オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出
Summary
電子顕微鏡、遺伝子センサー、免疫蛍光法によるマイトファジーの探索には、高価な機器、熟練した人員、および多大な時間投資が必要です。ここでは、 カエノラブディティスエレガンス と肝がん細胞株の両方におけるマイトファジープロセスの定量化における市販の蛍光色素キットの有効性を実証します。
Abstract
ミトコンドリアは、エネルギー生産、脂質代謝、カルシウム恒常性、ヘム生合成、細胞死の制御、活性酸素種(ROS)の生成など、さまざまな生物学的機能に不可欠です。ROSは重要な生物学的プロセスに不可欠です。ただし、制御されていない場合、ミトコンドリアの損傷を含む酸化的損傷を引き起こす可能性があります。損傷したミトコンドリアはより多くのROSを放出し、それによって細胞傷害および疾患状態を強める。ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)と呼ばれる恒常性維持プロセスは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去し、その後、新しいミトコンドリアに置き換えられます。複数のマイトファジー経路があり、共通のエンドポイントはリソソームの損傷したミトコンドリアの分解です。
遺伝子センサー、抗体免疫蛍光法、電子顕微鏡法などのいくつかの方法論では、このエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化します。マイトファジーを調べるための各方法には、特定の組織/細胞の標的化(遺伝子センサーを使用)や非常に詳細(電子顕微鏡を使用)などの利点があります。しかしながら、これらの方法は、しばしば高価な資源、訓練を受けた人員、およびトランスジェニック動物の作成などの実際の実験の前に長い準備時間を必要とする。ここでは、ミトコンドリアとリソソームを標的とする市販の蛍光色素を使用してマイトファジーを測定するための費用対効果の高い代替手段を紹介します。この方法は、線虫カ エノラブディティスエレガンス とヒト肝細胞のマイトファジーを効果的に測定し、他のモデルシステムでの潜在的な効率を示しています。
Introduction
ミトコンドリアは、人間を含むすべての好気性動物にとって不可欠です。生体分子の化学エネルギーを酸化的リン酸化1によるアデノシン三リン酸(ATP)への変換、ヘム2の合成、β酸化3による脂肪酸の分解、カルシウム4と鉄5の恒常性を調節し、アポトーシス6による細胞死の制御、酸化還元恒常性に重要な役割を果たす活性酸素種(ROS)の生成7.新しいミトコンドリア成分の合成(生合成)と、ミトコンドリアのオートファジー(すなわちマイトファジー)による損傷成分の選択的除去という2つの相補的で反対のプロセスがミトコンドリアの完全性と適切な機能を維持します8。
いくつかのマイトファジー経路は、PINK1 /パーキンなどの酵素、およびFUNDC1、FKBP8、およびBNIP/NIX 9,10などの受容体によって媒介されます。特に、ミトコンドリア成分の選択的分解は、オートファゴソーム機構とは無関係に(すなわち、ミトコンドリア由来の小胞を介して)起こり得る11。しかし、異なる選択的マイトファジー経路のエンドポイントは類似している(すなわち、リソソーム酵素によるミトコンドリア分解)12,13。このため、マイトファジーを同定および測定するためのさまざまな方法は、ミトコンドリアマーカーとリソソームマーカーの共局在14,15,16,17、およびミトコンドリアタンパク質/ミトコンドリアDNAのレベルの低下に依存しています18。
以下は、蛍光顕微鏡を使用して動物細胞のマイトファジーを測定するための既存の実験方法論の簡潔な説明であり、マイトファジーエンドポイントフェーズを強調しています。
マイトファジーバイオセンサー
ミトコンドリア分解は、リソソーム19の酸性環境内で起こる。したがって、タンパク質を含むミトコンドリア成分は、マイトファジープロセスのエンドポイントで中性pHから酸性pHへの移行を経験します。このパターンは、マイトロゼラ18 やタンデムmCherry-GFP-FIS114など、いくつかのマイトファジーバイオセンサーの作用機序を支えています。これらのセンサーには、pH感受性緑色蛍光タンパク質(GFP)とpH非感受性赤色蛍光タンパク質(RFP)が含まれています。したがって、マイトファジーのエンドポイントでは、GFP蛍光色素の消光により、緑から赤の蛍光比が大幅に低下します。これらのセンサーの主な制限は、(1)蛍光色素間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の可能性です。(2)GFPとRFPの成熟率の違い。(3)GFPとRFPとの間の解離が、それらを連結するポリペプチドのタンパク質分解的切断による;(4)蛍光-発光オーバーラップ;(5)蛍光色素の輝度と消光の差15、16。
これらの制限のいくつかを克服するセンサは、Keimaミトコンドリアセンサ17である。mt-Keimaセンサー(サンゴタンパク質Keima由来)は、単一の発光ピーク(620 nm)を表示します。しかしながら、その励起ピークはpH感受性である。その結果、高pHから酸性pH 16,17に移行すると、緑色の励起(440 nm)から赤色の励起(586 nm)に遷移します。より最近のマイトファジーセンサーであるMito-SRAIは、固定された生物学的サンプル20での測定を可能にすることにより、この分野を進歩させました。ただし、特定の組織/細胞でそれらを発現し、それらを異なるミトコンドリアコンパートメントに標的とする能力など、遺伝子センサーには多くの利点がありますが、それらには制限もあります。1つの制限は、遺伝子センサーを細胞または動物で発現させる必要があり、時間とリソースを大量に消費する可能性があることです。
さらに、ミトコンドリア内のセンサー自体の発現は、ミトコンドリアの機能に影響を与える可能性があります。例えば、ミトコンドリアGFP(mtGFP)を線虫体壁筋に発現させると、 ミ トコンドリアネットワーク21が拡大する。この表現型は、ミトコンドリア(UPRmt)における折り畳まれていないタンパク質応答の活性化に不可欠な役割を果たすストレス活性化転写因子ATFS-1の機能に依存します21。したがって、遺伝的にコードされたミトコンドリア/マイトファジーバイオセンサーは、 in vivoでのミトコンドリアの恒常性のモニタリングに非常に役立ちますが、測定するように設計されたプロセスそのものに影響を与える可能性があります。
ミトコンドリア/リソソーム特異的抗体および色素
ミトコンドリア/リソソーム共局在を試験するための別の戦略は、ミトコンドリア外膜タンパク質TOM20やリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)22などのミトコンドリア/リソソームタンパク質に対する抗体を使用することです。ほとんどの場合、蛍光色素に結合した二次抗体は、顕微鏡 で 蛍光シグナルを検出するために使用されます。別の戦略は、細胞内でLAMP1::GFP融合コンストラクトを発現させながら、赤色のミトコンドリア色素(例えば、Mitotracker Red)16で染色するなど、遺伝子構築物をミトコンドリア/リソソーム色素と組み合わせることです。これらの方法論は効果的ですが、特異的抗体を必要とし、多くの場合、固定標本での作業や、蛍光標識されたミトコンドリア/リソソームを発現する細胞/トランスジェニック動物の生成が含まれます。
本稿では、合成ジアミンO,O(オクタン-1,8-ジイル)ビス(ヒドロキシルアミン)(以下VL-85023と呼ぶ)のマイトファジー活性化特性を評価するための市販のリソソーム/ミトコンドリア/核染色キットの利用について、C.エレガンス線虫およびヒトがん細胞株Hep-3Bにおいて概説する(図1)。染色キットには、これらの細胞小器官を特異的に染色するリソソーム/ミトコンドリア/核標的色素の混合物が含まれています23。我々は以前、このキットを用いて、C. elegans23における1,8-ジアミノオクタン(以下、VL-004)のマイトファジー活性を実証した。重要なことに、ミト・ロゼラバイオセンサーとミトコンドリア:核DNA含有量のqPCR測定で染色キットの結果を検証しました23。この染色キットには、次のような利点があります。第1に、ミトコンドリアバイオセンサを発現するトランスジェニック動物または細胞を生成する必要がない。したがって、改変されていない野生型の動物や細胞を研究することができ、したがって、多くの時間、お金、労力を節約できます。さらに、前述のように、ミトコンドリアバイオセンサーを発現させることは、ミトコンドリア機能を変化させることができる。第二に、キットは費用効果が高く、使いやすく、高速です。第三に、C.エレガンスとヒト細胞でこの方法を実証していますが、他の細胞型や生物に合わせて変更することもできます。
そうは言っても、他の方法と同様に、染色キットプロトコルには欠点があります。例えば、試薬とのワームのインキュベーションは、食物の不在下で行われる(我々は、死んだ細菌でさえ染色効率を著しく低下させることを見てきた)。インキュベーション時間は比較的短いですが、この時間枠でも、マイトファジーを含む恒常性応答が変化する可能性があります。さらに、色素のER /ミトコンドリア/核タンパク質および他の生体分子への結合は、これらの細胞小器官の活動に影響を与える可能性があります。また、遺伝子センサーによるマイトファジー測定とは異なり、化学固定を受けた線虫や細胞を扱います。したがって、同じワーム/細胞を異なる時間に監視し続けることは不可能です。したがって、特定の生理学的プロセスにおけるマイトファジーの機能を検証するために、さまざまな方法論を組み合わせることをお勧めします。以下に、VL-850が C.エレガンス 線虫およびHep-3B細胞において堅牢なマイトファジーを誘導することを示す新しいデータを示す。したがって、これらのデータは、VL-850が C.エレガンス の寿命を延ばし、健康なマイトファジーの誘導を通じて C.エレガンス を酸化的損傷から保護するという仮説をさらに支持しています。我々は、強力なマイトファジー誘導因子24であるプロトンイオノフォアカルボニルシアニド4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)をポジティブコントロールとして使用しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
複数のマイトファジー経路には、さまざまなタンパク質や生体分子(カルジオリピン29など)が含まれます。しかし、これらの経路のエンドポイントは類似しており、リソソーム酵素によるミトコンドリアの分解である12,13。実際、いくつかの方法でこのエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化しています。ただし、電子?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を批判的に読んでくださったグロス研究所のメンバーと、彼らのコメントとアドバイスに感謝します。我々は、国立衛生研究所研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けているカエノラブディティス遺伝学センター(CGC)に、いくつかの菌株を提供してくれたことに感謝する。この研究は、Vitalunga Ltdとイスラエル科学財団からの助成金(助成金番号989/19)によって支援されました。グラフィカルな抽象図(図1)は、BioRender.com で生成されました。
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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