使用细胞器特异性染料检测 秀丽隐杆 线虫和哺乳动物细胞中的线粒体自噬
Summary
通过电子显微镜、基因传感器和免疫荧光探索线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的人员和大量的时间投资。在这里，我们证明了商业荧光染料试剂盒在量化 秀丽隐杆线虫 和肝癌细胞系的线粒体自噬过程方面的功效。
Abstract
线粒体对于各种生物学功能至关重要，包括能量产生、脂质代谢、钙稳态、血红素生物合成、调节细胞死亡和活性氧 （ROS） 的产生。ROS对于关键的生物过程至关重要。然而，如果不加以控制，它们会导致氧化损伤，包括线粒体损伤。受损的线粒体释放更多的ROS，从而加剧细胞损伤和疾病状态。一种称为线粒体自噬（线粒体自噬）的稳态过程选择性地去除受损的线粒体，然后被新的线粒体取代。有多种线粒体自噬途径，共同的终点是溶酶体中受损线粒体的分解。
包括遗传传感器、抗体免疫荧光和电子显微镜在内的几种方法使用该终点来量化线粒体自噬。每种检查线粒体自噬的方法都有其优点，例如特定的组织/细胞靶向（使用遗传传感器）和出色的细节（使用电子显微镜）。然而，这些方法通常需要昂贵的资源，训练有素的人员，以及在实际实验之前漫长的准备时间，例如用于创造转基因动物。在这里，我们提出了一种具有成本效益的替代方案，用于使用靶向线粒体和溶酶体的市售荧光染料测量线粒体自噬。该方法有效地测量线虫秀 丽隐杆 线虫和人肝细胞中的线粒体自噬，这表明其在其他模型系统中的潜在效率。
Introduction
线粒体对所有有氧动物（包括人类）都是必不可少的。它们通过氧化磷酸化1将生物分子的化学能转化为三磷酸腺苷（ATP），合成血红素2，通过β氧化降解脂肪酸3，调节钙4和铁5稳态，通过细胞凋亡控制细胞死亡6，并产生活性氧（ROS），在氧化还原稳态中起至关重要的作用7.两个互补和相反的过程保持线粒体的完整性和正常功能：新线粒体成分的合成（生物发生）和通过线粒体自噬选择性去除受损成分（即线粒体自噬）8。
几种线粒体自噬途径由酶介导，例如PINK1 / Parkin和受体，包括FUNDC1，FKBP8和BNIP / NIX9，10。值得注意的是，线粒体成分的选择性降解可以独立于自噬体机制（即，通过线粒体衍生的囊泡）发生11。然而，不同选择性线粒体自噬途径的终点是相似的（即溶酶体酶的线粒体降解）12，13。出于这个原因，识别和测量线粒体自噬的各种方法依赖于线粒体和溶酶体标记物14，15，16，17的共定位以及线粒体蛋白/线粒体DNA水平的降低18。
以下是使用荧光显微镜测量动物细胞线粒体自噬的现有实验方法的简要描述，强调线粒体自噬终点阶段。
线粒体自噬生物传感器
线粒体降解发生在溶酶体19的酸性环境中。因此，线粒体成分，包括蛋白质，在线粒体自噬过程的终点经历了从中性pH值到酸性pH值的转变。这种模式支撑了几种线粒体自噬生物传感器的作用机制，包括mito-Rosella18 和串联mCherry-GFP-FIS114。这些传感器含有pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）和pH不敏感的红色荧光蛋白（RFP）。因此，在线粒体自噬的终点，由于GFP荧光团的猝灭，绿红荧光比显着下降。这些传感器的主要限制是（1）荧光团之间可能存在的Förster共振能量转移（FRET）;（2）GFP和RFP的差异成熟率;（3）由于连接它们的多肽的蛋白水解裂解，GFP和RFP之间的解离;（4）荧光-发射重叠;（5）差异荧光团亮度和淬灭15，16。
克服其中一些限制的传感器是Keima线粒体传感器17。mt-Keima传感器（源自珊瑚蛋白Keima）显示单个发射峰（620 nm）。然而，其激发峰对pH敏感。结果，当从高pH值转变为酸性pH 16，17时，从绿色激发（440 nm）过渡到红色激发（586 nm）。最近的线粒体自噬传感器Mito-SRAI通过允许在固定生物样本中进行测量来推进该领域20。然而，尽管遗传传感器具有许多优点，例如能够在特定的组织/细胞中表达它们并将它们靶向不同的线粒体区室，但它们也有局限性。一个限制是遗传传感器需要在细胞或动物中表达，这可能是耗时和资源密集型的。
此外，线粒体本身中传感器的表达可能会影响线粒体功能。例如，在 秀丽隐杆线虫 体壁肌肉中表达线粒体GFP（mtGFP）可扩展线粒体网络21。该表型取决于应激激活转录因子ATFS-1的功能，该因子在线粒体中未折叠蛋白质反应的激活（UPRmt）21中起重要作用。因此，尽管基因编码的线粒体/线粒体自噬生物传感器对于监测 体内线粒体稳态非常有用，但它们可能会影响它们旨在测量的过程。
线粒体/溶酶体特异性抗体和染料
测试线粒体/溶酶体共定位的另一种策略是使用针对线粒体/溶酶体蛋白的抗体，例如线粒体外膜蛋白TOM20和溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）22。在大多数情况下，与荧光团偶联的二抗用于 通过显微镜检测 荧光信号。另一种策略是将遗传构建体与线粒体/溶酶体染料相结合，例如在细胞中表达LAMP1：：GFP融合构建体，同时用红色线粒体染料（例如，Mitotracker Red）染色16。这些方法虽然有效，但需要特异性抗体，并且通常涉及使用固定标本或产生表达荧光标记线粒体/溶酶体的细胞/转基因动物。
在这里，我们概述了利用商业溶酶体/线粒体/核染色试剂盒来评估合成二胺O，O（辛烷-1，8-二基）双（羟胺），以下简称VL-85023，在 秀丽隐杆线虫 和人类癌细胞系Hep-3B（图1）。染色试剂盒包含溶酶体/线粒体/核靶向染料的混合物，可特异性染色这些细胞器23。我们之前使用该试剂盒证明了 秀丽隐杆线虫23 中 1，8 二氨基辛烷（以下简称 VL-004）的线粒体自噬活性。重要的是，我们使用丝线粒体：核DNA含量的qPCR测量验证了染色试剂盒结果23。该染色试剂盒具有以下优点。首先，不需要产生表达线粒体生物传感器的转基因动物或细胞。因此，我们可以研究未经修饰的野生型动物或细胞，从而节省大量时间、金钱和劳动力。此外，如前所述，表达线粒体生物传感器可以改变线粒体功能。其次，该套件具有成本效益，易于使用且快速。第三，尽管我们在 秀丽隐杆线虫 和人类细胞中展示了该方法，但它可以针对其他细胞类型和生物体进行修饰。
话虽如此，与任何方法一样，染色试剂盒方案也有缺点。例如，蠕虫与试剂的孵育是在没有食物的情况下进行的（我们已经看到，即使是死细菌也会显着降低染色效率）。虽然孵育时间相对较短，但即使在这个时间范围内，稳态反应也可能改变，包括线粒体自噬。此外，染料与ER/线粒体/核蛋白和其他生物分子的结合可能会影响这些细胞器的活性。此外，与使用遗传传感器测量线粒体自噬不同，我们使用经过化学固定的蠕虫和细胞。因此，不可能在不同时间继续监测相同的蠕虫/细胞。因此，我们建议结合不同的方法来验证线粒体自噬在特定生理过程中的功能。下面，我们提供了新的数据，表明VL-850在秀丽隐杆线虫和Hep-3B细胞中诱导强大的线粒体自噬。因此，这些数据进一步支持了VL-850延长秀丽隐杆线虫寿命并通过诱导健康线粒体自噬保护秀丽隐杆线虫免受氧化损伤的假设。我们使用质子离子载体羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），这是一种有效的线粒体自噬诱导剂24，作为阳性对照。
Protocol
Representative Results
Discussion
多种线粒体自噬途径涉及各种蛋白质和生物分子（例如心磷脂29）。然而，这些途径的终点是相似的——溶酶体酶12，13对线粒体的降解。事实上，有几种方法使用这个端点来量化线粒体自噬。然而，一些方法，如电子显微镜，需要昂贵的设备、训练有素的专家，以及延长标本和分析的准备时间。此外，尽管使用线粒体自噬生物传感器?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢格罗斯实验室成员对手稿的批判性阅读以及他们的评论和建议。我们感谢由美国国立卫生研究院研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助的Caenorhabditis遗传学中心（CGC）提供了一些菌株。这项研究得到了Vitalunga Ltd和以色列科学基金会的资助（资助号989/19）。图形抽象图（图1）是用 BioRender.com 生成的。
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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