Summary
電子顕微鏡、遺伝子センサー、免疫蛍光法によるマイトファジーの探索には、高価な機器、熟練した人員、および多大な時間投資が必要です。ここでは、 カエノラブディティスエレガンス と肝がん細胞株の両方におけるマイトファジープロセスの定量化における市販の蛍光色素キットの有効性を実証します。
Abstract
ミトコンドリアは、エネルギー生産、脂質代謝、カルシウム恒常性、ヘム生合成、細胞死の制御、活性酸素種(ROS)の生成など、さまざまな生物学的機能に不可欠です。ROSは重要な生物学的プロセスに不可欠です。ただし、制御されていない場合、ミトコンドリアの損傷を含む酸化的損傷を引き起こす可能性があります。損傷したミトコンドリアはより多くのROSを放出し、それによって細胞傷害および疾患状態を強める。ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)と呼ばれる恒常性維持プロセスは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去し、その後、新しいミトコンドリアに置き換えられます。複数のマイトファジー経路があり、共通のエンドポイントはリソソームの損傷したミトコンドリアの分解です。
遺伝子センサー、抗体免疫蛍光法、電子顕微鏡法などのいくつかの方法論では、このエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化します。マイトファジーを調べるための各方法には、特定の組織/細胞の標的化(遺伝子センサーを使用)や非常に詳細(電子顕微鏡を使用)などの利点があります。しかしながら、これらの方法は、しばしば高価な資源、訓練を受けた人員、およびトランスジェニック動物の作成などの実際の実験の前に長い準備時間を必要とする。ここでは、ミトコンドリアとリソソームを標的とする市販の蛍光色素を使用してマイトファジーを測定するための費用対効果の高い代替手段を紹介します。この方法は、線虫カ エノラブディティスエレガンス とヒト肝細胞のマイトファジーを効果的に測定し、他のモデルシステムでの潜在的な効率を示しています。
Introduction
ミトコンドリアは、人間を含むすべての好気性動物にとって不可欠です。生体分子の化学エネルギーを酸化的リン酸化1によるアデノシン三リン酸(ATP)への変換、ヘム2の合成、β酸化3による脂肪酸の分解、カルシウム4と鉄5の恒常性を調節し、アポトーシス6による細胞死の制御、酸化還元恒常性に重要な役割を果たす活性酸素種(ROS)の生成7.新しいミトコンドリア成分の合成(生合成)と、ミトコンドリアのオートファジー(すなわちマイトファジー)による損傷成分の選択的除去という2つの相補的で反対のプロセスがミトコンドリアの完全性と適切な機能を維持します8。
いくつかのマイトファジー経路は、PINK1 /パーキンなどの酵素、およびFUNDC1、FKBP8、およびBNIP/NIX 9,10などの受容体によって媒介されます。特に、ミトコンドリア成分の選択的分解は、オートファゴソーム機構とは無関係に(すなわち、ミトコンドリア由来の小胞を介して)起こり得る11。しかし、異なる選択的マイトファジー経路のエンドポイントは類似している(すなわち、リソソーム酵素によるミトコンドリア分解)12,13。このため、マイトファジーを同定および測定するためのさまざまな方法は、ミトコンドリアマーカーとリソソームマーカーの共局在14,15,16,17、およびミトコンドリアタンパク質/ミトコンドリアDNAのレベルの低下に依存しています18。
以下は、蛍光顕微鏡を使用して動物細胞のマイトファジーを測定するための既存の実験方法論の簡潔な説明であり、マイトファジーエンドポイントフェーズを強調しています。
マイトファジーバイオセンサー
ミトコンドリア分解は、リソソーム19の酸性環境内で起こる。したがって、タンパク質を含むミトコンドリア成分は、マイトファジープロセスのエンドポイントで中性pHから酸性pHへの移行を経験します。このパターンは、マイトロゼラ18 やタンデムmCherry-GFP-FIS114など、いくつかのマイトファジーバイオセンサーの作用機序を支えています。これらのセンサーには、pH感受性緑色蛍光タンパク質(GFP)とpH非感受性赤色蛍光タンパク質(RFP)が含まれています。したがって、マイトファジーのエンドポイントでは、GFP蛍光色素の消光により、緑から赤の蛍光比が大幅に低下します。これらのセンサーの主な制限は、(1)蛍光色素間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の可能性です。(2)GFPとRFPの成熟率の違い。(3)GFPとRFPとの間の解離が、それらを連結するポリペプチドのタンパク質分解的切断による;(4)蛍光-発光オーバーラップ;(5)蛍光色素の輝度と消光の差15、16。
これらの制限のいくつかを克服するセンサは、Keimaミトコンドリアセンサ17である。mt-Keimaセンサー(サンゴタンパク質Keima由来)は、単一の発光ピーク(620 nm)を表示します。しかしながら、その励起ピークはpH感受性である。その結果、高pHから酸性pH 16,17に移行すると、緑色の励起(440 nm)から赤色の励起(586 nm)に遷移します。より最近のマイトファジーセンサーであるMito-SRAIは、固定された生物学的サンプル20での測定を可能にすることにより、この分野を進歩させました。ただし、特定の組織/細胞でそれらを発現し、それらを異なるミトコンドリアコンパートメントに標的とする能力など、遺伝子センサーには多くの利点がありますが、それらには制限もあります。1つの制限は、遺伝子センサーを細胞または動物で発現させる必要があり、時間とリソースを大量に消費する可能性があることです。
さらに、ミトコンドリア内のセンサー自体の発現は、ミトコンドリアの機能に影響を与える可能性があります。例えば、ミトコンドリアGFP(mtGFP)を線虫体壁筋に発現させると、 ミ トコンドリアネットワーク21が拡大する。この表現型は、ミトコンドリア(UPRmt)における折り畳まれていないタンパク質応答の活性化に不可欠な役割を果たすストレス活性化転写因子ATFS-1の機能に依存します21。したがって、遺伝的にコードされたミトコンドリア/マイトファジーバイオセンサーは、 in vivoでのミトコンドリアの恒常性のモニタリングに非常に役立ちますが、測定するように設計されたプロセスそのものに影響を与える可能性があります。
ミトコンドリア/リソソーム特異的抗体および色素
ミトコンドリア/リソソーム共局在を試験するための別の戦略は、ミトコンドリア外膜タンパク質TOM20やリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)22などのミトコンドリア/リソソームタンパク質に対する抗体を使用することです。ほとんどの場合、蛍光色素に結合した二次抗体は、顕微鏡 で 蛍光シグナルを検出するために使用されます。別の戦略は、細胞内でLAMP1::GFP融合コンストラクトを発現させながら、赤色のミトコンドリア色素(例えば、Mitotracker Red)16で染色するなど、遺伝子構築物をミトコンドリア/リソソーム色素と組み合わせることです。これらの方法論は効果的ですが、特異的抗体を必要とし、多くの場合、固定標本での作業や、蛍光標識されたミトコンドリア/リソソームを発現する細胞/トランスジェニック動物の生成が含まれます。
本稿では、合成ジアミンO,O(オクタン-1,8-ジイル)ビス(ヒドロキシルアミン)(以下VL-85023と呼ぶ)のマイトファジー活性化特性を評価するための市販のリソソーム/ミトコンドリア/核染色キットの利用について、C.エレガンス線虫およびヒトがん細胞株Hep-3Bにおいて概説する(図1)。染色キットには、これらの細胞小器官を特異的に染色するリソソーム/ミトコンドリア/核標的色素の混合物が含まれています23。我々は以前、このキットを用いて、C. elegans23における1,8-ジアミノオクタン(以下、VL-004)のマイトファジー活性を実証した。重要なことに、ミト・ロゼラバイオセンサーとミトコンドリア:核DNA含有量のqPCR測定で染色キットの結果を検証しました23。この染色キットには、次のような利点があります。第1に、ミトコンドリアバイオセンサを発現するトランスジェニック動物または細胞を生成する必要がない。したがって、改変されていない野生型の動物や細胞を研究することができ、したがって、多くの時間、お金、労力を節約できます。さらに、前述のように、ミトコンドリアバイオセンサーを発現させることは、ミトコンドリア機能を変化させることができる。第二に、キットは費用効果が高く、使いやすく、高速です。第三に、C.エレガンスとヒト細胞でこの方法を実証していますが、他の細胞型や生物に合わせて変更することもできます。
そうは言っても、他の方法と同様に、染色キットプロトコルには欠点があります。例えば、試薬とのワームのインキュベーションは、食物の不在下で行われる(我々は、死んだ細菌でさえ染色効率を著しく低下させることを見てきた)。インキュベーション時間は比較的短いですが、この時間枠でも、マイトファジーを含む恒常性応答が変化する可能性があります。さらに、色素のER /ミトコンドリア/核タンパク質および他の生体分子への結合は、これらの細胞小器官の活動に影響を与える可能性があります。また、遺伝子センサーによるマイトファジー測定とは異なり、化学固定を受けた線虫や細胞を扱います。したがって、同じワーム/細胞を異なる時間に監視し続けることは不可能です。したがって、特定の生理学的プロセスにおけるマイトファジーの機能を検証するために、さまざまな方法論を組み合わせることをお勧めします。以下に、VL-850が C.エレガンス 線虫およびHep-3B細胞において堅牢なマイトファジーを誘導することを示す新しいデータを示す。したがって、これらのデータは、VL-850が C.エレガンス の寿命を延ばし、健康なマイトファジーの誘導を通じて C.エレガンス を酸化的損傷から保護するという仮説をさらに支持しています。我々は、強力なマイトファジー誘導因子24であるプロトンイオノフォアカルボニルシアニド4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)をポジティブコントロールとして使用しました。
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Protocol
注:読者の便宜のために、プロトコルを2つの部分に分けました:1つは C.エレガンスのマイトファジーを測定するためのプロトコルに焦点を当て、もう1つは肝細胞のマイトファジーを測定するためのプロトコルに焦点を当てています。材料のリストは、提供されている 材料の表 にあります。
1. C.エレガンス プロトコル
- 線虫増殖培地(NGM)プレートおよび 大腸菌 OP50細菌ストックの調製
注:明確にするために、NGMプレートとOP50細菌ストックの調製のための標準プロトコルに従いましたが25,26、異なるラボ間でこれらのプロトコルにばらつきがある可能性があることを認識しています。したがって、実験の正確な複製を保証するための完全なプロトコルが含まれています。- pH 6に達するまで、1 M K 2 HPO 4 500 mL の 1 M K2HPO4 に 500 mL の 1 M リン酸カリウムバッファー pH 6 を加えます。バッファーを0.22 μmの真空フィルター/保存システムに通して滅菌します。
- 0.1 Mの塩化カルシウム(CaCl2)と硫酸マグネシウム(MgSO4)を作り、0.2 μmのシリンジフィルターで滅菌します。
- 無水エタノールで5 mg / mLコレステロールを調製します。
注:コレステロールはエタノールで調製されるため、ろ過しないでください。 - 塩化ナトリウム(NaCl)1.5 g、ペプトン1.25 g、寒天8.5 gを500 mLの二重蒸留水(DDW)に溶解してNGM寒天を調製します。オートクレーブし、~55°Cまで冷却します。
- 無菌条件下で、12.5 mLのリン酸カリウム緩衝液(pH 6)、0.5 mLの0.1 M CaCl2、0.5 mLの0.1 M MgSO4、 および1 mLの5 mg/mLコレステロールを加えます。追加するたびによく混ぜます。
- 融解したNGM寒天培地4 mLを各35 mmプレートに加えます。皿を一晩放置して、室温(RT、~21°C)で固化させます。
- ルリア・ベルターニ(LB)寒天プレートを作るには、5 gのNaCl、5 gのトリプトン、2.5 gの酵母エキス、7.5 gの寒天を400 mLの蒸留脱イオン水(DDW)に溶解し、溶液のpHを7.0に調整し、重水素減少水で容量を500 mLまで上げ、オートクレーブします。溶液が55°Cに冷却されたら、25 mLの混合物を各90 mmのペトリ皿に注ぎ、プレートを室温で2日間乾燥させます。次に、グリセロールストックから乾燥したLBプレート上のOP50菌をストリークアウトし、37°Cで一晩インキュベートして、単一のコロニーを得ました。
- 2 gのトリプトン、8 gの酵母エキス、および2.5 gの塩化ナトリウム(NaCl)を0.5 Lの重水素減少水に溶解して、2x酵母トリプトン(YT)を調製します。pHを7に調整し、オートクレーブする。
- 冷却したら、縞模様のしたばかりのLBプレートからOP50細菌コロニーを250 mL三角フラスコ内の50 mLの2x YT培地に接種します。37°C、250 rpmで約0.6の光学濃度(OD600)まで振とうします。
- 車両と実験プレートの準備
- 各35 mm NGM寒天プレートの中央に100 μLのOP50細菌を加えます。室温(室温、21°C)で一晩乾燥させます。
- DMSOで0.5 M VL-850を調製し、M9バッファー(22 mM KH 2 PO 4、42 mM Na2HPO 4、86 mMNaCl、pH 7、および1 mM MgSO 4)を使用して10 mM VL-850に希釈します26。pHが7.0であることを確認し(そうでない場合は、0.1 M HClで滴定します)、0.22 μmシリンジフィルターで溶液をろ過滅菌します。上記のようにビヒクルを準備しますが、薬物(この場合はVL-850)は使用しないでください。DMSOで50 mM FCCPを作製し、M9バッファーで1 mM FCCPに希釈し、0.22 μmシリンジフィルターで溶液をろ過滅菌します。
- 25 μLのビヒクル(陰性対照)、FCCP(陽性対照、5 μM)、またはVL-850(実験的処理:62.5 μM)を、細菌の芝生に別々に播種したNGMプレートに追加します。
- プレートをアルミホイルで覆い、室温(室温、21°C)で乾燥させます。~16時間後にプレートを使用してください。
- 同期した若年成人の C.エレガンス 雌雄同体の入手
- 22 mM KH 2 PO 4、42 mM Na2HPO4、および 86 mM NaCl を含む 1 L の M9 バッファーを作成します。オートクレーブ滅菌し、冷まします。冷却したら、1 mLの1 mM MgSO4(0.22 μmフィルター滅菌済み)を加えます。
- 2.5 mL水酸化ナトリウム0.8 mL、次亜塩素酸ナトリウム5%溶液1 mLを重水素減少水2.2 mLと混合して、4 mLアルカリ次亜塩素酸塩溶液(水酸化ナトリウムの最終濃度0.5 N、次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度1.25%)を作成します。
- NGMプレートを1 mLのM9バッファー3xで洗浄することにより、ワーム(妊娠雌雄同体)を15 mLの円錐形のチューブに収集し、すべての母親がチューブに収集されていることを確認します。
- 500 × g で1分間遠心分離してワームを沈降させ、1 mLの容量が残るまで上清を廃棄します。
- アルカリ性次亜塩素酸塩溶液1 mLを加え、チューブを5倍反転させて混合します。卵の放出を助けるためにチューブを3分間静かにボルテックスし、解剖ステレオスコープの下でワームの状態を観察します。
- ワームの約50%が壊れたら、5 mLのM9バッファーを追加し、500 × gで1分間遠心分離してすぐに卵を沈降させます。
- ペレットを乱さずに上清を慎重に取り除きます。5 mLのM9バッファーを加え、洗浄手順を2回繰り返します。
- 上清を2 mLが残るまで取り出し、チューブを20 rpmで2~16時間(RT、21°C)回転(360°回転)させ、同期L1幼虫を得た。このチューブから、スライドガラス上に5μLの滴を取り、ステレオスコープの下で幼虫の数を数え、このステップを3回繰り返し、3つのカウントの平均を取り、マイクロリットルあたりのワームの数(μL)を推定します。これらの計算に基づいて、OP50細菌を播種したNGMプレートあたり~200匹の幼虫を追加します。
- L1幼虫を21°Cで~48時間、若年成虫期まで育てる。
- 薬物治療と顕微鏡検査の手順
- 実験プレートまたはコントロールプレートのそれぞれに100匹のワームを置きます。ネガティブプレート、ポジティブプレート、および実験プレートに、それぞれビヒクル、5 μM FCCP、および62.5 μM VL-850が含まれていることを確認します。21°Cで6時間インキュベートします。
- 1 mLのM9バッファーを使用して、各プレートから1.7 mLのマイクロ遠心チューブにワームを洗浄します。チューブをミニ遠心分離機で短時間(~3秒)回転させます。次に、ワームペレットを乱すことなくM9バッファーを穏やかにピペッティングして上清を廃棄します。この洗浄ステップを2回繰り返し、ワームペレットを乱すことなく上清を静かに除去します。
- 0.1% v/v ポロクサマー 188、0.1% v/v プルロニック F127、および 2 μL の染色キット試薬を含む 200 μL の M9 バッファーをワーム ペレットに追加します。混合物を室温(室温、21°C)で1時間20rpm(360°回転)で回転させます。染料を光から保護するために、チューブをアルミホイルで覆います。
- 手順 1.3.4 で説明したように、ワームを静かに回転させます。次に、ワームペレットを乱すことなく染色液を除去します。次に、ステップ1.3.2で説明したようにワームを洗浄し、適切な処理を含む播種されたNGM-寒天プレートに移します-たとえば、FCCPで処理されたワームはFCCPを含むプレートに移されます。染色試薬は感光性であるため、プレートをアルミホイルで覆います。
注:過剰な色素によるバックグラウンドノイズを最小限に抑えるために、細菌と対応する処理剤を含む培養プレートにワームを移しました。たとえば、FCCPで処理されたワームは、FCCPで補充されたプレートに移されました。 - 1 mLのM9バッファーを使用して、プレートからワームを新鮮な微量遠心チューブに洗い流します。同じ方法でワームを2回洗います。次に、氷上で1%ホルムアルデヒドで30分間ワームを固定し、1 mLのM9バッファー3xでワームを洗浄して、残留ホルムアルデヒドを除去します。洗浄後、ワームをペレットまで回転させ、最大量の上清を吸引し、ワームペレットを10μLのM9にそのまま保ちます。
- 2.5%アガロースを調製するには、10 mLのホウケイ酸ガラス試験管に0.125 gのアガロースを計量し、5 mLのM9バッファーを加え、ブンゼンバーナーでチューブを穏やかに加熱してアガロースを溶解します。融解したアガロースを75°Cに設定したドライバスに移し、1 mLチップを使用して、融解したアガロース100 μLをDeckgläser顕微鏡カバーガラス(24 mm x 60 mm)に入れます。すぐに、別のスライドをアガロースドロップの上に垂直に置き、十字形を形成します。~2分待ってから、上部カバーガラスを(軽く)押してスライドをそっと分離し、アガロースパッドを下部カバースライドに残します。
注意: チューブ内のアガロースを加熱するときは注意し、チューブが体から離れていることを確認してください。1 mLチップの端をカットして、アガロースの凝固を最小限に抑えます。 - パスツールガラスピペットでワームをアガロースパッドに移します(つまり、チューブ内の全量、~10 μL)。実験室用ワイプで作られた芯で余分な液体を取り除き、次に小さなカバースライド(24 mm x 40 mm)でワームを覆います。蒸発を防ぐために、小さいカバースライドの周囲に透明なマニキュアを塗ります。スライドを暗い箱に入れて、光から保護します。
- 共焦点顕微鏡を使用して、60倍の倍率レンズを使用して、適切な波長(下記参照)で24時間以内にワームを画像化します。
- スライドを顕微鏡ステージに置きます。
- イメージングソフトウェアを開き、ソフトウェアの灰色の領域を右クリックします。オープン アクイジション |Ti2フルパッド |NDアクイジション |右クリック の結果として表示されるポップアップのオプションをクリックしてLUTします。
- [Ti2フルパッド]で、[60x]を選択します。
- [取得]で[接眼レンズDIA]を選択し、顕微鏡のファインフォーカスノブを使用してワームに焦点を合わせます。[取得] で [回転ディスク] を選択し、[16 ビット - ビニングなし] オプションを選択します。蛍光フィルターごとに、露光時間を500ミリ秒に設定し、明視野の場合は20ミリ秒に設定します。これらのパラメーターを設定したら、[今すぐ実行] を選択し、出力イメージが ND2 ファイルとして生成されるのを待ちます。
注:イメージング設定が異なれば特性も異なるため、露光時間は実験的に決定する必要があります。ルックアップテーブル(LUT)を使用して、各波長の蛍光強度を調べます。
- 画像解析
- 共焦点画像(ここではニコンND2ファイル)をImageJ27 でコ ローカリゼーションプラグインで開きます。各NDファイルには、3つの波長(DAPI、GFP / FITC [緑]、およびテキサスレッド[赤]フィルターを使用)と可視光で撮影された画像プレーンが含まれています。これらの画像にアクセスするには、ImageJ サーバーで ND ファイルを開き、ダイアログボックスで 「画像を分割」 を選択します。明視野(BF)、緑チャンネル、赤チャンネルの画像を操作します。
- これらの画像の複製を生成して、元の画像をそのままにするには、[ 画像] |複製 するか、キーボードショートカットのShift + Dを使用します。
- 背景を減らすには、上記のように画像の別の複製を生成します。ローリング半径が100の背景を減算し、[背景の作成(減算しない)] オプションを選択して、指定した画像の背景で画像を生成します。次に、プロセス|画像計算機、および2番目の複製された画像から最初の複製された画像を減算します。結果の画像を共局在解析に使用します。
- コローカリゼーションプラグインを使用するには、緑チャンネルと赤チャンネルの画像を8ビットに変換します。これを行うには、画像|タイプ |8 ビット。
- プラグインをクリック |コローカリゼーション。共局在プラグイン(上記参照)を使用してミトコンドリアおよびリソソームシグナルの 共局在 を測定するには、次のパラメータを使用します: 比率= 75%、しきい値赤チャネル= 80.0、しきい値緑チャネル= 50.0。出力は、共局在 puncta と、RGB 画像内の 3 つの 8 ビット イメージ (緑、赤、および共局在イメージ) の組み合わせを含む 8 ビット バイナリ イメージです。
- ワームの頭の体壁の筋肉の点状突起に焦点を当てるには、この領域を手動で選択し、[編集]をクリックしてマスクを作成します 。選考 |関心領域を選択するマスクを作成します(図2A、B)。他の染色されたエンティティ(咽頭筋など)を選択的に除去して、頭の体壁筋領域を分析します。
- 関心領域(ROI)内のパーティクルを選択するには、画像計算機を使用して 、共局在する 8 ビット と マスク 画像を選択します。次に、演算 AND (図3A)を使用して、ROIの点状を選択します。これにより、ROIに点点を含む画像が生成されます(図3B)。
- 共局在するミトコンドリアとリソソームの領域を分析するには、分析 |粒子を分析し、0.1625 μm 2から4 μm2の間の点状の合計を測定します。
2.Hep-3Bがん細胞プロトコル
- 薬剤原液の調製
- DMSOで100 mM VL-850を調製します。0.5 M HEPESバッファー、pH 7.3で5 mMに希釈し、0.22 μmシリンジフィルターを使用して溶液を滅菌します。次に、前述のように、薬物(この場合はVL-850)なしで車両を準備します。
- 実験、薬物処理、顕微鏡検査のためのHep-3B細胞の培養
- 10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2%L-グルタミン、および1%テトラサイクリン(以下、完全DMEM)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む10cm組織培養プレートでHep-3B細胞を増殖させます。細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
- 70%〜80%の細胞コンフルエンシー(対数増殖期)を示すHep-3B細胞のプレートを選択し、培地を取り出し、5 mLの予熱したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でプレートを洗浄します。PBSを除去し、予熱した0.25%トリプシン/0.02%EDTA1 mLで細胞を37°Cで~3分間インキュベートします。組織培養顕微鏡(10x)で細胞を観察します。細胞が丸くなったらトリプシン消化を停止し、5 mLの完全なDMEMを加えてプレートから解離を開始します。細胞を1,000 × g で5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を5 mLの完全DMEMに再懸濁します。
- 細胞濃度を決定します。50 μLの細胞懸濁液を50 μLのトリパンブルーと混合します。自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞を5倍カウントし、これらのカウントの平均を取得してカウントの精度を確認します。
- 42,000個のHep3G細胞を各8ウェルμスライドに400 μLの完全DMEM(上記参照)でシードします。細胞を37°Cおよび5%CO2で24時間インキュベートします。
- ~80%-85%コンフルエントで24時間後、各ウェルから250 μLの培地を取り出し、適切な処理またはビヒクルを含む50 μLの培地を追加します。このプロトコルに従うには、細胞を100 μM VL-850、5 μM FCCP、およびコントロールとしてのビヒクルで処理します。
- 化合物との6時間のインキュベーション後、染色試薬を含む各ウェルに50 μLの培地を追加します(各ウェルに250 μLの色素に対して0.5 μL)。細胞を色素とともに37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。
注:染色試薬は光に敏感であるため、サンプルをアルミホイルで覆い、薄暗い環境で作業することで、光への露出を最小限に抑えてください(可能な場合)。 - 200 μLのピペットを使用して、各ウェルからすべての培地(250 μL)を静かに取り出し、200 μLの予熱したPBSで細胞を洗浄します。
- 4%ホルムアルデヒドと2.5%グルタルアルデヒドを含む200 μLの固定溶液で細胞をPBS中でRTで15分間固定します。
- 固定液をデカントし、200 μLのPBSで短時間洗浄します。
- 200 μLのPBSを添加し、細胞を4°Cで覆い、光から保護し、24時間以内にイメージングします。
注:スピニングディスク共焦点顕微鏡は、ステップ1.4.8と同様に、DIC、TRITC、FITC、DAPIの4つのチャンネルで使用しました。1処理あたり~300個の細胞をイメージングしました。
- 画像解析
- 手順 1.5.1-1.5.5 を実行します。セルのROIを取得するには、セルの領域を強調表示する画像を生成します。このためには、共局在ポイント(RGB)画像を選択します(図4A)。セル領域全体を選択するには、[処理] |バイナリ |マスクを作成してバイナリイメージを取得します(図4B)。セルの領域を分析するには、[分析] |[パーティクルを解析]をクリックし、[パーティクルを解析](Analyze Particles)のデフォルト設定である 0 から無限遠までのイメージ内のすべてのパーティクルを測定します。
- 共局在化したミトコンドリアとリソソームの領域を分析するには、共局在化した8ビット画像を選択し、選択を選択してバイナリに変換します プロセス|バイナリ |[バイナリを作成] で [分析] を選択します。粒子を分析し、0.1625 μm2から4 μm2の間の点状の合計を測定します。共局在化プンクタを測定するには、共局在化したミトコンドリアとリソソームの面積を総細胞面積で割ります。
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Representative Results
VL-850による C.エレガンス 線虫とHep-3B細胞の両方における堅牢なマイトファジー応答の誘導
VL-850は、 C.エレガンス ワームとヒトケラチノサイト(HaCaT細胞)を酸化ストレスから保護します23。その作用機序をさらに調べるために、VL-850が C.エレガンス や他のヒト細胞でマイトファジーを誘導するかどうかを調べました。これをテストするために、C. エレガンス ワーム(若年成人、L1の3日後)を62.5 μM VL-850、5 μM FCCP(ポジティブコントロール)、およびビヒクル(ネガティブコントロール)に6時間曝露しました。以上のように、染色試薬を用いてマイトファジーを測定した。VL-850には62.5μMの濃度を使用することを選択しましたが、それはワームを酸化ストレスから保護し、ワームの寿命を大幅に延ばすためです23。VL-850は、線虫の頭部体壁筋に堅牢なマイトファジーを誘導し(図5)、強力なマイトファジー誘導因子であることを示しています。注目すべきことに、VL850のマイトファジー効力はFCCPのそれと同様でした(図5)。
さらに、Hep-3B細胞で同様の実験を行いました。この細胞株は、原発性肝細胞癌(HCC)28の8歳の黒人男性に由来します。 C. elegans 実験と同様に、細胞を100 μM VL-850、5 μM FCCP(ポジティブコントロール)、およびビヒクル(ネガティブコントロール)に6時間曝露し、染色試薬を使用してマイトファジーを定量しました。VL-850とFCCPは、Hep-3B細胞で有意なマイトファジーを(同程度に)誘導し(図6)、VL-850が C.エレガンス とヒト細胞の両方で強力なマイトファジー誘導因子であるという私たちの仮説をさらに支持しています。
図1:C.エレガンスおよびHep-3B細胞におけるマイトファジー測定。 C.エレガンス線虫および肝癌細胞の両方におけるマイトファジーを測定するための染色キットの使用を示す模式図。略語:VL-850 = O,O(オクタン-1,8-ジイル)ビス(ヒドロキシルアミン);FCCP = カルボニルシアニド 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;NGM = 線虫増殖培地。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: C. elegansの頭部体壁筋の関心領域の選択。 (A)関心領域を手動で選択し、マスクを生成します。(B)結果のマスク画像には、主な関心領域が表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: C. elegansの関心領域における共局在点の定量化。 (A)関心領域の点状を選択するには、操作「AND」を選択する必要があります。(B)結果の画像は、関心領域に点状を表示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 関心領域内のセルの選択 。 (A)共局在化関数の後に共局在点(RGB)画像を生成する。(B)点状が研究される細胞領域全体を表すマスク画像。略語:RGB =赤、緑、青。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:VL-850による C.エレガンス における堅牢なマイトファジーの誘導。 (A)矢印は、代表的な共局在化の例として、ミトコンドリアとリソソームの共局在を示しています。8倍に拡大された挿入図は、より良い視覚化のために提供されています。スケールバー = 100 μm。 (B)共局在は、処理ごとに3つの生物学的反復および30の線虫で定量化された。結果の有意性は、それらを車両コントロールと比較することによって決定され、アスタリスクは統計的有意性を示します。統計分析は、対応のない一元配置分散分析(ウェルチ補正を使用したブラウンフォーサイスおよびウェルチANOVA検定)を使用して実行され、0.0001未満の p値(****p < 0.0001)が統計的に有意であると見なされました。略称:FCCP =カルボニルシアニド4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:VL-850はHep-3B細胞において有意なマイトファジーを誘導 する。 (A)矢印は、共局在を表すミトコンドリアとリソソームの共局在を示し、8倍に拡大した共局在を示すために挿入図が含まれています。スケールバー = 25 μm。 (B)共局在を、処理あたり3つの生物学的反復およびN ≥ 411細胞で定量した(411は、統計的有意性および結果の信頼性を可能にする範囲内にある)。車両コントロールと比較して統計的に有意な差が評価され、アスタリスクは有意性を示しています。データは、対応のない一元配置分散分析(ウェルチ補正を使用したブラウンフォーサイスおよびウェルチ分散分析)を使用して分析され、 p値が0.0001未満(****p < 0.0001)が統計的に有意であると見なされました。略称:FCCP =カルボニルシアニド4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
複数のマイトファジー経路には、さまざまなタンパク質や生体分子(カルジオリピン29など)が含まれます。しかし、これらの経路のエンドポイントは類似しており、リソソーム酵素によるミトコンドリアの分解である12,13。実際、いくつかの方法でこのエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化しています。ただし、電子顕微鏡などの一部の方法では、高価な機器、訓練を受けた専門家へのアクセス、および試料と分析の準備時間の延長が必要です。さらに、特定の組織/細胞/細胞内コンパートメントにおけるマイトファジーを測定することを含むマイトファジーバイオセンサを使用することの利点にもかかわらず、そのようなセンサの発現は、細胞21の生理機能を変化させることができる。したがって、正常な細胞生理学との長期的な干渉を必要とせずにマイトファジーを定量するための、信頼性が高く、費用効果が高く、迅速な方法が必要です。
ここでは、ミトコンドリア/リソソーム/核色素カクテルの手頃な価格の市販混合物の使用を含むそのような方法について説明します。私たちは最近、 C.エレガンス と不死化ヒトケラチノサイト(HaCaT細胞)のマイトファジーの測定におけるその有用性を実証しました23。染色キットの結果は、mito-Rosella( C. elegans)とcox8-mCherry-EGFP(ヒトSH-SY5Y神経芽腫細胞)を含む2つのバイオセンサーと、ミトコンドリアと核のDNA含有量といくつかのマイトファジー/オートファジー遺伝子の発現の比率を定量化したqPCR実験で検証されました23。
本研究では、 C.エレガンス 線虫およびヒト肝腺癌Hep-3B細胞におけるVL-850のマイトファジー活性化能を探索するために研究を拡大しました。結果は、VL-850が強力なマイトファジー誘導物質であることを示しています(図5 および 図6)。これらの結果は、VL-850が C.エレガンス を酸化ストレスから保護し、その寿命を延ばし、HaCat細胞でマイトファジーを誘導するという以前の観察をさらに裏付けています23。
染色キットの有用性にもかかわらず、 C.エレガンス 研究に関していくつかの制限があります。第一に、少なくとも研究した条件下では、樹状突起および軸索の染色は観察されなかった。したがって、現在のプロトコルは、これらのニューロン実体におけるマイトファジーを測定するのには有用ではない。第二に、腸の自家蛍光は、ミトコンドリア色素の緑色蛍光シグナルを妨害する可能性があります。したがって、この方法を腸内のマイトファジー測定に適用する場合は注意が必要です。最後に、特にヒト/げっ歯類細胞株の状況において、リソソーム色素は核内の酸性実体を染色する可能性があります。したがって、すべての細胞株/培地組成の染色試薬濃度/インキュベーション時間を経験的に滴定することをお勧めします。
さらに、上で示唆したように、マイトファジーを実証するのに十分な単一の方法はありません。したがって、別の方法(マイトファジーバイオセンサー、qPCR、免疫染色など)を使用して染色試薬の結果を検証し、常にポジティブマイトファジーコントロール(FCCPなど)を含めることをお勧めします。結論として、染色試薬色素カクテルは、 C.エレガンス およびヒト細胞のマイトファジーを定量するための信頼性が高く費用効果の高い方法を提供します。ヒト細胞と C.elegans 細胞の間には大きな違いがあることから、この方法は他の動物系にも容易に適応できると期待しています。
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Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
原稿を批判的に読んでくださったグロス研究所のメンバーと、彼らのコメントとアドバイスに感謝します。我々は、国立衛生研究所研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けているカエノラブディティス遺伝学センター(CGC)に、いくつかの菌株を提供してくれたことに感謝する。この研究は、Vitalunga Ltdとイスラエル科学財団からの助成金(助成金番号989/19)によって支援されました。グラフィカルな抽象図(図1)は、BioRender.com で生成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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