يتطلب استكشاف الميتوفاجي من خلال المجهر الإلكتروني وأجهزة الاستشعار الجينية والتألق المناعي معدات مكلفة وموظفين مهرة واستثمارا كبيرا للوقت. هنا ، نوضح فعالية مجموعة صبغة مضان تجارية في تحديد عملية الميتوفاجي في كل من Caenorhabditis elegans وخط خلايا سرطان الكبد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا ضرورية لمختلف الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، واستقلاب الدهون ، وتوازن الكالسيوم ، والتخليق الحيوي للهيم ، وموت الخلايا المنظم ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تعتبر أنواع الأكسجين التفاعلية حيوية للعمليات البيولوجية الرئيسية. ومع ذلك ، عندما لا يتم التحكم فيها ، يمكن أن تؤدي إلى إصابة مؤكسدة ، بما في ذلك تلف الميتوكوندريا. تطلق الميتوكوندريا التالفة المزيد من أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تكثيف الإصابة الخلوية وحالة المرض. عملية الاستتباب تسمى الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (mitophagy) تزيل بشكل انتقائي الميتوكوندريا التالفة ، والتي يتم استبدالها بعد ذلك بأخرى جديدة. هناك العديد من مسارات الميتوفاجي ، مع نقطة النهاية المشتركة هي انهيار الميتوكوندريا التالفة في الجسيمات الحالة.
تستخدم العديد من المنهجيات ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الجينية ، والتألق المناعي للأجسام المضادة ، والمجهر الإلكتروني ، نقطة النهاية هذه لتحديد الميتوفاجي. كل طريقة لفحص الميتوفاجي لها مزاياها ، مثل استهداف الأنسجة / الخلايا المحددة (مع أجهزة الاستشعار الجينية) والتفاصيل الكبيرة (مع المجهر الإلكتروني). ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب موارد باهظة الثمن وموظفين مدربين ووقتا طويلا للتحضير قبل التجربة الفعلية ، مثل إنشاء معدلة وراثيا. هنا ، نقدم بديلا فعالا من حيث التكلفة لقياس الميتوفاجي باستخدام أصباغ الفلورسنت المتاحة تجاريا والتي تستهدف الميتوكوندريا والليزوزومات. تقيس هذه الطريقة بشكل فعال الميتوفاجي في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans وخلايا الكبد البشرية ، مما يشير إلى كفاءتها المحتملة في أنظمة النماذج الأخرى.
المقدمة
الميتوكوندريا ضرورية لجميع الحيوانات الهوائية ، بما في ذلك البشر. يقومون بتحويل الطاقة الكيميائية للجزيئات الحيوية إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية1 ، وتوليف الهيم2 ، وتحلل الأحماض الدهنية من خلال أكسدةβ 3 ، وتنظيم توازن الكالسيوم4 والحديد5 ، والتحكم في موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج6 ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تلعب دورا حيويا في توازن الأكسدةوالاختزال 7. تحافظ عمليتان متكاملتان ومتعاكستان على سلامة الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة: تخليق ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: من أجل راحة القراء ، قمنا بتقسيم البروتوكول إلى قسمين: أحدهما يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في C. elegans ، والآخر يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في خلايا الكبد. يمكن العثور على قائمة المواد في جدول المواد المقدم.
1. بروتوكول C. elegans
- تحضير صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ومخزون بكتيريا الإشريكية القولونية OP50
ملاحظة: كنقطة توضيح ، بينما اتبعنا البروتوكولات القياسية لإعداد لوحات NGM والمخزون البكتيري OP5025,26 ، فإننا ندرك أنه قد تكون هناك اختلافات في هذه البروتوكولات بين المختبرات المختل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحريض استجابة قوية للمريء في كل من ديدان C. elegans وخلايا Hep-3B مع VL-850
يحمي VL-850 ديدان C. elegans والخلايا الكيراتينية البشرية (خلايا HaCaT) من الإجهاد التأكسدي23. لمزيد من استكشاف آلية عملها ، درسنا ما إذا كان VL-850 يحفز الميتوفاجي في C. elegans والخلايا البشرية الأخرى. لاختبار ذلك ، قمنا بتعريض ديدان C. elegans (الشباب ، 3 أيام بعد L1) إلى 62.5 ميكرومتر VL-850 ، 5 ميكرومتر FCCP (التحكم الإيجابي) ، والمركبة (التحكم السلبي) لمدة 6 ساع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتضمن مسارات الميتوفاجي المتعددة بروتينات وجزيئات حيوية مختلفة (على سبيل المثال ، كارديوليبين29). ومع ذلك ، فإن نقطة نهاية هذه المسارات متشابهة - تدهور الميتوكوندريا بواسطة الإنزيمات الليزوزومية12,13. في الواقع ، تستخدم العديد من الطرق نقطة النهاية هذه لتحديد mitophagy. ومع ذلك ، فإن بعض الطرق ، مثل المجهر الإلكتروني ، تتطلب الوصول إلى معدات مكلفة ، وخبراء مدربين ، ووقت إعداد ممتد للعينات والتحليل. علاوة على ذلك ، على الرغم من مزايا استخدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر جروس على القراءة النقدية للمخطوطة وتعليقاتهم ونصائحهم. نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) ، لتوفير بعض السلالات. تم دعم هذا البحث بمنحة من شركة Vitalunga Ltd وصندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 989/19). تم إنشاء الشكل التجريدي الرسومي (الشكل 1) باستخدام BioRender.com.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >كاشف أو مورد < / قوي > | |||
| التوازن التحليلي | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| مستخلص الخميرة Bacto | BD-Difco | 212750 | |
| كلوريد الكالسيوم | سيجما | C1016 | |
| سيانيد الكربونيل 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) | سيجما | C2920 | |
| < قوي > كيماويات < / قوي> كوليسترول | |||
| ثيرمو فيشر | C / 5360/48 | ||
| DMEM الصناعات البيولوجية عالية الجلوكوز | 01-055-1A | ||
| الماء المقطر المزدوج (DDW) | |||
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS) | الصناعات البيولوجية | 02-023-1A | |
| FBS معطل بالحرارة | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25٪) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | الصناعات البيولوجية | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | الصناعات البيولوجية | 03-020-1B | |
| الليزوزوم / الميتوكوندريا / التلوين النووي كاشف الرسام الخلوي | Abcam | ab139487 | |
| كبريتات المغنيسيوم | سيجما | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16٪) | علوم المجهر الإلكتروني | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | ميليبور | 1.04873.1000 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | سيجما | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| كلوريد الصوديوم | Bio-Lab | 1903059100 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | جادوت | 1310732 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي الأساس dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1،8-diaminooxy-octane | براءة | ||
| < قوي > زجاج / مستهلكات بلاستيكية < / قوي > | |||
| 0.22 & مرشح المحقنة | m Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 سم ألواح بتري كورنينج | 430167 | ||
| 1,000 مل قارورة Erlenmeyer | IsoLab ، ألمانيا | ||
| 15 مل أنبوب بولي بروبلين معقم | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 مم أطباق بتري | بار ناور | BN9015810 | |
| 500 مل فلتر فراغ / نظام زجاجة التخزين ، 0.22 ؛ مو م | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 مل أنبوب بولي بروبلين معقم | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgl & auml ؛ زجاج غطاء مجهر 24 × 60 مم | أنابيب اختبار زجاجية Marienfeld | 101152 | |
| (10 مل - 13 × 100 مم) زجاج البورسليكات | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well & mu slides | iBiDi | 80826 | |
| غطاء مجهر زجاجي 24 × 40 مم | بار ناور | BN1052421ECALN | |
| إيريديوم بلاتينيوم 0.25 ملي سلك | أدوات الدقة العالمية | PT1002 | |
| <قوي> الأدوات< / قوي> | |||
| عداد الخلية CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 مجهر متحد البؤر القرص الدوار مع مرشحات DAPI و FITC و TRITC والمجال الساطع ، مع عدسة من نوع Lambda من نوع CFI Plan-Apochromat 60x (عدسة هوائية) وبرنامج | NIS-Elementsنيكون | CSU-W1 | |
| أوليمبوس SZ61 مجهر ستيريو | أوليمبوس | SZ61 | |
| مقياس الأس الهيدروجيني | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| مسدس قابل للتعديل مختبر الدوار | Labnet | H5600 |
المراجع
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insig....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
