Detecção de Mitofagia em Caenorhabditis elegans e Células de Mamíferos Usando Corantes Organel-Específicos

Summary

Explorar a mitofagia por meio de microscopia eletrônica, sensores genéticos e imunofluorescência requer equipamentos caros, pessoal qualificado e um investimento de tempo significativo. Aqui, demonstramos a eficácia de um kit comercial de corante de fluorescência na quantificação do processo de mitofagia em ambos Caenorhabditis elegans e uma linhagem celular de câncer de fígado.

Abstract

As mitocôndrias são essenciais para várias funções biológicas, incluindo produção de energia, metabolismo lipídico, homeostase do cálcio, biossíntese do heme, morte celular regulada e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). As ROS são vitais para os principais processos biológicos. No entanto, quando não controladas, podem levar a lesões oxidativas, incluindo danos mitocondriais. As mitocôndrias danificadas liberam mais EROs, intensificando assim a lesão celular e o estado da doença. Um processo homeostático chamado autofagia mitocondrial (mitofagia) remove seletivamente as mitocôndrias danificadas, que são então substituídas por novas. Existem múltiplas vias de mitofagia, com o objetivo comum sendo a quebra das mitocôndrias danificadas nos lisossomos.

Várias metodologias, incluindo sensores genéticos, imunofluorescência de anticorpos e microscopia eletrônica, usam esse desfecho para quantificar a mitofagia. Cada método para examinar a mitofagia tem suas vantagens, como o direcionamento específico de tecido/célula (com sensores genéticos) e grande detalhe (com microscopia eletrônica). No entanto, esses métodos geralmente exigem recursos caros, pessoal treinado e um longo tempo de preparação antes do experimento real, como para a criação de animais transgênicos. Aqui, apresentamos uma alternativa custo-efetiva para medir mitofagia usando corantes fluorescentes comercialmente disponíveis visando mitocôndrias e lisossomos. Este método mede efetivamente a mitofagia no nematoide Caenorhabditis elegans e em células hepáticas humanas, o que indica sua potencial eficiência em outros sistemas modelo.

Introduction

As mitocôndrias são essenciais para todos os animais aeróbicos, incluindo os seres humanos. Eles convertem a energia química das biomoléculas em trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa¹, sintetizam heme², degradam ácidos graxos através da oxidação β³, regulam a homeostase do cálcio⁴ e ferro⁵, controlam a morte celular pela apoptose⁶ e geram espécies reativas de oxigênio (EROs), que desempenham um papel vital na homeostase redox7. Dois processos complementares e opostos mantêm a integridade e o bom funcionamento das mitocôndrias: a síntese de novos componentes mitocondriais (biogênese) e a remoção seletiva dos danificados através da autofagia mitocondrial (i.e., mitofagia)⁸.

Várias vias mitofágicas são mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, e receptores, incluindo FUNDC1, FKBP8 e BNIP/NIX ^9,10. Notadamente, a degradação seletiva de componentes mitocondriais pode ocorrer independentemente da maquinaria autofagossomal (isto é, através de vesículas derivadas da mitocôndria)¹¹. No entanto, os desfechos das diferentes vias de mitofagia seletiva são semelhantes (i.e., degradação mitocondrial por enzimas lisossômicas)^12,13. Por essa razão, vários métodos de identificação e mensuração da mitofagia dependem da colocalização de marcadores mitocondriais e lisossômicos 14,15,16,17 e diminuição dos níveis de proteínas mitocondriais/DNA mitocondrial ¹⁸.

A seguir, uma descrição concisa das metodologias experimentais existentes para medir a mitofagia em células animais usando microscopia de fluorescência, enfatizando a fase final da mitofagia.

Biossensores de mitofagia
A degradação mitocondrial ocorre no ambiente ácido do lisossomo¹⁹. Portanto, os componentes mitocondriais, incluindo proteínas, experimentam uma mudança de um pH neutro para um pH ácido no final do processo de mitofagia. Esse padrão sustenta o mecanismo de ação de vários biossensores mitofágicos, incluindo mito-Rosella¹⁸ e mCherry-GFP-FIS1 em tandem1¹⁴. Esses sensores contêm uma proteína de fluorescência verde sensível ao pH (GFP) e uma proteína de fluorescência vermelha (RFP) insensível ao pH. Portanto, no final da mitofagia, a razão de fluorescência verde-vermelho cai significativamente devido à extinção do fluoróforo GFP. As principais limitações desses sensores são (1) possível transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre os fluoróforos; (2) a taxa de maturação diferencial de GFP e RFP; (3) dissociação entre GFP e RFP devido à clivagem proteolítica do polipeptídeo que as conecta; (4) sobreposição de fluorescência-emissão; e (5) brilho diferencial do fluoróforo e têmpera^15,16.

Um sensor que supera algumas dessas limitações é o sensor mitocondrial^Keima17. O sensor mt-Keima (derivado da proteína coral Keima) exibe um único pico de emissão (620 nm). No entanto, seus picos de excitação são sensíveis ao pH. Como resultado, há uma transição de uma excitação verde (440 nm) para uma excitação vermelha (586 nm) ao mudar de um pH elevado para um pH ácido^16,17. Um sensor de mitofagia mais recente, o Mito-SRAI, tem avançado o campo ao permitir medições em amostras biológicas fixas²⁰. No entanto, apesar das muitas vantagens dos sensores genéticos, como a capacidade de expressá-los em tecidos/células específicos e direcioná-los para compartimentos mitocondriais distintos, eles também apresentam limitações. Uma limitação é que os sensores genéticos precisam ser expressos em células ou animais, o que pode ser demorado e intensivo em recursos.

Além disso, a expressão dos sensores dentro das próprias mitocôndrias pode influenciar a função mitocondrial. Por exemplo, a expressão de GFP mitocondrial (mtGFP) nos músculos da parede do corpo do verme C. elegans expande a rede mitocondrial²¹. Esse fenótipo depende da função do fator de transcrição ativado por estresse ATFS-1, que desempenha um papel essencial na ativação da resposta proteica desdobrada na mitocôndria (UPR^mt)²¹. Portanto, embora os biossensores mitocondria/mitofagia codificados geneticamente sejam extremamente úteis para monitorar a homeostase mitocondrial in vivo, eles podem afetar o próprio processo que são projetados para medir.

Anticorpos e corantes mitocondria/lisossomos específicos
Outra estratégia para testar a colocalização mitocondrial/lisossomal é a utilização de anticorpos contra proteínas mitocondriais/lisossomais, como a proteína de membrana externa mitocondrial TOM20 e a proteína de membrana associada lisossomal 1 (LAMP1)²². Na maioria dos casos, anticorpos secundários que são conjugados a um fluoróforo são usados para detectar o sinal de fluorescência via microscopia. Outra estratégia é combinar construções genéticas com corantes mitocondriais/lisossomais, como expressar uma fusão LAMP1::GFP em células enquanto as cora com um corante mitocondrial vermelho (por exemplo, Mitotracker Red)¹⁶. Essas metodologias, embora eficazes, requerem anticorpos específicos e muitas vezes envolvem o trabalho com espécimes fixos ou a geração de células/animais transgênicos expressando mitocôndrias/lisossomos marcados fluorescentemente.

Neste artigo, descrevemos a utilização de um kit comercial de coloração lisossomos/mitocôndrias/nucleares para avaliar as propriedades ativadoras da mitofagia da diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), doravante denominada VL-850²³, em vermes de C. elegans e na linhagem de células cancerígenas humanas Hep-3B (Figura 1). O kit de coloração contém uma mistura de corantes lisossômicos/mitocondriais/nuclear-direcionados que coram especificamente essas organelas²³. Utilizamos previamente este kit para demonstrar a atividade mitofágica de 1,8 diaminooctano (doravante denominada VL-004) em C. elegans²³. É importante ressaltar que validamos os resultados do kit de coloração com o biossensor mito-Rosella e medidas de qPCR do conteúdo de DNA mitocondrial:nuclear²³. Este kit de coloração oferece as seguintes vantagens. Primeiro, não há necessidade de gerar animais transgênicos ou células expressando um biossensor mitocondrial. Portanto, podemos estudar animais ou células selvagens não modificados e, assim, economizar muito tempo, dinheiro e trabalho. Além disso, como mencionado, a expressão de biossensores mitocondriais pode alterar a função mitocondrial. Em segundo lugar, o kit é econômico, fácil de usar e rápido. Terceiro, embora demonstremos o método em células de C. elegans e humanas, ele poderia ser modificado para outros tipos celulares e organismos.

Dito isso, como qualquer método, o protocolo do kit de coloração tem desvantagens. Por exemplo, a incubação dos vermes com o reagente é realizada na ausência de alimento (vimos que mesmo bactérias mortas diminuem significativamente a eficiência de coloração). Embora o tempo de incubação seja relativamente curto, é possível que, mesmo nesse período de tempo, as respostas homeostáticas possam estar alteradas, incluindo a mitofagia. Além disso, a ligação dos corantes às proteínas ER/mitocondriais/nucleares e outras biomoléculas pode afetar as atividades dessas organelas. Além disso, ao contrário da medição da mitofagia com sensores genéticos, trabalhamos com vermes e células que sofreram fixação química. Portanto, é impossível continuar monitorando os mesmos vermes/células em momentos diferentes. Assim, recomenda-se a combinação de diferentes metodologias para validar a função da mitofagia em um determinado processo fisiológico. A seguir, apresentamos novos dados demonstrando que o VL-850 induz mitofagia robusta em vermes C. elegans e células Hep-3B. Portanto, esses dados apoiam ainda mais a hipótese de que o VL-850 estende a vida útil de C. elegans e protege C. elegans de danos oxidativos através da indução de mitofagia saudável . Utilizamos o ionóforo de prótons carbonil cianeto 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que é um potente indutor de mitofagia²⁴, como controle positivo.

Protocol

NOTA: Para maior comodidade dos leitores, dividimos o protocolo em duas partes: uma enfoca o protocolo de medição de mitofagia em C. elegans, e a outra foca o protocolo de medição de mitofagia em células hepáticas. A lista de materiais pode ser encontrada na Tabela de Materiais fornecidos. 1. O protocolo de C. elegans Preparo das placas de meio de cultura do nematoide (NGM) e do estoque bacteriano OP50 de Escherichia coli<…

Representative Results

Indução de uma resposta robusta de mitofagia em vermes C. elegans e células Hep-3B com VL-850O VL-850 protege vermes C. elegans e queratinócitos humanos (células HaCaT) do estresse oxidativo23. Para explorar melhor seu mecanismo de ação, examinamos se o VL-850 induz mitofagia em C. elegans e outras células humanas. Para testar isso, expomos vermes C. elegans (adultos jovens, 3 dias pós-L1) a 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (controle pos…

Discussion

Múltiplas vias de mitofagia envolvem várias proteínas e biomoléculas (por exemplo, cardiolipina²⁹). Entretanto, o desfecho dessas vias é semelhante, a degradação das mitocôndrias por enzimas lisossômicas^12,13. De fato, vários métodos utilizam esse desfecho para quantificar a mitofagia. No entanto, alguns métodos, como a microscopia eletrônica, exigem acesso a equipamentos caros, especialistas treinados e um tempo de preparaç?…

Materials

Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600