איתור מיטופגיה בתאי Caenorhabditis elegans ובתאי יונקים באמצעות צבעים ספציפיים לאברונים
Summary
חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.
Abstract
מיטוכונדריה חיוניים לתפקודים ביולוגיים שונים, כולל ייצור אנרגיה, מטבוליזם של שומנים, הומאוסטזיס סידן, ביוסינתזה של הם, מוות תאי מווסת ויצירת מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS חיוניים לתהליכים ביולוגיים מרכזיים. עם זאת, כאשר הם אינם מבוקרים, הם עלולים להוביל לפגיעה חמצונית, כולל נזק למיטוכונדריה. מיטוכונדריה פגועים משחררים יותר ROS, ובכך מגבירים את הפגיעה התאית ואת מצב המחלה. תהליך הומיאוסטטי בשם אוטופגיה מיטוכונדריאלית (מיטופגיה) מסיר באופן סלקטיבי מיטוכונדריה פגומים, אשר מוחלפים בחדשים. ישנם מסלולי מיטופגיה מרובים, כאשר נקודת הקצה הנפוצה היא פירוק המיטוכונדריה הפגועה בליזוזומים.
מספר מתודולוגיות, כולל חיישנים גנטיים, אימונופלואורסנציה של נוגדנים ומיקרוסקופ אלקטרונים, משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. לכל שיטה לבדיקת מיטופגיה יתרונות משלה, כגון מיקוד רקמות/תאים ספציפיים (עם חיישנים גנטיים) ופירוט רב (במיקרוסקופ אלקטרונים). עם זאת, שיטות אלה דורשות לעתים קרובות משאבים יקרים, כוח אדם מיומן, וזמן הכנה ארוך לפני הניסוי עצמו, כגון ליצירת בעלי חיים טרנסגניים. כאן, אנו מציגים חלופה חסכונית למדידת מיטופגיה באמצעות צבעים פלואורסצנטיים הזמינים מסחרית המכוונים למיטוכונדריה וליזוזומים. שיטה זו מודדת ביעילות מיטופגיה בנמטודה Caenorhabditis elegans ובתאי כבד אנושיים, מה שמצביע על יעילותה הפוטנציאלית במערכות מודל אחרות.
Introduction
מיטוכונדריה חיוניים לכל בעלי החיים האירוביים, כולל בני אדם. הם ממירים את האנרגיה הכימית של ביומולקולות לאדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני1, מסנתזים הם2, מפרקים חומצות שומן באמצעות חמצון β3, מווסתים הומאוסטזיס סידן4 וברזל5, שולטים במוות תאי על ידי אפופטוזיס6, ומייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS), הממלאים תפקיד חיוני בהומאוסטזיס חיזור7. שני תהליכים משלימים ומנוגדים שומרים על שלמות ותפקוד תקין של המיטוכונדריה: סינתזה של רכיבים מיטוכונדריאליים חדשים (ביוגנזה) והסרה סלקטיבית של רכיבים פגומים באמצעות אוטופגיה מיטוכונדריאלית (כלומר, מיטופגיה)8.
מספר מסלולי מיטופגיה מתווכים על ידי אנזימים, כגון PINK1/Parkin, וקולטנים, כולל FUNDC1, FKBP8 ו-BNIP/NIX 9,10. יש לציין כי פירוק סלקטיבי של רכיבים מיטוכונדריאליים יכול להתרחש ללא תלות במנגנון האוטופגוזום (כלומר, באמצעות שלפוחיות שמקורן במיטוכונדריה)11. עם זאת, נקודות הקצה של מסלולי המיטופגיה הסלקטיביים השונים דומות (כלומר, פירוק מיטוכונדריאלי על ידי אנזימים ליזוזומליים)12,13. מסיבה זו, שיטות שונות לזיהוי ומדידה של מיטופגיה מסתמכות על קולוקליזציה של סמנים מיטוכונדריאליים וליזוזומליים 14,15,16,17 וירידה ברמות החלבונים המיטוכונדריאליים/DNA מיטוכונדריאלי 18.
להלן תיאור תמציתי של מתודולוגיות הניסוי הקיימות למדידת מיטופגיה בתאי בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תוך שימת דגש על שלב נקודת הקצה של המיטופגיה.
חיישנים ביולוגיים של מיטופגיה
התפרקות מיטוכונדריאלית מתרחשת בסביבה החומצית של הליזוזום19. לכן, רכיבים מיטוכונדריאליים, כולל חלבונים, חווים מעבר מ- pH נייטרלי ל- pH חומצי בנקודת הקצה של תהליך המיטופגיה. דפוס זה עומד בבסיס מנגנון הפעולה של מספר חיישנים ביולוגיים מיטופגיים, כולל מיטו-רוזלה18 וטנדם mCherry-GFP-FIS114. חיישנים אלה מכילים חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל- pH (GFP) וחלבון פלואורסצנטי אדום שאינו רגיש ל- pH (RFP). לכן, בנקודת הקצה של המיטופגיה, יחס הפלואורסצנטיות הירוק לאדום יורד באופן משמעותי עקב המרווה של פלואורופור GFP. המגבלות העיקריות של חיישנים אלה הן: (1) העברת אנרגיית תהודה אפשרית של Förster (FRET) בין הפלואורופורים; (2) קצב ההבשלה הדיפרנציאלי של GFP ו-RFP; (3) דיסוציאציה בין GFP לבין RFP עקב שסע פרוטאוליטי של הפוליפפטיד המחבר ביניהם; (4) חפיפה פלואורסצנטית-פליטה; (5) בהירות פלואורופור דיפרנציאלית ומרווה15,16.
חיישן שמתגבר על חלק מהמגבלות הללו הוא חיישן המיטוכונדריהKeima 17. חיישן mt-Keima (הנגזר מחלבון האלמוגים Keima) מציג שיא פליטה יחיד (620 ננומטר). עם זאת, שיאי העירור שלו רגישים ל- pH. כתוצאה מכך, יש מעבר מעיור ירוק (440 ננומטר) לעירור אדום (586 ננומטר) בעת מעבר מ- pH גבוה ל- pH חומצי16,17. חיישן מיטופגי עדכני יותר, Mito-SRAI, קידם את התחום בכך שהוא מאפשר מדידות בדגימות ביולוגיות קבועות20. עם זאת, למרות היתרונות הרבים של חיישנים גנטיים, כגון היכולת לבטא אותם ברקמות/תאים ספציפיים ולמקד אותם למדורים מיטוכונדריאליים נפרדים, יש להם גם מגבלות. מגבלה אחת היא שהחיישנים הגנטיים צריכים לבוא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, מה שיכול לגזול זמן רב ומשאבים רבים.
בנוסף, ביטוי החיישנים בתוך המיטוכונדריה עצמם עשוי להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה. לדוגמה, ביטוי GFP מיטוכונדריאלי (mtGFP) בשרירי דופן הגוף של תולעת C. elegans מרחיב את הרשת המיטוכונדריאלית21. פנוטיפ זה תלוי בתפקודו של גורם השעתוק ATFS-1 המופעל על ידי מתח, אשר ממלא תפקיד חיוני בהפעלת תגובת חלבון מקופלת במיטוכונדריה (UPRmt)21. לכן, למרות שחיישנים ביולוגיים של מיטוכונדריה/מיטופגיה המקודדים גנטית שימושיים ביותר לניטור הומאוסטזיס מיטוכונדריה in vivo, הם עשויים להשפיע על התהליך שהם נועדו למדוד.
נוגדנים וצבעים ספציפיים למיטוכונדריה/ליזוזום
אסטרטגיה נוספת לבדיקת לוקליזציה מיטוכונדריאלית/ליזוזומית היא שימוש בנוגדנים נגד חלבונים מיטוכונדריאליים/ליזוזומליים, כגון חלבון הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה TOM20 וחלבון קרום ליזוזומלי 1 (LAMP1)22. ברוב המקרים, נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופור משמשים לזיהוי אות הפלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופיה. אסטרטגיה נוספת היא לשלב מבנים גנטיים עם צבעים מיטוכונדריאליים/ליזוזומליים, כגון ביטוי מבנה היתוך LAMP1::GFP בתאים תוך צביעתם בצבע מיטוכונדריאלי אדום (למשל, Mitotracker Red)16. מתודולוגיות אלה, למרות יעילותן, דורשות נוגדנים ספציפיים ולעתים קרובות כוללות עבודה עם דגימות קבועות או יצירת תאים/בעלי חיים טרנסגניים המבטאים מיטוכונדריה/ליזוזומים המסומנים באופן פלואורסצנטי.
במאמר זה אנו מתארים את השימוש בערכת צביעה מסחרית של ליזוזומים/מיטוכונדריה/גרעינים להערכת התכונות מפעילות המיטופגיה של דיאמין סינתטי O,O (אוקטן-1,8-דיל)ביס (הידרוקסילאמין), המכונה להלן VL-85023, בתולעי C. elegans ובקו תאי הסרטן האנושי Hep-3B (איור 1). ערכת הצביעה מכילה תערובת של צבעים ליזוזומליים/מיטוכונדריאליים/גרעיניים המכתימים באופן ספציפי אברונים אלה23. בעבר השתמשנו בערכה זו כדי להדגים את פעילות המיטופגיה של 1,8 דיאמינואוקטן (להלן VL-004) ב-C. elegans23. חשוב לציין, תיקפנו את תוצאות ערכת הצביעה עם מדידות המיטו-רוזלה biosensor ו-qPCR של תכולת ה-DNA המיטוכונדריאלי:גרעיני23. ערכת צביעה זו מציעה את היתרונות הבאים. ראשית, אין צורך לייצר בעלי חיים או תאים טרנסגניים המבטאים ביוסנסור מיטוכונדריאלי. לכן, אנו יכולים לחקור חיות או תאים מסוג בר שלא שונו, ובכך לחסוך הרבה זמן, כסף ועבודה. יתר על כן, כאמור, ביטוי ביו-חיישנים מיטוכונדריאליים יכול לשנות את תפקוד המיטוכונדריה. שנית, הערכה חסכונית, קלה לשימוש ומהירה. שלישית, למרות שאנו מדגימים את השיטה ב-C. elegans ובתאים אנושיים, ניתן לשנות אותה עבור סוגי תאים ואורגניזמים אחרים.
עם זאת, כמו כל שיטה, לפרוטוקול ערכת הצביעה יש חסרונות. לדוגמה, הדגירה של התולעים עם מגיב מתבצעת בהיעדר מזון (ראינו כי אפילו חיידקים מתים להפחית באופן משמעותי את יעילות הצביעה). למרות שזמן הדגירה קצר יחסית, ייתכן שגם בטווח זמן זה ייתכנו שינויים בתגובות ההומיאוסטטיות, כולל מיטופגיה. בנוסף, קשירת הצבעים לחלבון ER/מיטוכונדריה/גרעין וביומולקולות אחרות עשויה להשפיע על פעילותם של אברונים אלה. יתר על כן, בניגוד למדידת מיטופגיה באמצעות חיישנים גנטיים, אנו עובדים עם תולעים ותאים שעברו קיבוע כימי. לכן, אי אפשר להמשיך לעקוב אחר אותן תולעים/תאים בזמנים שונים. לפיכך, אנו ממליצים לשלב מתודולוגיות שונות כדי לאמת את תפקוד המיטופגיה בתהליך פיזיולוגי מסוים. להלן, אנו מציגים נתונים חדשים המוכיחים כי VL-850 גורם למיטופגיה חזקה בתולעי C. elegans ובתאי Hep-3B. לכן, נתונים אלה תומכים עוד יותר בהשערה כי VL-850 מאריך את תוחלת החיים של C. elegans ומגן על C. elegans מפני נזק חמצוני באמצעות השראת מיטופגיה בריאה. השתמשנו בפרוטון יונופור קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), שהוא גורם מיטופגיה חזק24, כבקרה חיובית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מסלולי מיטופגיה מרובים מערבים חלבונים וביומולקולות שונות (למשל, קרדיוליפין29). עם זאת, נקודת הקצה של מסלולים אלה דומה – פירוק מיטוכונדריה על ידי אנזימים ליזוזומליים12,13. ואכן, מספר שיטות משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. עם זאת, שיטות מסוימ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת גרוס על הקריאה הביקורתית של כתב היד ועל הערותיהם ועצותיהם. אנו מודים למרכז Caenorhabditis Genetics Center (CGC), הממומן על ידי משרד הבריאות הלאומי לתוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440), על אספקת חלק מהזנים. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחברת ויטלונגה בע”מ והקרן הלאומית למדע (מענק מס’ 989/19). האיור המופשט הגרפי (איור 1) נוצר עם BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
