)에 자동 세포 계수기를 사용한 세포 수 및 생존율을 보여주는 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 핵 준비의 품질 관리. (A,B) 핵 분리 전(위)과 후(아래)의 자동 세포 계수기를 사용한 세포 수와 생존율을 보여주는 이미지. (A) 형광 사망률 분석 및 (B) 트리판 블루 분석의 두 가지 계수 방법이 사용되었습니다. (C) 핵 분리의 품질을 보여주는 이미지. 이미지는 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 20x(스케일 바 = 50μm)에서 촬영되었습니다. 명시야 이미지(왼쪽)는 핵 형태를 보여줍니다. RFP(가운데)는 막 무결성을 잃은 세포, 즉 분리된 핵을 보여줍니다. 그리고 여기에서 일반적으로 살아있는 세포의 에스테라제 활성을 나타내는 GFP(오른쪽)는 핵 현탁액에 살아있는 세포가 없음을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 세포 유전자 발현 및 ATAC 라이브러리의 품질 관리. cDNA(위), GEX 라이브러리(가운데) 및 ATAC 라이브러리(아래)의 품질 및 크기 분포를 보여주는 자동 전기영동을 사용한 DNA 분석. cDNA 정량화를 위해 200bp에서 8,900bp 범위의 영역을 선택하고 생물분석기는 cDNA 농도(pg/μL, 빨간색 원)를 추정했습니다. GEX 라이브러리 구축을 진행하기에 충분한 cDNA 수율이 얻어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Cell Ranger 소프트웨어로 평가한 샘플 성능25. (A) x축의 바코드당 피크의 전치 이벤트와 y축의 바코드당 RNA 고유 분자 식별자(UMI)를 보여주는 교차 감도 플롯. 예상대로 세포는 주로 오른쪽 상단 모서리에 위치하며 RNA 및 ATAC 데이터가 높습니다. 세포와 비세포 사이의 명확한 분리(빈 GEM, 배경 신호)가 관찰되었다. (B) scRNA-seq(왼쪽) 및 scATAC-seq(오른쪽)에서 캡처된 모든 세포의 대표적인 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP) 플롯은 클러스터 동일성에 따라 채색되고 세포 유형에 따라 그룹화됩니다. 클러스터의 양호한 분리가 관찰되었다. 공동 GEX 및 ATAC 원시 데이터는 해부된 E9.5 마우스 배아 심장 영역에서 7,000개의 핵을 시퀀싱하여 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 신선한 조직을 액체 질소에서 직접 냉동하는 기존 방법에서 핵을 분리하는 품질 관리. (A) 40μm 여과기를 통한 여과 전(위)과 후(아래)에 배제 염료로 자동 세포 계수기와 트립판 블루를 사용하여 분리된 핵 수를 보여주는 이미지. 용해되지 않은 세포의 높은 비율이 살아있는 것으로 검출되었습니다. 20 % 살아있는 세포의 검출은 부적절한 세포 용해를 나타냅니다. 검은색 화살표는 집계를 나타냅니다. (B) 분리된 핵의 품질을 보여주는 이미지. 이미지는 명시야 및 형광 현미경을 사용하여 20x(50μm의 스케일 막대가 있는 상단 및 중간) 및 40x(25μm의 스케일 막대가 있는 하단)에서 촬영되었습니다. 명시야 이미지(왼쪽)는 핵 형태를 보여줍니다. RFP(오른쪽)는 막 무결성을 잃은 세포, 즉 분리된 핵을 보여줍니다. 검은색 화살표는 파편에 의해 부착된 핵의 배수를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 절차에 사용된 버퍼 및 솔루션 표. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 프로토콜 1: 분리된 핵의 양 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 프로토콜 2: 플래시 냉동 조직에서 핵 분리. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
snRNA-seq 및 snATAC-seq 연구를 결합하여 발달 중인 심장의 세포 조성을 분석하면 선천성 심장 질환의 기원에 대한 더 깊은 이해를 얻을 수 있다26. 여러 연구실에서 snRNA-seq27에 대한 심장 조직 동결 보존의 효과를 연구했습니다. 인간 질병의 마우스 모델에서 신선한 미세 해부 조직을 사용하여 snRNA-seq 및 snATAC-seq를 수행하는 것은 서로 다른 실험 조건을 비교할 때 논리적으로 어려울 수 있습니다. 주어진 개발 단계에서 한 가지 어려움은 샘플 처리로 인한 기술적 변동성을 줄이기 위해 대조군과 실험군을 동일한 실행에서 처리해야 한다는 것입니다. 신선한 조직을 처리할 수 없는 경우 결과에 따라 전체 배아 심장 조직을 급속 동결하는 것보다 해리한 다음 냉동 보존하는 것이 좋습니다. 다른 방법보다 한 가지 방법을 선택하는 것은 심장 조직이 전체적으로 동결 된 경우 해동 후 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 것이 훨씬 더 어렵다는 사실에 근거합니다. 그러나 조직 해리 프로토콜이 최적화되지 않은 경우 조직 전체를 스냅 동결하는 것이 더 나을 수 있습니다. 이 조직 해리 프로토콜이 세포 유형 편향 없이 >90%의 신선한 생존 세포를 생성한다는 점을 감안할 때 해리 후 냉동 보존이 선호됩니다.
이 접근법은 신선한 조직에 대한 요구 사항을 제거하는 냉동 세포의 사용과 손상되지 않은 단일 핵의 분리를 허용하는 단일 세포 해리 단계의 사용과 같은 몇 가지 이점이 있습니다. 실제로 이는 다운스트림 단일 세포 분석에 매우 중요합니다. 그러나, 효소적 해리는 세포 집단에서 전사 편향을 유도할 수 있다. 효소 세포 해리는 세포 미세 환경을 방해하여 대부분의 세포 유형에서 전사 변화를 유도한다28. 이러한 변화의 주요 결정 요인은 세포 유형29가 아니라 해리 시간입니다. 해리로 인한 인공물을 조절하려면 권장 소화 시간을 따르는 것이 중요합니다. 다양한 조직에서 발표된 문헌은 30분 이하의 소화 시간이 경미한 전사 변화를 유도한다는 것을 나타냅니다28,30. 또한, 생물정보학 개입은 데이터 왜곡을 최소화하기 위해 사용될 수 있다31,32.
순수하고 온전한 단일 핵을 얻는 것은 단일 핵 유전체학에서 가장 중요한 요소입니다. 세포 클러스터 또는 유기 파편의 존재로 인해 단일 세포 플랫폼의 미세 유체 챔버가 막히면 데이터 품질이 저하되거나 더 문제가 되는 실험 실패가 발생합니다. 이 절차에서 기존 프로토콜은 생존 가능한 심장 전구 세포의 효소 해리, 냉동 보존 및 정제를 결합하여 수정되었습니다. 우리의 절차는 FACS 분류의 필요 없이 순수한 핵의 분리를 허용합니다. 이 절차를 사용하여 우리는 덩어리가 없고 파편이 거의 없으며 손상되지 않은 단일 핵이 없는 고품질 핵 현탁액을 얻었습니다. 세포 분리 단계는 잠재적인 핵 덩어리를 방지하는 데 중요합니다. 실제로, 이것은 큰 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 피펫팅하거나 핵을 여과함으로써 피할 수 있습니다. 여러 단계에서 필터를 사용하고 광학 현미경으로 관찰하면 이러한 문제를 예방할 수 있습니다.
여기에 기술된 프로토콜은 E9.5 심장 전구 세포로부터 얻어진 동일한 핵 제제로부터 snRNA-seq 및 snATAC-seq 프로파일링에 성공적으로 사용되었다. 이 방법은 선천성 심장 결함에 대해 임신한 야생형 마우스 대 마우스 모델에서 사용할 수 있습니다. 선천성 심장 결함은 심장 전구 세포의 분화, 증식, 이동 및 생존을 제어하는 경로의 파괴로 인해 발생할 수 있습니다33,34. 이러한 결함의 기원을 더 잘 이해하기 위해, 본 연구는 특히 선천성 심장 결함에 영향을 받는 주요 영역의 전구체, 특히 제2 심장장(11)과 신경능선(35)의 심장 전구체가 존재하는 배아 단계 9.5에 초점을 맞췄다. 이 절차를 성인 마우스 심장 및 인간 심장의 세포에 적용하려면 특히 세포 해리 및 용해 단계 측면에서 프로토콜의 최적화가 필요합니다.
수동 세포 계수와 자동 세포 계수 간의 주요 고려 사항은 비용, 노동력, 정확성입니다. 자동 카운터는 수동 계수를 수행하는 대부분의 숙련된 과학자보다 빠릅니다. 특히 많은 수의 샘플을 처리할 때 카운트를 누르고 결과를 볼 수 있다는 것은 큰 이점입니다. 핵이 분리되면 무결성 손실을 피하기 위해 신속하게 처리해야 하기 때문에 이것은 중요한 포인트입니다. 자동화 시스템의 주요 정확도 이점은 이러한 시스템이 사용자 또는 실험실 간의 변동성을 제거한다는 것입니다. 또 다른 장점은 자동화 시스템이 일반적으로 혈구계보다 시야가 더 크다는 것입니다. 세포/핵의 수 또는 세포/핵의 농도가 낮을 때 이 더 큰 시야는 확실히 기존의 수동 방법에 비해 이점이 있습니다.
높은 비율의 미토콘드리아 DNA 오염은 비이온성 세제의 농도가 너무 높을 때 관찰될 수 있습니다. 용해 완충액의 농도를 감소시킴으로써, 이 오염은 핵의 수율을 감소시키지 않으면서 감소될 수 있다. 가장 만족스러운 결과는 0.1% 세제를 함유한 용해 완충액을 사용한 실험에서 얻어졌습니다. 스윙 버킷에서 핵을 회전시키면 펠릿의 미토콘드리아 수를 줄일 수도 있습니다.
핵에 대한 Tn5 전이효소의 적절한 비율을 갖는 것은 성공적인 snATAC-seq13,14에 매우 중요합니다. 예를 들어, Tn5가 너무 많으면 폐쇄된 염색질 및 시퀀싱 라이브러리의 낮은 복잡성으로 인해 높은 배경이 생성될 수 있는 반면, 서브-용해는 완전한 PCR 증폭 라이브러리(13)를 초래하지 않을 수 있다. 핵의 수를 정확하게 결정하기 위해 두 가지 보완적인 방법을 사용했습니다.
다중 모드 오믹스 데이터 세트는 여러 수준의 게놈 조직을 동시에 조사할 수 있는 기회를 제공합니다 9,36. 공동 RNA 및 ATAC 다중 모드 접근법은 업스트림 조절자 및 다운스트림 대사 유전자의 연구를 가능하게 하고 단일 세포 분해능에서 심장 발달의 맥락에서 전사 네트워크 및 염색질 구조 연구를 위한 포괄적인 접근 방식을 제공합니다. 단일 핵 분리를 위한 이 프로토콜은 발현 및 염색질 데이터 세트의 개별 및 공동 평가 모두와 호환됩니다. 염색질 접근성은 특정 게놈 부위 8,9,10,11,12,13에서 전사 조절자의 활성을 가능하게 하기 때문에 중요한 후성유전학적 조절 수준입니다. 따라서 수십 가지 가능한 전사 인자의 동일성 및 표적 부위에 대한 많은 정보가 염색질 프로필의 DNA 서열에 의해 제공됩니다. snATAC-seq로 얻은 정보를 snRNA 발현 프로파일링과 비교하면 가장 관련성이 높은 전사 인자를 식별하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 Cut&Run37로 추가로 분석할 수 있습니다. 이 절차가 관심 있는 연구자들에게 도움이 되고 연구에 이 강력한 방법을 사용하도록 권장하기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 ERA-CVD-2019 및 ANR-JCJC-2020에서 SS로 지원되었습니다. 귀중한 의견을 제공해 주신 U 1251/Marseille Medical Genetics 연구실의 Genomics and Bioinformatics facility(GBiM)와 익명의 검토자에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | No catalog number | |
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSA 10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 4 rxns (including Nuclei Buffer 20X) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | No catalog number | |
| Digitonin (5%) | Thermofisher | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | Sterile and RNase-free |
| Dual Index Kit TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| HI-FBS | Thermofisher | A3840001 | Heat inactivated |
| High sensitivity DNA kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher | L3224 | |
| MACS Dead Cell Removal kit: Dead Cell Romoval MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | Thermofisher | 16600082 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | No catalog number | |
| Penicillin Streptomycin (Pen/Strep) | Thermofisher | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| Rock inhibitor | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| Single Index Kit N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| Sterile double-distilled water | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochloride solution (HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| Trypan Blue stain (0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA 1X | Thermofisher | 25300054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Wide orifice filtered pipette tips 200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | No catalog number |
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