Caenorhabditis elegans ve Memeli Hücrelerinde Mitopajinin Organele Özgü Boyalar Kullanılarak Saptanması
Summary
Mitofaji’yi elektron mikroskobu, genetik sensörler ve immünofloresan yoluyla keşfetmek, pahalı ekipman, yetenekli personel ve önemli bir zaman yatırımı gerektirir. Burada, ticari bir floresan boya kitinin hem Caenorhabditis elegans hem de bir karaciğer kanseri hücre hattındaki mitopaji sürecini ölçmedeki etkinliğini gösteriyoruz.
Abstract
Mitokondri, enerji üretimi, lipid metabolizması, kalsiyum homeostazı, heme biyosentezi, düzenlenmiş hücre ölümü ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik fonksiyonlar için gereklidir. ROS, anahtar biyolojik süreçler için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, kontrolsüz olduklarında, mitokondriyal hasar da dahil olmak üzere oksidatif hasara yol açabilirler. Hasarlı mitokondri daha fazla ROS salgılar, böylece hücresel hasarı ve hastalık durumunu yoğunlaştırır. Mitokondriyal otofaji (mitopaji) adı verilen homeostatik bir süreç, hasarlı mitokondrileri seçici olarak ortadan kaldırır ve daha sonra yenileriyle değiştirilir. Birden fazla mitopaji yolu vardır, ortak son nokta lizozomlardaki hasarlı mitokondrinin parçalanmasıdır.
Genetik sensörler, antikor immünofloresansı ve elektron mikroskobu dahil olmak üzere çeşitli metodolojiler, mitopajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Mitopajiyi incelemek için kullanılan her yöntemin, spesifik doku / hücre hedefleme (genetik sensörlerle) ve büyük ayrıntı (elektron mikroskobu ile) gibi avantajları vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle pahalı kaynaklar, eğitimli personel ve transgenik hayvanlar oluşturmak gibi gerçek deneyden önce uzun bir hazırlık süresi gerektirir. Burada, mitokondri ve lizozomları hedef alan ticari olarak temin edilebilen floresan boyaları kullanarak mitofajiyi ölçmek için uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. Bu yöntem, nematod Caenorhabditis elegans ve insan karaciğer hücrelerindeki mitopajiyi etkili bir şekilde ölçer ve bu da diğer model sistemlerdeki potansiyel verimliliğini gösterir.
Introduction
Mitokondri, insanlar da dahil olmak üzere tüm aerobik hayvanlar için gereklidir. Biyomoleküllerin kimyasal enerjisini oksidatif fosforilasyon1 yoluyla adenozin trifosfata (ATP) dönüştürürler, heme2’yi sentezlerler, yağ asitlerini β oksidasyon3 yoluyla parçalarlar, kalsiyum4 ve demir5 homeostazını düzenlerler, apoptoz6 ile hücre ölümünü kontrol ederler ve redoks homeostazında hayati bir rol oynayan reaktif oksijen türleri (ROS) üretirler7. İki tamamlayıcı ve zıt süreç, mitokondrinin bütünlüğünü ve uygun işlevini korur: yeni mitokondriyal bileşenlerin sentezi (biyogenez) ve mitokondriyal otofaji (yani mitofaji) yoluyla hasarlı olanların seçici olarak uzaklaştırılması)8.
Çeşitli mitopaji yolaklarına PINK1 / Parkin gibi enzimler ve FUNDC1, FKBP8 ve BNIP / NIX 9,10 dahil olmak üzere reseptörler aracılık eder. Özellikle, mitokondriyal bileşenlerin seçici bozunması, otofagozom makinesinden bağımsız olarak (yani, mitokondriyal kaynaklı veziküller yoluyla) meydana gelebilir11. Bununla birlikte, farklı seçici mitopaji yolaklarının bitiş noktaları benzerdir (yani, lizozomal enzimler tarafından mitokondriyal bozunma)12,13. Bu nedenle, mitofajiyi tanımlamak ve ölçmek için çeşitli yöntemler, mitokondriyal ve lizozomal belirteçlerin 14,15,16,17 ve mitokondriyal proteinlerin / mitokondriyal DNA18 seviyelerinin azalmasına dayanır.
Aşağıda, ftolaysız mikroskopi kullanarak hayvan hücrelerinde mitopajiyi ölçmek için mevcut deneysel metodolojilerin kısa bir açıklaması bulunmaktadır ve mitopaji bitiş noktası fazını vurgulamaktadır.
Mitopaji biyosensörleri
Mitokondriyal bozunma, lizozom19’un asidik ortamında meydana gelir. Bu nedenle, proteinler de dahil olmak üzere mitokondriyal bileşenler, mitopaji işleminin son noktasında nötrden asidik bir pH’a geçiş yaşarlar. Bu model, mito-Rosella18 ve tandem mCherry-GFP-FIS114 dahil olmak üzere çeşitli mitopaji biyosensörlerinin etki mekanizmasını desteklemektedir. Bu sensörler pH’a duyarlı yeşil floresan proteini (GFP) ve pH’a duyarsız kırmızı floresan proteini (RFP) içerir. Bu nedenle, mitopajinin son noktasında, GFP floroforun söndürülmesi nedeniyle yeşil-kırmızı floresan oranı önemli ölçüde düşer. Bu sensörlerin başlıca sınırlamaları şunlardır: (1) floroforlar arasında olası Förster rezonans enerji transferi (FRET); (2) GFP ve RFP’nin diferansiyel olgunlaşma hızı; (3) GFP ve RFP arasında, onları birbirine bağlayan polipeptitin proteolitik bölünmesi nedeniyle ayrışma; (4) floresan-emisyon çakışması; ve (5) diferansiyel florofor parlaklığı ve söndürme15,16.
Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelen bir sensör, Keima mitokondriyal sensör17’dir. mt-Keima sensörü (mercan proteini Keima’dan türetilmiştir) tek bir emisyon zirvesi (620 nm) gösterir. Bununla birlikte, uyarma zirveleri pH’a duyarlıdır. Sonuç olarak, yüksek bir pH’tan asidik bir pH 16,17’ye geçerken yeşil bir uyarmadan (440 nm) kırmızı olana (586 nm) bir geçiş vardır. Daha yeni bir mitopaji sensörü olan Mito-SRAI, sabit biyolojik örneklerde ölçümlere izin vererek alanı ilerletmiştir20. Bununla birlikte, genetik sensörlerin, onları belirli dokularda / hücrelerde ifade etme ve bunları farklı mitokondriyal bölmelere hedefleme yeteneği gibi birçok avantajına rağmen, sınırlamaları da vardır. Bir sınırlama, genetik sensörlerin hücrelerde veya hayvanlarda ifade edilmesi gerektiğidir, bu da zaman alıcı ve kaynak yoğun olabilir.
Ek olarak, sensörlerin mitokondri içindeki ekspresyonu, mitokondriyal fonksiyonu etkileyebilir. Örneğin, C. elegans solucanı vücut duvarı kaslarında mitokondriyal GFP’nin (mtGFP) eksprese edilmesi, mitokondriyal ağıgenişletir 21. Bu fenotip, mitokondride (UPRmt)21’de katlanmamış protein yanıtının aktivasyonunda önemli bir rol oynayan stresle aktive edilmiş transkripsiyon faktörü ATFS-1’in işlevine bağlıdır. Bu nedenle, genetik olarak kodlanmış mitokondri / mitopaji biyosensörleri, mitokondri homeostazını in vivo olarak izlemek için son derece yararlı olsa da, ölçmek için tasarlandıkları süreci etkileyebilirler.
Mitokondri/lizozom spesifik antikorlar ve boyalar
Mitokondriyal / lizozom kolokalizasyonunu test etmek için bir başka strateji, mitokondriyal dış membran proteini TOM20 ve lizozomal ilişkili membran proteini 1 (LAMP1) 22 gibi mitokondriyal / lizozomal proteinlere karşı antikorlar kullanmaktır. Çoğu durumda, bir florofora konjuge edilen ikincil antikorlar, floresan sinyalini mikroskopi yoluyla tespit etmek için kullanılır. Diğer bir strateji, genetik yapıları mitokondriyal/lizozomal boyalarla birleştirmektir, örneğin hücrelerde bir LAMP1::GFP füzyon yapısını eksprese ederken, kırmızı mitokondriyal boya (örneğin, Mitotracker Red) ile boyamaktır16. Bu metodolojiler, etkili olsa da, spesifik antikorlar gerektirir ve genellikle sabit örneklerle çalışmayı veya floresan olarak etiketlenmiş mitokondri / lizozomları ifade eden hücreler / transgenik hayvanlar üretmeyi içerir.
Burada, bundan böyle VL-85023 olarak anılacak olan sentetik diamin O,O (oktan-1,8-diil)bis’in (hidroksilamin) mitopaji aktive edici özelliklerini değerlendirmek için ticari bir lizozom / mitokondri / nükleer boyama kitinin kullanımını C . elegans solucanlarında ve insan kanser hücre hattı Hep-3B’de özetliyoruz (Şekil 1). Boyama kiti, özellikle bu organelleri boyayan lizozomal / mitokondriyal / nükleer hedefli boyaların bir karışımını içerir23. Bu kiti daha önce C. elegans23’te 1,8 diaminooktan (bundan böyle VL-004 olarak anılacaktır) mitopaji aktivitesini göstermek için kullandık. Daha da önemlisi, boyama kiti sonuçlarını mito-Rosella biyosensörü ve mitokondriyal: nükleer DNA içeriği23’ün qPCR ölçümleri ile doğruladık. Bu boyama kiti aşağıdaki avantajları sunar. İlk olarak, bir mitokondriyal biyosensörü ifade eden transgenik hayvanlar veya hücreler üretmeye gerek yoktur. Bu nedenle, değiştirilmemiş vahşi tip hayvanları veya hücreleri inceleyebilir ve böylece çok fazla zaman, para ve emek tasarrufu sağlayabiliriz. Ayrıca, belirtildiği gibi, mitokondriyal biyosensörlerin eksprese edilmesi mitokondriyal fonksiyonu değiştirebilir. İkincisi, kit uygun maliyetli, kullanımı kolay ve hızlıdır. Üçüncüsü, yöntemi C. elegans ve insan hücrelerinde göstermemize rağmen, diğer hücre tipleri ve organizmalar için değiştirilebilir.
Bununla birlikte, herhangi bir yöntem gibi, boyama kiti protokolünün de dezavantajları vardır. Örneğin, solucanların reaktif ile inkübasyonu, gıda yokluğunda gerçekleştirilir (ölü bakterilerin bile boyama verimliliğini önemli ölçüde azalttığını gördük). Kuluçka süresi nispeten kısa olmasına rağmen, bu zaman diliminde bile, mitopaji de dahil olmak üzere homeostatik tepkilerin değişmesi mümkündür. Ek olarak, boyaların ER / mitokondriyal / nükleer proteinlere ve diğer biyomoleküllere bağlanması bu organellerin aktivitelerini etkileyebilir. Dahası, genetik sensörlerle mitofaji ölçümünün aksine, kimyasal fiksasyona uğramış solucanlar ve hücrelerle çalışıyoruz. Bu nedenle, aynı solucanları / hücreleri farklı zamanlarda izlemeye devam etmek imkansızdır. Bu nedenle, belirli bir fizyolojik süreçte mitopajinin işlevini doğrulamak için farklı metodolojileri birleştirmenizi öneririz. Aşağıda, VL-850’nin C. elegans solucanlarında ve Hep-3B hücrelerinde sağlam mitofajiyi indüklediğini gösteren yeni veriler sunuyoruz. Bu nedenle, bu veriler VL-850’nin C. elegans’ın ömrünü uzattığı ve C. elegans’ı sağlıklı mitofajinin indüksiyonu yoluyla oksidatif hasardan koruduğu hipotezini daha da desteklemektedir. Proton iyonofor karbonil siyanür 4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), güçlü bir mitofaji indükleyicisi24 olan pozitif bir kontrol olarak kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çoklu mitopaji yolları çeşitli proteinleri ve biyomolekülleri içerir (örneğin, kardiyolipin29). Bununla birlikte, bu yolakların bitiş noktası benzerdir – mitokondrinin lizozomal enzimler tarafından parçalanması12,13. Gerçekten de, birkaç yöntem mitofajiyi ölçmek için bu son noktayı kullanır. Bununla birlikte, elektron mikroskobu gibi bazı yöntemler, pahalı ekipmanlara, eğitimli uzmanlara ve numuneler ve analizler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gross laboratuvarı üyelerine, makalenin eleştirel okuması ve yorum ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi’ne (CGC) bazı suşları sağladığı için teşekkür ederiz. Bu araştırma Vitalunga Ltd ve İsrail Bilim Vakfı’ndan (hibe No. 989/19) bir hibe ile desteklenmiştir. Grafiksel soyut şekil (Şekil 1) BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
