Обнаружение митофагии в клетках Caenorhabditis elegans и млекопитающих с использованием органеллоспецифических красителей
Summary
Изучение митофагии с помощью электронной микроскопии, генетических датчиков и иммунофлуоресценции требует дорогостоящего оборудования, квалифицированного персонала и значительных затрат времени. Здесь мы демонстрируем эффективность коммерческого набора флуоресцентных красителей в количественной оценке процесса митофагии как у Caenorhabditis elegans, так и у клеточной линии рака печени.
Abstract
Митохондрии необходимы для различных биологических функций, включая производство энергии, липидный обмен, гомеостаз кальция, биосинтез гема, регулируемую гибель клеток и образование активных форм кислорода (АФК). АФК жизненно важны для ключевых биологических процессов. Однако при отсутствии контроля они могут привести к окислительному повреждению, включая повреждение митохондрий. Поврежденные митохондрии высвобождают больше АФК, тем самым усиливая повреждение клеток и болезненное состояние. Гомеостатический процесс, называемый митохондриальной аутофагией (митофагией), избирательно удаляет поврежденные митохондрии, которые затем заменяются новыми. Существует несколько путей митофагии, общей конечной точкой которых является разрушение поврежденных митохондрий в лизосомах.
Несколько методологий, включая генетические датчики, иммунофлуоресценцию антител и электронную микроскопию, используют эту конечную точку для количественной оценки митофагии. Каждый метод исследования митофагии имеет свои преимущества, такие как специфическое нацеливание на ткани / клетки (с помощью генетических датчиков) и большая детализация (с помощью электронной микроскопии). Однако эти методы часто требуют дорогостоящих ресурсов, обученного персонала и длительного времени подготовки перед фактическим экспериментом, например, для создания трансгенных животных. Здесь мы представляем экономически эффективную альтернативу для измерения митофагии с использованием коммерчески доступных флуоресцентных красителей, нацеленных на митохондрии и лизосомы. Этот метод эффективно измеряет митофагию у нематоды Caenorhabditis elegans и клеток печени человека, что указывает на его потенциальную эффективность в других модельных системах.
Introduction
Митохондрии необходимы для всех аэробных животных, включая человека. Они преобразуют химическую энергию биомолекул в аденозинтрифосфат (АТФ) посредством окислительного фосфорилирования1, синтезируют гем2, разлагают жирные кислоты β окисления3, регулируют гомеостаз кальция4 и железа5 , контролируют гибель клеток путем апоптоза6 и генерируют активные формы кислорода (АФК), которые играют жизненно важную роль в окислительно-восстановительном гомеостазе7. Два взаимодополняющих и противоположных процесса поддерживают целостность и правильное функционирование митохондрий: синтез новых митохондриальных компонентов (биогенез) и селективное удаление поврежденных посредством митохондриальной аутофагии (т.е. митофагии)8.
Несколько путей митофагии опосредованы ферментами, такими как PINK1 / Parkin, и рецепторами, включая FUNDC1, FKBP8 и BNIP / NIX 9,10. Примечательно, что селективная деградация митохондриальных компонентов может происходить независимо от аутофагосомного механизма (т.е. через везикулы митохондриального происхождения)11. Однако конечные точки различных селективных путей митофагии схожи (т.е. митохондриальная деградация лизосомальными ферментами)12,13. По этой причине различные методы идентификации и измерения митофагии основаны на колокализации митохондриальных и лизосомальных маркеров 14,15,16,17 и снижении уровней митохондриальных белков/митохондриальной ДНК 18.
Ниже приведено краткое описание существующих экспериментальных методологий измерения митофагии в клетках животных с использованием флуоресцентной микроскопии, подчеркивая конечную фазу митофагии.
Биосенсоры митофагии
Митохондриальная деградация происходит в кислой среде лизосомы19. Таким образом, митохондриальные компоненты, включая белки, испытывают сдвиг от нейтрального к кислому рН в конечной точке процесса митофагии. Эта закономерность лежит в основе механизма действия нескольких биосенсоров митофагии, включая мито-розеллу18 и тандем mCherry-GFP-FIS114. Эти датчики содержат pH-чувствительный зеленый флуоресцентный белок (GFP) и pH-нечувствительный красный флуоресцентный белок (RFP). Поэтому в конечной точке митофагии отношение флуоресценции зеленого к красному значительно падает из-за гашения флуорофора GFP. Основными ограничениями этих датчиков являются: (1) возможный резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между флуорофорами; (2) дифференциальная скорость созревания GFP и RFP; (3) диссоциация между GFP и RFP из-за протеолитического расщепления полипептида, который их соединяет; (4) флуоресцентно-эмиссионное перекрытие; и (5) дифференциальная яркость флуорофора и гашение15,16.
Датчиком, который преодолевает некоторые из этих ограничений, является митохондриальный датчикKeima 17. Датчик mt-Keima (полученный из кораллового белка Keima) отображает один пик излучения (620 нм). Однако его пики возбуждения чувствительны к pH. В результате происходит переход от зеленого возбуждения (440 нм) к красному (586 нм) при переходе от высокого рН к кислому рН16,17. Более поздний датчик митофагии, Mito-SRAI, продвинулся вперед в этой области, позволив проводить измерения в фиксированных биологических образцах20. Однако, несмотря на многие преимущества генетических датчиков, такие как способность экспрессировать их в определенных тканях / клетках и нацеливать их на отдельные митохондриальные компартменты, они также имеют ограничения. Одним из ограничений является то, что генетические датчики должны экспрессироваться в клетках или животных, что может занять много времени и ресурсов.
Кроме того, экспрессия датчиков в самих митохондриях может влиять на функцию митохондрий. Например, экспрессия митохондриального GFP (mtGFP) в мышцах стенки тела червя C. elegans расширяет митохондриальную сеть21. Этот фенотип зависит от функции стресс-активируемого транскрипционного фактора ATFS-1, который играет существенную роль в активации развернутого белкового ответа в митохондриях (UPRmt)21. Поэтому, хотя генетически кодируемые биосенсоры митохондрий/митофагии чрезвычайно полезны для мониторинга гомеостаза митохондрий in vivo, они могут влиять на сам процесс, для измерения которого они предназначены.
Митохондрии/лизосомоспецифические антитела и красители
Другой стратегией тестирования колокализации митохондрий/лизосом является использование антител против митохондриальных/лизосомальных белков, таких как белок внешней мембраны митохондрий TOM20 и лизосомальный мембранный белок 1 (LAMP1)22. В большинстве случаев вторичные антитела, конъюгированные с флуорофором, используются для обнаружения сигнала флуоресценции с помощью микроскопии. Другая стратегия заключается в объединении генетических конструкций с митохондриальными/лизосомальными красителями, такими как экспрессия конструкции слияния LAMP1::GFP в клетках при окрашивании их красным митохондриальным красителем (например, Mitotracker Red)16. Эти методологии, хотя и эффективны, требуют специфических антител и часто включают работу с фиксированными образцами или генерацию клеток / трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентно меченные митохондрии / лизосомы.
Здесь мы описываем использование коммерческого набора для окрашивания лизосом / митохондрий / ядра для оценки митофагий-активирующих свойств синтетического диамина O, O (октан-1,8-диил) биса (гидроксиламина), далее именуемого VL-85023, у червей C. elegans и линии раковых клеток человека Hep-3B (рис. 1). Набор для окрашивания содержит смесь лизосомных/митохондриальных/ядерных красителей, которые специфически окрашивают эти органеллы23. Ранее мы использовали этот набор для демонстрации митофагической активности 1,8 диаминооктана (далее именуемого VL-004) у C. elegans23. Важно отметить, что мы проверили результаты набора для окрашивания с помощью биосенсора мито-розеллы и измерений кПЦР содержания митохондриальной: ядерной ДНК23. Этот набор для окрашивания обладает следующими преимуществами. Во-первых, нет необходимости генерировать трансгенных животных или клетки, экспрессирующие митохондриальный биосенсор. Таким образом, мы можем изучать немодифицированных животных или клетки дикого типа и, таким образом, сэкономить много времени, денег и труда. Более того, как уже упоминалось, экспрессия митохондриальных биосенсоров может изменить функцию митохондрий. Во-вторых, комплект экономичен, прост в использовании и быстр. В-третьих, хотя мы демонстрируем метод на клетках C. elegans и человека, он может быть модифицирован для других типов клеток и организмов.
С учетом сказанного, как и любой метод, протокол набора для окрашивания имеет недостатки. Например, инкубация червей с реагентом проводится в отсутствие пищи (мы видели, что даже мертвые бактерии значительно снижают эффективность окрашивания). Хотя инкубационное время относительно короткое, возможно, что даже в этот период гомеостатических реакций могут быть изменены, включая митофагию. Кроме того, связывание красителей с ER/митохондриальными/ядерными белками и другими биомолекулами может влиять на активность этих органелл. Более того, в отличие от измерения митофагии с помощью генетических датчиков, мы работаем с червями и клетками, прошедшими химическую фиксацию. Поэтому невозможно продолжать наблюдение за одними и теми же червями/клетками в разное время. Следовательно, мы рекомендуем комбинировать различные методологии для проверки функции митофагии в конкретном физиологическом процессе. Ниже мы представляем новые данные, демонстрирующие, что VL-850 индуцирует устойчивую митофагию у червей C. elegans и клеток Hep-3B. Таким образом, эти данные еще раз подтверждают гипотезу о том, что VL-850 продлевает продолжительность жизни C. elegans и защищает C. elegans от окислительного повреждения за счет индукции здоровой митофагии . В качестве положительного контроля мы использовали протонный ионофор карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP), который является мощным индуктором митофагии24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Множественные пути митофагии включают различные белки и биомолекулы (например, кардиолипин29). Однако конечная точка этих путей аналогична — деградация митохондрий лизосомальными ферментами12,13. Действительно, несколько методов используют …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории Гросса за критическое прочтение рукописи, а также за их комментарии и советы. Мы благодарим Центр генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры Национального института здравоохранения (P40 OD010440), за предоставление некоторых штаммов. Это исследование было поддержано грантом Vitalunga Ltd и Израильского научного фонда (грант No 989/19). Графический абстрактный рисунок (рис. 1) был сгенерирован с помощью BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
