الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات
Summary
يتطلب استكشاف الميتوفاجي من خلال المجهر الإلكتروني وأجهزة الاستشعار الجينية والتألق المناعي معدات مكلفة وموظفين مهرة واستثمارا كبيرا للوقت. هنا ، نوضح فعالية مجموعة صبغة مضان تجارية في تحديد عملية الميتوفاجي في كل من Caenorhabditis elegans وخط خلايا سرطان الكبد.
Abstract
الميتوكوندريا ضرورية لمختلف الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، واستقلاب الدهون ، وتوازن الكالسيوم ، والتخليق الحيوي للهيم ، وموت الخلايا المنظم ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تعتبر أنواع الأكسجين التفاعلية حيوية للعمليات البيولوجية الرئيسية. ومع ذلك ، عندما لا يتم التحكم فيها ، يمكن أن تؤدي إلى إصابة مؤكسدة ، بما في ذلك تلف الميتوكوندريا. تطلق الميتوكوندريا التالفة المزيد من أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تكثيف الإصابة الخلوية وحالة المرض. عملية الاستتباب تسمى الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (mitophagy) تزيل بشكل انتقائي الميتوكوندريا التالفة ، والتي يتم استبدالها بعد ذلك بأخرى جديدة. هناك العديد من مسارات الميتوفاجي ، مع نقطة النهاية المشتركة هي انهيار الميتوكوندريا التالفة في الجسيمات الحالة.
تستخدم العديد من المنهجيات ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الجينية ، والتألق المناعي للأجسام المضادة ، والمجهر الإلكتروني ، نقطة النهاية هذه لتحديد الميتوفاجي. كل طريقة لفحص الميتوفاجي لها مزاياها ، مثل استهداف الأنسجة / الخلايا المحددة (مع أجهزة الاستشعار الجينية) والتفاصيل الكبيرة (مع المجهر الإلكتروني). ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب موارد باهظة الثمن وموظفين مدربين ووقتا طويلا للتحضير قبل التجربة الفعلية ، مثل إنشاء معدلة وراثيا. هنا ، نقدم بديلا فعالا من حيث التكلفة لقياس الميتوفاجي باستخدام أصباغ الفلورسنت المتاحة تجاريا والتي تستهدف الميتوكوندريا والليزوزومات. تقيس هذه الطريقة بشكل فعال الميتوفاجي في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans وخلايا الكبد البشرية ، مما يشير إلى كفاءتها المحتملة في أنظمة النماذج الأخرى.
Introduction
الميتوكوندريا ضرورية لجميع الحيوانات الهوائية ، بما في ذلك البشر. يقومون بتحويل الطاقة الكيميائية للجزيئات الحيوية إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية1 ، وتوليف الهيم2 ، وتحلل الأحماض الدهنية من خلال أكسدةβ 3 ، وتنظيم توازن الكالسيوم4 والحديد5 ، والتحكم في موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج6 ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تلعب دورا حيويا في توازن الأكسدةوالاختزال 7. تحافظ عمليتان متكاملتان ومتعاكستان على سلامة الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة: تخليق مكونات الميتوكوندريا الجديدة (التكوين الحيوي) والإزالة الانتقائية للمكونات التالفة من خلال الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (أي الميتوفاجي)8.
يتم التوسط في العديد من مسارات الميتوفاجي بواسطة الإنزيمات ، مثل PINK1 / Parkin ، والمستقبلات ، بما في ذلك FUNDC1 و FKBP8 و BNIP / NIX9،10. والجدير بالذكر أن التدهور الانتقائي لمكونات الميتوكوندريا يمكن أن يحدث بشكل مستقل عن آلية البلعمة الذاتية (أي من خلال الحويصلات المشتقة من الميتوكوندريا)11. ومع ذلك ، فإن نقاط النهاية لمسارات الميتوفاجي الانتقائية المختلفة متشابهة (أي تدهور الميتوكوندريا بواسطة إنزيمات الليزوزومات)12,13. لهذا السبب ، تعتمد الطرق المختلفة لتحديد وقياس الميتوفاجي على التموضع المشترك لعلامات الميتوكوندريا والليزوزومية 14،15،16،17 وانخفاض مستويات بروتينات الميتوكوندريا / الحمض النووي للميتوكوندريا 18.
فيما يلي وصف موجز للمنهجيات التجريبية الحالية لقياس الميتوفاجي في الخلايا الحيوانية باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، مع التركيز على مرحلة نقطة نهاية الميتوفاجي.
أجهزة الاستشعار الحيوية Mitophagy
يحدث تدهور الميتوكوندريا داخل البيئة الحمضية للجسيمالليزوزوم 19. لذلك ، تتعرض مكونات الميتوكوندريا ، بما في ذلك البروتينات ، للتحول من الأس الهيدروجيني المحايد إلى الأس الهيدروجيني الحمضي عند نقطة نهاية عملية الميتوفاجي. يدعم هذا النمط آلية عمل العديد من أجهزة الاستشعار الحيوية للميوفاجي ، بما في ذلك mito-Rosella18 والترادف mCherry-GFP-FIS114. تحتوي هذه المستشعرات على بروتين مضان أخضر حساس لدرجة الحموضة (GFP) وبروتين مضان أحمر غير حساس لدرجة الحموضة (RFP). لذلك ، عند نقطة نهاية الميتوفاجي ، تنخفض نسبة التألق الأخضر إلى الأحمر بشكل كبير بسبب إخماد فلوروفور GFP. القيود الرئيسية لهذه المستشعرات هي (1) نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين الفلوروفورات. (2) معدل النضج التفاضلي ل GFP و RFP ؛ (3) التفكك بين GFP و RFP بسبب الانقسام البروتيني للببتيد الذي يربطهما ؛ (4) تداخل الانبعاثات الفلورية ؛ و (5) سطوع الفلوروفور التفاضلي والتبريد15,16.
المستشعر الذي يتغلب على بعض هذه القيود هو مستشعر الميتوكوندريا Keima17. يعرض مستشعر mt-Keima (المشتق من البروتين المرجاني Keima) ذروة انبعاث واحدة (620 نانومتر). ومع ذلك ، فإن قمم الإثارة حساسة لدرجة الحموضة. نتيجة لذلك ، هناك انتقال من الإثارة الخضراء (440 نانومتر) إلى الأحمر (586 نانومتر) عند التحول من درجة الحموضة العالية إلى درجة الحموضة الحمضية16,17. وقد طور جهاز استشعار الميتوفاجي الأحدث ، Mito-SRAI ، المجال من خلال السماح بالقياسات في عينات بيولوجية ثابتة20. ومع ذلك ، على الرغم من المزايا العديدة لأجهزة الاستشعار الجينية ، مثل القدرة على التعبير عنها في أنسجة / خلايا معينة واستهدافها إلى مقصورات الميتوكوندريا المتميزة ، إلا أن لها أيضا قيودا. أحد القيود هو أن أجهزة الاستشعار الجينية تحتاج إلى التعبير عنها في الخلايا أو الحيوانات ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الموارد.
بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر التعبير عن المستشعرات داخل الميتوكوندريا نفسها على وظيفة الميتوكوندريا. على سبيل المثال ، يؤدي التعبير عن GFP للميتوكوندريا (mtGFP) في عضلات جدار جسم دودة C. elegans إلى توسيع شبكة الميتوكوندريا21. يعتمد هذا النمط الظاهري على وظيفة عامل النسخ المنشط بالإجهاد ATFS-1 ، والذي يلعب دورا أساسيا في تنشيط استجابة البروتين غير المطوية في الميتوكوندريا (UPR mt) 21. لذلك ، على الرغم من أن المستشعرات الحيوية للميتوكوندريا / الميتوفاجي المشفرة وراثيا مفيدة للغاية لمراقبة توازن الميتوكوندريا في الجسم الحي ، إلا أنها قد تؤثر على العملية ذاتها المصممة لقياسها.
الأجسام المضادة والأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا / الليزوزوم
هناك استراتيجية أخرى لاختبار التوطين المشترك للميتوكوندريا / الليزوزوم وهي استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات الميتوكوندريا / الليزوزومية ، مثل بروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا TOM20 وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوزوم 1 (LAMP1) 22. في معظم الحالات ، يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفور للكشف عن إشارة التألق عبر الفحص المجهري. هناك استراتيجية أخرى تتمثل في الجمع بين التركيبات الجينية وأصباغ الميتوكوندريا / الليزوزومية ، مثل التعبير عن بنية اندماج LAMP1::GFP في الخلايا أثناء تلطيخها بصبغة ميتوكوندريا حمراء (على سبيل المثال ، Mitotracker Red)16. تتطلب هذه المنهجيات ، على الرغم من فعاليتها ، أجساما مضادة محددة وغالبا ما تتضمن العمل مع عينات ثابتة أو توليد خلايا / محورة وراثيا تعبر عن الميتوكوندريا / الجسيمات الحالة الفلورية.
هنا ، نوضح استخدام مجموعة تلطيخ الليزوزوم / الميتوكوندريا / النووية التجارية لتقييم خصائص تنشيط الميتوفاجي للديامين الاصطناعي O ، O (أوكتان -1،8-دييل) مكرر (هيدروكسيلامين) ، المشار إليه فيما يلي باسم VL-85023 ، في ديدان C. elegans وخط الخلايا السرطانية البشرية Hep-3B (الشكل 1). تحتوي مجموعة التلوين على مزيج من الأصباغ الليزوزومية / الميتوكوندريا / النووية المستهدفة التي تلطخ هذه العضيات على وجه التحديد23. استخدمنا هذه المجموعة سابقا لإثبات نشاط الميتوفاجي ل 1,8 ديامينوكتان (يشار إليه فيما يلي باسم VL-004) في C. elegans23. الأهم من ذلك ، قمنا بالتحقق من صحة نتائج مجموعة التلوين باستخدام المستشعر الحيوي mito-Rosella وقياسات qPCR للميتوكوندريا: محتوى الحمض النوويالنووي 23. توفر مجموعة التلوين هذه المزايا التالية. أولا ، ليست هناك حاجة لتوليد أو خلايا محورة وراثيا تعبر عن مستشعر حيوي للميتوكوندريا. لذلك ، يمكننا دراسة الحيوانات أو الخلايا البرية غير المعدلة ، وبالتالي توفير الكثير من الوقت والمال والعمل. علاوة على ذلك ، كما ذكرنا ، فإن التعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية للميتوكوندريا يمكن أن يغير وظيفة الميتوكوندريا. ثانيا ، المجموعة فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام وسريعة. ثالثا ، على الرغم من أننا نوضح الطريقة في C. elegans والخلايا البشرية ، إلا أنه يمكن تعديلها لأنواع الخلايا والكائنات الحية الأخرى.
مع ذلك ، مثل أي طريقة ، فإن بروتوكول مجموعة التلوين له عيوب. على سبيل المثال ، يتم تنفيذ حضانة الديدان مع الكاشف في غياب الطعام (لقد رأينا أنه حتى البكتيريا الميتة تقلل بشكل كبير من كفاءة تلطيخ). على الرغم من أن وقت الحضانة قصير نسبيا ، فمن الممكن أنه حتى في هذا الإطار الزمني ، قد تتغير استجابات الاستتباب ، بما في ذلك الميتوفاجي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر ارتباط الأصباغ ببروتينات ER / الميتوكوندريا / النووية والجزيئات الحيوية الأخرى على أنشطة هذه العضيات. علاوة على ذلك ، على عكس قياس الميتوفاجي باستخدام أجهزة الاستشعار الجينية ، فإننا نعمل مع الديدان والخلايا التي خضعت للتثبيت الكيميائي. لذلك ، من المستحيل الاستمرار في مراقبة نفس الديدان / الخلايا في أوقات مختلفة. ومن ثم ، نوصي بدمج منهجيات مختلفة للتحقق من صحة وظيفة الميتوفاجي في عملية فسيولوجية معينة. أدناه ، نقدم بيانات جديدة توضح أن VL-850 يحفز الميتوفاجي القوي في ديدان C. elegans وخلايا Hep-3B. لذلك ، تدعم هذه البيانات الفرضية القائلة بأن VL-850 يطيل عمر C. elegans ويحمي C. elegans من التلف التأكسدي من خلال تحريض mitophagy صحية . لقد استخدمنا سيانيد البروتون الأيونوفور الكربونيل 4- (ثلاثي فلورو روميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، وهو محفز قوي للميتوفاجي24 ، كعنصر تحكم إيجابي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتضمن مسارات الميتوفاجي المتعددة بروتينات وجزيئات حيوية مختلفة (على سبيل المثال ، كارديوليبين29). ومع ذلك ، فإن نقطة نهاية هذه المسارات متشابهة – تدهور الميتوكوندريا بواسطة الإنزيمات الليزوزومية12,13. في الواقع ، تستخدم العديد من الطرق نقطة النه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر جروس على القراءة النقدية للمخطوطة وتعليقاتهم ونصائحهم. نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) ، لتوفير بعض السلالات. تم دعم هذا البحث بمنحة من شركة Vitalunga Ltd وصندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 989/19). تم إنشاء الشكل التجريدي الرسومي (الشكل 1) باستخدام BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
