Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen
Summary
Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.
Abstract
Mitochondriën zijn essentieel voor verschillende biologische functies, waaronder energieproductie, lipidenmetabolisme, calciumhomeostase, heembiosynthese, gereguleerde celdood en de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS). ROS zijn van vitaal belang voor belangrijke biologische processen. Wanneer ze echter niet onder controle zijn, kunnen ze leiden tot oxidatieve schade, waaronder mitochondriale schade. Beschadigde mitochondriën geven meer ROS af, waardoor cellulair letsel en de ziektetoestand worden geïntensiveerd. Een homeostatisch proces genaamd mitochondriale autofagie (mitofagie) verwijdert selectief beschadigde mitochondriën, die vervolgens worden vervangen door nieuwe. Er zijn meerdere mitofagieroutes, met als gemeenschappelijk eindpunt de afbraak van de beschadigde mitochondriën in lysosomen.
Verschillende methodologieën, waaronder genetische sensoren, antilichaamimmunofluorescentie en elektronenmicroscopie, gebruiken dit eindpunt om mitofagie te kwantificeren. Elke methode voor het onderzoeken van mitofagie heeft zijn voordelen, zoals specifieke weefsel/cel targeting (met genetische sensoren) en detail (met elektronenmicroscopie). Deze methoden vereisen echter vaak dure middelen, getraind personeel en een lange voorbereidingstijd voor het eigenlijke experiment, zoals voor het maken van transgene dieren. Hier presenteren we een kosteneffectief alternatief voor het meten van mitofagie met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstoffen gericht op mitochondriën en lysosomen. Deze methode meet effectief mitofagie in de nematode Caenorhabditis elegans en menselijke levercellen, wat de potentiële efficiëntie in andere modelsystemen aangeeft.
Introduction
Mitochondriën zijn essentieel voor alle aerobe dieren, inclusief mensen. Ze zetten de chemische energie van biomoleculen om in adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering1, synthetiseren heem2, breken vetzuren af door β oxidatie3, reguleren calcium4 en ijzer5 homeostase, controleren celdood door apoptose6 en genereren reactieve zuurstofsoorten (ROS), die een vitale rol spelen bij redoxhomeostase7. Twee complementaire en tegengestelde processen handhaven de integriteit en de juiste functie van de mitochondriën: de synthese van nieuwe mitochondriale componenten (biogenese) en de selectieve verwijdering van beschadigde componenten door mitochondriale autofagie (d.w.z. mitofagie)8.
Verschillende mitofagieroutes worden gemedieerd door enzymen, zoals PINK1 / Parkin, en receptoren, waaronder FUNDC1, FKBP8 en BNIP/ NIX 9,10. Met name de selectieve afbraak van mitochondriale componenten kan onafhankelijk van de autofagosoommachinerie plaatsvinden (d.w.z. door mitochondriale blaasjes)11. De eindpunten van de verschillende selectieve mitofagieroutes zijn echter vergelijkbaar (d.w.z. mitochondriale afbraak door lysosomale enzymen)12,13. Om deze reden zijn verschillende methoden voor het identificeren en meten van mitofagie afhankelijk van de colokalisatie van mitochondriale en lysosomale markers 14,15,16,17 en verlaagde niveaus van mitochondriale eiwitten / mitochondriaal DNA 18.
Hieronder volgt een beknopte beschrijving van de bestaande experimentele methoden voor het meten van mitofagie in dierlijke cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie, met de nadruk op de mitofagie eindpuntfase.
Mitofagie biosensoren
Mitochondriale afbraak vindt plaats in de zure omgeving van het lysosoom19. Daarom ervaren mitochondriale componenten, waaronder eiwitten, een verschuiving van een neutrale naar een zure pH op het eindpunt van het mitofagieproces. Dit patroon ondersteunt het werkingsmechanisme van verschillende mitofagie biosensoren, waaronder mito-Rosella18 en tandem mCherry-GFP-FIS114. Deze sensoren bevatten een pH-gevoelig groen fluorescentie-eiwit (GFP) en een pH-ongevoelig rood fluorescentie-eiwit (RFP). Daarom daalt op het eindpunt van mitofagie de groen-rode fluorescentieverhouding aanzienlijk als gevolg van het blussen van de GFP-fluorofoor. De belangrijkste beperkingen van deze sensoren zijn (1) mogelijke Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen de fluoroforen; (2) de differentiële rijpingssnelheid van GFP en RFP; (3) dissociatie tussen de GFP en RFP als gevolg van proteolytische splitsing van het polypeptide dat hen verbindt; (4) overlapping tussen fluorescentie en emissie; en (5) differentiële fluorofoorhelderheid en blussing15,16.
Een sensor die een aantal van deze beperkingen overwint is de Keima mitochondriale sensor17. De mt-Keima-sensor (afgeleid van het koraaleiwit Keima) geeft een enkele emissiepiek (620 nm) weer. De excitatiepieken zijn echter pH-gevoelig. Als gevolg hiervan is er een overgang van een groene excitatie (440 nm) naar een rode (586 nm) bij het verschuiven van een hoge pH naar een zure pH16,17. Een recentere mitofagiesensor, Mito-SRAI, heeft het veld vooruit geholpen door metingen in vaste biologische monsters mogelijk te maken20. Ondanks de vele voordelen van genetische sensoren, zoals het vermogen om ze tot expressie te brengen in specifieke weefsels / cellen en ze te richten op verschillende mitochondriale compartimenten, hebben ze echter ook beperkingen. Een beperking is dat de genetische sensoren tot expressie moeten komen in cellen of dieren, wat tijdrovend en arbeidsintensief kan zijn.
Bovendien kan de expressie van de sensoren in mitochondriën zelf de mitochondriale functie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, het tot expressie brengen van mitochondriale GFP (mtGFP) in de C. elegans worm lichaamswandspieren breidt het mitochondriale netwerk uit21. Dit fenotype is afhankelijk van de functie van de stress-geactiveerde transcriptiefactor ATFS-1, die een essentiële rol speelt bij de activering van ongevouwen eiwitrespons in mitochondriën (UPRmt)21. Daarom, hoewel genetisch gecodeerde mitochondriën / mitofagie biosensoren uiterst nuttig zijn voor het monitoren van mitochondriale homeostase in vivo, kunnen ze het proces beïnvloeden waarvoor ze zijn ontworpen om te meten.
Mitochondriën/lysosoom-specifieke antilichamen en kleurstoffen
Een andere strategie voor het testen van mitochondriale / lysosoom colocalisatie is het gebruik van antilichamen tegen mitochondriale / lysosomale eiwitten, zoals het mitochondriale buitenmembraaneiwit TOM20 en lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (LAMP1) 22. In de meeste gevallen worden secundaire antilichamen die geconjugeerd zijn aan een fluorofoor gebruikt om het fluorescentiesignaal via microscopie te detecteren. Een andere strategie is om genetische constructen te combineren met mitochondriale/lysosomale kleurstoffen, zoals het tot expressie brengen van een LAMP1::GFP-fusieconstruct in cellen terwijl ze worden gekleurd met een rode mitochondriale kleurstof (bijv. Mitotracker Red)16. Deze methodologieën, hoewel effectief, vereisen specifieke antilichamen en omvatten vaak het werken met vaste monsters of het genereren van cellen / transgene dieren die fluorescerend gelabelde mitochondriën / lysosomen tot expressie brengen.
Hier schetsen we het gebruik van een commerciële lysosoom / mitochondriën / nucleaire kleuringskit voor het beoordelen van de mitofagie-activerende eigenschappen van synthetische diamine O, O (octaan-1,8-diyl) bis (hydroxylamine), hierna VL-85023 genoemd, in C. elegans-wormen en de menselijke kankercellijn Hep-3B (figuur 1). De kleuringskit bevat een mengsel van lysosomale / mitochondriale / nucleair gerichte kleurstoffen die specifiek deze organellen kleuren23. We hebben deze kit eerder gebruikt om de mitofagie-activiteit van 1,8 diaminooctaan (hierna VL-004 genoemd) in C. elegans23 aan te tonen. Belangrijk is dat we de resultaten van de kleuringskit hebben gevalideerd met de mito-Rosella biosensor en qPCR-metingen van het mitochondriale: nucleaire DNA-gehalte23. Deze beitskit biedt de volgende voordelen. Ten eerste is het niet nodig om transgene dieren of cellen te genereren die een mitochondriale biosensor tot expressie brengen. Daarom kunnen we ongewijzigde wilde dieren of cellen bestuderen en zo veel tijd, geld en arbeid besparen. Bovendien, zoals vermeld, kan het tot expressie brengen van mitochondriale biosensoren de mitochondriale functie veranderen. Ten tweede is de kit kosteneffectief, gemakkelijk te gebruiken en snel. Ten derde, hoewel we de methode demonstreren in C. elegans en menselijke cellen, kan deze worden aangepast voor andere celtypen en organismen.
Dat gezegd hebbende, zoals elke methode, heeft het protocol van de kleuringskit nadelen. De incubatie van de wormen met het reagens wordt bijvoorbeeld uitgevoerd in afwezigheid van voedsel (we hebben gezien dat zelfs dode bacteriën de kleuringsefficiëntie aanzienlijk verminderen). Hoewel de incubatietijd relatief kort is, is het mogelijk dat zelfs in dit tijdsbestek homeostatische reacties kunnen worden veranderd, waaronder mitofagie. Bovendien kan de binding van de kleurstoffen aan de ER/mitochondriale/nucleaire eiwitten en andere biomoleculen de activiteiten van deze organellen beïnvloeden. Bovendien werken we, in tegenstelling tot mitofagiemeting met genetische sensoren, met wormen en cellen die chemische fixatie hebben ondergaan. Daarom is het onmogelijk om dezelfde wormen/cellen op verschillende tijdstippen te blijven monitoren. Daarom raden we aan om verschillende methodologieën te combineren om de functie van mitofagie in een bepaald fysiologisch proces te valideren. Hieronder presenteren we nieuwe gegevens die aantonen dat VL-850 robuuste mitofagie induceert in C. elegans-wormen en Hep-3B-cellen. Daarom ondersteunen deze gegevens verder de hypothese dat VL-850 de levensduur van C. elegans verlengt en C. elegans beschermt tegen oxidatieve schade door de inductie van gezonde mitofagie . We hebben het proton ionofoorcarbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazone (FCCP), een krachtige mitofagie inductor24, gebruikt als een positieve controle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meerdere mitofagieroutes omvatten verschillende eiwitten en biomoleculen (bijv. Cardiolipine29). Het eindpunt van deze routes is echter vergelijkbaar – de afbraak van mitochondriën door lysosomale enzymen12,13. Inderdaad, verschillende methoden gebruiken dit eindpunt om mitofagie te kwantificeren. Sommige methoden, zoals elektronenmicroscopie, vereisen echter toegang tot dure apparatuur, getrainde experts en een langere voorbereidingstijd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Gross-laboratorium voor het kritisch lezen van het manuscript en hun commentaar en advies. We danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door het National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), voor het leveren van enkele van de stammen. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van Vitalunga Ltd en de Israel Science Foundation (subsidie nr. 989/19). De grafische abstracte figuur (figuur 1) werd gegenereerd met BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
