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Biology

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337

Summary

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

Abstract

미토콘드리아는 에너지 생산, 지질 대사, 칼슘 항상성, 헴 생합성, 조절된 세포 사멸 및 활성 산소 종(ROS) 생성을 포함한 다양한 생물학적 기능에 필수적입니다. ROS는 주요 생물학적 과정에 필수적입니다. 그러나 통제되지 않으면 미토콘드리아 손상을 포함한 산화적 손상을 유발할 수 있습니다. 손상된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 방출하여 세포 손상과 질병 상태를 심화시킵니다. 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)이라는 항상성 과정은 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거한 다음 새로운 미토콘드리아로 대체합니다. 여러 미토파지 경로가 있으며, 일반적인 종점은 리소좀에서 손상된 미토콘드리아의 분해입니다.

유전자 센서, 항체 면역형광 및 전자 현미경을 포함한 여러 방법론에서 이 엔드포인트를 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 미토파지를 검사하는 각 방법은 특정 조직/세포 표적화(유전자 센서 사용) 및 매우 상세하게(전자 현미경 사용)와 같은 장점이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 고가의 자원, 훈련된 인력 및 형질전환 동물을 만드는 것과 같은 실제 실험 전에 긴 준비 시간이 필요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료를 사용하여 미토파지를 측정하기 위한 비용 효율적인 대안을 제시합니다. 이 방법은 선충 Caenorhabditis elegans 및 인간 간 세포에서 미토파지를 효과적으로 측정하며, 이는 다른 모델 시스템에서 잠재적인 효율성을 나타냅니다.

Introduction

미토콘드리아는 인간을 포함한 모든 호기성 동물에게 필수적입니다. 산화적 인산화를 통해 생체분자의 화학적 에너지를 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)으로 변환하고, 헴(hem)2을 합성하고, 산화β 산화3통해 지방산을 분해하고, 칼슘(calcium4)과 철(iron)5 항상성을 조절하고, 세포사멸(apoptosis)6에 의한 세포 사멸을 조절하며, 산화환원 항상성(redox homeostasis)7에 중요한 역할을 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. 두 가지 보완적이고 반대되는 과정은 미토콘드리아의 완전성과 적절한 기능을 유지합니다: 새로운 미토콘드리아 성분의 합성(생물 발생)과 미토콘드리아 자가포식(즉, 미토파지) 통한 손상된 성분의 선택적 제거8.

여러 미토파지 경로는 PINK1/Parkin과 같은 효소와 FUNDC1, FKBP8 및 BNIP/NIX 9,10을 포함한 수용체에 의해 매개됩니다. 특히, 미토콘드리아 성분의 선택적 분해는 자가포식소 기계와 독립적으로 발생할 수 있습니다(즉, 미토콘드리아 유래 소포를 통해)11. 그러나 다른 선택적 미토파지 경로의 종점은 유사합니다(즉, 리소좀 효소에 의한 미토콘드리아 분해)12,13. 이러한 이유로, 미토파지를 확인하고 측정하는 다양한 방법은 미토콘드리아 및 리소좀 마커14,15,16,17의 공동 국소화와 미토콘드리아 단백질/미토콘드리아 DNA18의 감소된 수준에 의존한다.

아래는 형광 현미경을 사용하여 동물 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 기존 실험 방법론에 대한 간결한 설명으로, 미토파지 종말점 단계를 강조합니다.

Mitophagy 바이오센서
미토콘드리아 분해는 리소좀의 산성 환경 내에서 일어난다19. 따라서 단백질을 포함한 미토콘드리아 성분은 미토파지 과정의 종점에서 중성에서 산성 pH로의 전환을 경험합니다. 이 패턴은 mito-Rosella18 및 탠덤 mCherry-GFP-FIS114를 포함한 여러 미토파지 바이오센서의 작용 메커니즘을 뒷받침합니다. 이 센서에는 pH 민감성 녹색 형광 단백질(GFP)과 pH 비민감성 적색 형광 단백질(RFP)이 포함되어 있습니다. 따라서 미토파지의 종점에서 녹색-적색 형광 비율은 GFP 형광단의 소멸로 인해 크게 떨어집니다. 이러한 센서의 주요 제한 사항은 (1) 형광단 사이의 가능한 Förster 공명 에너지 전달(FRET); (2) GFP와 RFP의 차등 성숙률; (3) GFP와 RFP를 연결하는 폴리펩티드의 단백질 분해 절단으로 인한 해리; (4) 형광-방출 중첩; 및 (5) 차등 형광단 밝기 및 담금질15,16.

이러한 한계들 중 일부를 극복하는 센서가 케이마 미토콘드리아 센서(17)이다. mt-Keima 센서(산호 단백질 Keima에서 유래)는 단일 방출 피크(620nm)를 표시합니다. 그러나 여기 피크는 pH에 민감합니다. 그 결과, 높은 pH에서 산성 pH 440로 이동할 때 녹색 여기 (586 nm)에서 적색 (16,17 nm)으로 전환됩니다. 보다 최근의 미토파지 센서인 Mito-SRAI는 고정된 생물학적 샘플(20)에서 측정을 허용함으로써 이 분야를 발전시켰다. 그러나 특정 조직/세포에서 발현하고 별개의 미토콘드리아 구획을 표적으로 삼는 능력과 같은 유전자 센서의 많은 장점에도 불구하고 한계도 있습니다. 한 가지 한계는 유전자 센서가 세포나 동물에서 발현되어야 한다는 것인데, 이는 시간과 자원 집약적일 수 있습니다.

또한 미토콘드리아 자체 내의 센서 발현은 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 예쁜꼬마선충 벌레 체벽 근육에서 미토콘드리아 GFP(mtGFP)를 발현하면 미토콘드리아 네트워크(21)가 확장된다. 이 표현형은 미토콘드리아(UPRmt)21에서 펼쳐진 단백질 반응의 활성화에 필수적인 역할을 하는 스트레스 활성화 전사 인자 ATFS-1의 기능에 의존합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 미토콘드리아/미토파지 바이오센서는 생체 내에서 미토콘드리아 항상성을 모니터링하는 데 매우 유용하지만 측정하도록 설계된 바로 그 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다.

미토콘드리아/리소좀 특이적 항체 및 염료
미토콘드리아/리소좀 colocalization을 테스트하기 위한 또 다른 전략은 미토콘드리아 외막 단백질 TOM20 및 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)22과 같은 미토콘드리아/리소좀 단백질에 대한 항체를 사용하는 것입니다. 대부분의 경우 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 현미경을 통해 형광 신호를 검출합니다. 또 다른 전략은 유전자 구조를 미토콘드리아/리소좀 염료와 결합하는 것인데, 예를 들어 세포에서 LAMP1::GFP 융합 구조를 발현하는 동시에 적색 미토콘드리아 염료(예: Mitotracker Red)로 염색하는 것입니다16. 이러한 방법론은 효과적이기는 하지만 특정 항체가 필요하며 종종 고정된 표본으로 작업하거나 형광 표지된 미토콘드리아/리소좀을 발현하는 세포/형질전환 동물을 생성하는 것을 포함합니다.

여기에서는 예쁜꼬마선충 및 인간 암 세포주 Hep-3B에서 합성 디아민 O,O(옥탄-1,8-디일)비스(하이드록실아민)(이하 VL-85023이라고 함)의 미토파지 활성화 특성을 평가하기 위한 상업용 리소좀/미토콘드리아/핵 염색 키트의 활용에 대해 간략하게 설명합니다(그림 1). 염색 키트에는 이러한 소기관을 특이적으로 염색하는 리소좀/미토콘드리아/핵 표적 염료의 혼합물이 포함되어 있다23. 우리는 이전에 이 키트를 사용하여 예쁜꼬마선충23에서 1,8 디아미노옥탄(이하 VL-004라고 함)의 미토파지 활성을 입증했습니다. 중요하게도, 우리는 미토-로젤라 바이오센서와 미토콘드리아:핵 DNA 함량의 qPCR 측정으로 염색 키트 결과를 검증했습니다23. 이 염색 키트는 다음과 같은 이점을 제공합니다. 첫째, 미토콘드리아 바이오센서를 발현하는 형질전환 동물이나 세포를 생성할 필요가 없다. 따라서 우리는 변형되지 않은 야생형 동물이나 세포를 연구할 수 있으므로 많은 시간과 돈과 노동력을 절약할 수 있습니다. 또한, 언급한 바와 같이, 발현된 미토콘드리아 바이오센서는 미토콘드리아 기능을 변화시킬 수 있다. 둘째, 키트는 비용 효율적이고 사용하기 쉽고 빠릅니다. 셋째, 예쁜꼬마선충과 인간 세포에서 이 방법을 입증하지만 다른 세포 유형 및 유기체에 대해 변형될 수 있습니다.

즉, 다른 방법과 마찬가지로 염색 키트 프로토콜에는 단점이 있습니다. 예를 들어, 시약과 함께 웜의 배양은 음식이 없을 때 수행됩니다 (우리는 죽은 박테리아조차도 염색 효율을 현저히 감소시키는 것을 보았습니다). 잠복기는 비교적 짧지만 이 기간에도 미토파지를 포함한 항상성 반응이 변경될 수 있습니다. 또한, ER/미토콘드리아/핵 단백질 및 기타 생체 분자에 대한 염료의 결합은 이러한 세포 기관의 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 유전자 센서를 사용한 미토파지 측정과 달리 화학적 고정을 거친 벌레 및 세포로 작업합니다. 따라서 동일한 웜/셀을 서로 다른 시간에 계속 모니터링하는 것은 불가능합니다. 따라서 특정 생리학적 과정에서 미토파지의 기능을 검증하기 위해 다양한 방법론을 결합하는 것이 좋습니다. 아래에서 우리는 VL-850이 예쁜꼬마선충 벌레와 Hep-3B 세포에서 강력한 미토파지를 유도한다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제시합니다. 따라서 이러한 데이터는 VL-850이 예쁜꼬마선충의 수명을 연장하고 건강한 예쁜꼬마선 의 유도를 통해 예 쁜꼬마선충 을 산화적 손상으로부터 보호한다는 가설을 더욱 뒷받침합니다. 우리는 강력한 미토파지 유도제24인 양성자 이오노포어 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)을 양성 대조군으로 사용했습니다.

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Protocol

참고: 독자의 편의를 위해 프로토콜을 두 부분으로 나눴습니다 : 하나는 예쁜꼬마선충의 미토파지 측정 프로토콜에 초점을 맞추고 다른 하나는 간 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 프로토콜에 초점을 맞춥니다. 재료 목록은 제공된 재료 표 에서 찾을 수 있습니다.

1. 예쁜꼬마선충 프로토콜

  1. 선충 성장 배지(NGM) 플레이트 및 대장균 OP50 박테리아 스톡 준비
    참고: 명확히 하자면, NGM 플레이트 및 OP50 박테리아 스톡25,26의 준비에 대한 표준 프로토콜을 따랐지만 서로 다른 실험실 간에 이러한 프로토콜에 차이가 있을 수 있음을 알고 있습니다. 따라서 실험의 정확한 복제를 보장하기 위해 완전한 프로토콜을 포함했습니다.
    1. pH 6에 도달할 때까지 ~150mL의 1M K 2HPO 4를 500mL의 1M KH2PO4 용액에 첨가하여 1M 인산칼륨 완충액, pH 6을 만듭니다. 버퍼를 0.22μm 진공 필터/보관 시스템에 통과시켜 살균합니다.
    2. 0.1 M의 염화칼슘(CaCl2)과 황산마그네슘(MgSO4)을 만들어 0.2μm 주사기 필터로 멸균한다.
    3. 무수 에탄올에 5mg/mL 콜레스테롤을 준비합니다.
      알림: 콜레스테롤은 에탄올로 준비되므로 여과하지 마십시오.
    4. 염화나트륨(NaCl) 1.5g, 펩톤 1.25g, 한천 8.5g을 이중 증류수(DDW) 500mL에 용해시켜 NGM-한천을 준비합니다. 오토클레이브하고 ~55°C로 식힙니다.
    5. 무균 상태에서 인산칼륨 완충액(pH 6) 12.5mL, 0.1MCaCl2 0.5mL, 0.1M MgSO4 0.5mL, 콜레스테롤 5mg/mL 콜레스테롤 1mL를 추가합니다. 모든 첨가 후에 잘 섞는다.
    6. 녹은 NGM-한천 4mL를 각 35mm 플레이트에 추가합니다. 접시를 실온(RT, ~21°C)에서 굳히기 위해 밤새 두십시오.
    7. Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트를 만들기 위해 400mL의 증류수, 탈 이온수 (DDW)에 NaCl 5g, 트립톤 5g, 효모 추출물 2.5g 및 한천 7.5g을 녹이고 용액의 pH를 7.0으로 조정하고 DDW로 부피를 500mL까지 올리고 오토 클레이브. 용액이 55°C로 냉각되면, 혼합물 25mL를 각 90mm 페트리 접시에 붓고, 플레이트를 실온에서 2일 동안 건조시킨다. 다음으로, 글리세롤 스톡으로부터 건조된 LB 플레이트 상에 OP50 박테리아를 줄무늬 추출하고, 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 단일 콜로니를 얻었다.
    8. 2L의 DDW에 8g의 트립톤, 5g의 효모 추출물, 2.5g의 염화나트륨(NaCl)을 용해시켜 0.5x 효모 트립톤(YT)을 준비합니다. pH를 7로 조정하고 오토클레이브합니다.
    9. 냉각되면 갓 줄무늬가 있는 LB 플레이트에서 OP50 박테리아 콜로니를 250mL 삼각 플라스크에 있는 50mL의 2x YT 배지에 접종합니다. 37°C 및 250 rpm에서 약 0.6의 광학 밀도(OD600)로 진탕한다.
  2. 차량 및 실험용 플레이트 준비
    1. 각 100mm NGM-한천 플레이트의 중앙에 50μL의 OP35 박테리아를 추가합니다. 실온(실온, 21°C)에서 밤새 건조합니다.
    2. DMSO 중 0.5 M VL-850을 준비하고, M9 완충액 (22 mM KH2PO 4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, pH 7, 및 1 mM MgSO 4)을 사용하여 10 mM VL-850으로 희석한다(26). pH가 7.0인지 확인하고(그렇지 않은 경우 0.1M HCl로 적정) 0.22μm 주사기 필터로 용액을 필터 멸균합니다. 위에서 설명한 대로 비히클을 준비하되 약물(이 경우 VL-850)은 사용하지 않습니다. DMSO에서 50 mM FCCP를 만들고, M9 완충액으로 1 mM FCCP로 희석하고, 0.22 μm 주사기 필터로 용액을 필터 멸균한다.
    3. 25μL의 비히클(음성 대조군), FCCP(양성 대조군, 5μM) 또는 VL-850(실험 처리, 62.5μM)을 박테리아 잔디밭에 별도로 파종된 NGM 플레이트에 추가합니다.
    4. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 RT(실온, 21°C)에서 건조시킵니다. ~16시간 후에 플레이트를 사용하십시오.
  3. 동기화된 젊은 성인 C. elegans 자웅동체 얻기
    1. 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 및 86 mM NaCl로 1 L의 M9 완충액을 만든다. 고압 증기 멸균으로 소독하고 식히십시오. 냉각되면 1mM MgSO4 (0.22 μm 필터 멸균) 1mL를 추가합니다.
    2. 2.5N 수산화나트륨 0.8mL와 차아염소산나트륨 5% 용액 1mL와 DDW 2.2mL를 섞어 알칼리성 차아염소산염 용액(최종 농도 수산화나트륨 0.5N, 차아염소산나트륨 1.25%)을 만듭니다.
    3. NGM 플레이트를 1mL의 M9 완충액으로 3배 세척하여 모든 어미가 튜브에 수집되었는지 확인하여 벌레(중력 자웅동체)를 15mL 원추형 튜브에 수집합니다.
    4. 500 × g 에서 1 분 동안 원심 분리하여 벌레를 침전시키고 1 mL의 부피가 남을 때까지 상청액을 버립니다.
    5. 알칼리성 차아염소산염 용액 1mL를 넣고 튜브를 5배 뒤집어 섞는다. 알의 방출을 돕기 위해 튜브를 3분 동안 부드럽게 소용돌이치게 하고 해부 입체경으로 벌레의 상태를 관찰합니다.
    6. 벌레의 약 50%가 부러지면 M9 완충액 5mL를 넣고 즉시 500 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 알을 침전시킵니다.
    7. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 5mL의 M9 완충액을 넣고 세척 절차를 2회 반복합니다.
    8. 2mL가 남을 때까지 상층액을 제거하고 튜브를 20rpm에서 ~16시간(RT, 21°C) 동안 회전(360° 회전)하여 동기화된 L1 유충을 얻습니다. 이 튜브에서 유리 슬라이드에 5μL 방울을 떨어뜨리고 입체경으로 유충 수를 세고 이 단계를 3번 반복하고 세 카운트의 평균을 취한 다음 마이크로리터(μL)당 벌레 수를 추정합니다. 이러한 계산을 기반으로 OP50 박테리아가 파종된 NGM 플레이트당 ~200마리의 유충을 추가합니다.
    9. L1 유충을 21°C에서 어린 성충 단계까지 ~48시간 동안 성장시킵니다.
  4. 약물 치료 및 현미경 검사 절차
    1. 각 실험판 또는 제어판에 100개의 웜을 놓습니다. 네거티브, 포지티브 및 실험 플레이트에 각각 비히클, 5μM FCC 및 62.5μM VL-850이 포함되어 있는지 확인합니다. 21°C에서 6시간 동안 배양합니다.
    2. 1mL의 M9 완충액을 사용하여 각 플레이트의 웜을 1.7mL 미세 원심분리기 튜브로 세척합니다. 미니 원심분리기에서 튜브를 짧게(~3초) 돌립니다. 다음으로, 웜 펠릿을 방해하지 않고 M9 버퍼를 부드럽게 피펫팅하여 상층액을 버립니다. 이 세척 단계를 2회 반복한 다음 웜 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 부드럽게 제거합니다.
    3. 0.1% v/v 폴록사머 188, 0.1% v/v 플루로닉 F127 및 염색 키트 시약 2μL를 포함하는 M9 완충액 200μL를 웜 펠릿에 추가합니다. 혼합물을 실온(실온, 21°C)에서 1시간 동안 20rpm(360° 회전)으로 회전시킵니다. 염료를 빛으로부터 보호하려면 튜브를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
    4. 1.3.4 단계에서 설명한대로 웜을 부드럽게 돌립니다. 그런 다음 웜 펠릿을 방해하지 않고 염색 용액을 제거합니다. 다음에, 단계 1.3.2에 기재된 바와 같이 웜을 세척하고, 적절한 처리를 함유하는 시딩된 NGM-한천 플레이트 내로 이들을 옮긴다 - 예를 들어, FCCP로 처리된 웜은 FCCP를 함유하는 플레이트로 옮긴다. 염색 시약은 빛에 민감하기 때문에 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오.
      참고: 과도한 염료로 인한 배경 소음을 최소화하기 위해 박테리아와 해당 처리제가 포함된 배양 플레이트로 벌레를 옮겼습니다. 예를 들어, FCCP로 처리된 웜은 FCCP 보충 플레이트 등으로 옮겨졌습니다.
    5. 1mL의 M9 완충액을 사용하여 플레이트에서 벌레를 신선한 미세 원심분리기 튜브로 세척합니다. 같은 방법으로 웜을 2 번 씻으십시오. 다음으로, 얼음 위에 1% 포름알데히드로 벌레를 30분 동안 고정하고, 벌레를 1mL의 M9 완충액으로 3배 세척하여 잔류 포름알데히드를 제거합니다. 세척 후 웜을 펠릿으로 회전시키고 최대량의 상청액을 흡인하여 웜 펠릿을 10μL의 M9에 그대로 유지합니다.
    6. 2.5% 아가로스를 제조하기 위해, 0.125 g의 아가로스를 10 mL의 붕규산 유리 시험관에 칭량하고, 5 mL의 M9 완충액을 첨가하고, 분젠 버너로 튜브를 부드럽게 가열하여 아가로스를 용해시킨다. 용융된 아가로스를 75°C로 설정된 건조 욕으로 옮기고, 1 mL 팁을 이용하여, 녹은 아가로스 100 μL를 Deckgläser 현미경 커버 글라스 (24 mm x 60 mm) 상에 올려 놓았다. 즉시, agarose drop에 수직으로 다른 슬라이드를 넣어 십자형을 형성합니다. ~2분 정도 기다렸다가 상단 커버 유리를 (부드럽게) 밀어 슬라이드를 부드럽게 분리하여 하단 커버 슬라이드에 아가로스 패드를 남깁니다.
      알림: 튜브에서 아가로스를 가열하는 동안 주의하고 튜브가 신체에서 멀리 떨어져 있는지 확인하십시오. 아가로스의 응고를 최소화하기 위해 1 mL 팁의 가장자리를 자릅니다.
    7. 파스퇴르 유리 피펫(즉, 튜브의 전체 양, ~10μL)을 사용하여 벌레를 아가로스 패드로 옮깁니다. 실험실 물티슈로 만든 심지로 여분의 액체를 제거한 다음 더 작은 덮개 슬라이드(24mm x 40mm)로 벌레를 덮습니다. 증발을 방지하기 위해 작은 커버 슬라이드 주변에 투명 매니큐어를 바르십시오. 슬라이드를 어두운 상자에 넣어 빛으로부터 보호하십시오.
    8. 컨포칼 현미경을 사용하여 60x 배율 렌즈를 사용하여 적절한 파장(아래 참조)에서 24시간 이내에 벌레를 이미지화합니다.
      1. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다.
      2. 이미징 소프트웨어를 열고 소프트웨어의 회색 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 공개 획득 | Ti2 풀 패드 | ND 획득 | 오른쪽 클릭의 결과로 나타나는 팝업의 옵션을 클릭하여 LUT를 수행합니다.
      3. Ti2 Full Pad(Ti2 전체 패드)에서 60x를 선택합니다.
      4. 획득(Acquisition)에서 아이피스 DIA를 선택하고 현미경 미세 초점 노브를 사용하여 웜에 초점을 맞춥니다. 획득에서 Spinning disk(회전 디스크)를 선택하고 16비트 - 범주화 없음(16-bit - No binning) 옵션을 선택합니다. 각 형광 필터에 대해 노출 시간을 500ms로 설정하고 명시야의 경우 20ms로 설정합니다. 이러한 매개 변수가 설정되면 지금 실행을 선택하고 출력 이미지가 ND2 파일로 생성될 때까지 기다립니다.
        참고: 노출 시간은 이미징 설정에 따라 특성이 다르기 때문에 실험적으로 결정해야 합니다. 룩업 테이블(LUT)을 사용하여 각 파장에 대한 형광 강도를 검사합니다.
  5. 이미지 분석
    1. colocalization 플러그인을 사용하여 ImageJ27에서 컨포칼 이미지(여기서는 Nikon ND2 파일)를 엽니다. 각 ND 파일에는 세 가지 파장(DAPI, GFP/FITC[녹색] 및 Texas Red[빨간색] 필터 사용)과 가시광선에서 촬영한 이미지 평면이 포함되어 있습니다. 이러한 이미지에 액세스하려면 ImageJ 서버에서 ND 파일을 열고 대화 상자에서 [이미지 분할]을 선택합니다. 명시야(BF), 녹색 채널 및 빨간색 채널 이미지로 작업합니다.
    2. 이미지를 클릭하여 원본 이미지를 그대로 유지하기 위해 이러한 이미지의 복제본을 생성하십시오 . 키보드 단축키 Shift + D를 복제하거나 사용합니다.
    3. 배경을 줄이려면 위에서 언급한 대로 이미지의 다른 복제본을 생성합니다. 롤링 반경100인 배경을 빼고 배경 만들기(빼지 않음) 옵션을 선택하여 주어진 이미지의 배경이 포함된 이미지를 생성합니다. 다음으로 프로세스 | 이미지 계산기를 사용하고 두 번째 복제된 이미지에서 첫 번째 복제된 이미지를 뺍니다. colocalization 분석에 결과 이미지를 사용합니다.
    4. colocalization 플러그인을 사용하려면 녹색 채널과 빨간색 채널 이미지를 8비트로 변환하십시오. 이렇게 하려면 이미지 | 유형 | 8 비트.
    5. 클릭 플러그인 (Plugins) | 공동 현지화. colocalization 플러그인 (위 참조)을 사용하여 미토콘드리아와 리소좀 신호의 colocalization을 측정하려면 비율 = 75%, 임계값 빨간색 채널 = 80.0, 임계값 녹색 채널 = 50.0 매개변수를 사용합니다. 출력값은 RGB 영상에 공국소화된 푼타와 3개의 8비트 영상(녹색, 적색, 공국소화된 영상)의 조합을 포함하는 8비트 이진 영상입니다.
    6. 벌레의 머리 체벽 근육에 있는 점자에 초점을 맞춰 이 영역을 수동으로 선택하고 편집 | 선택 | Create Mask(마스크 만들기)를 사용하여 관심 영역을 선택합니다(그림 2A, B). 다른 염색된 개체(예: 인두 근육)를 선택적으로 제거하여 머리 체벽 근육 영역을 분석합니다.
    7. 관심 영역(ROI)에서 입자를 선택하려면 이미지 계산기를 사용하여 공국소화된 8비트 마스크 이미지를 선택합니다. 그런 다음 연산 AND (그림 3A)를 사용하여 ROI에서 푼타를 선택합니다. 이렇게 하면 ROI에 puncta가 있는 이미지가 생성됩니다(그림 3B).
    8. colocalized 미토콘드리아와 리소좀의 영역을 분석하려면 Analyze | 입자를 분석하고 0.1625 μm2 와 4 μm2 사이의 반점의 합을 측정합니다.

2. Hep-3B 암세포 프로토콜

  1. 의약품 원액 준비
    1. DMSO에서 100 mM VL-850을 준비한다. 0.5 M HEPES 완충액, pH 7.3으로 5 mM로 희석하고, 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 멸균한다. 그런 다음 앞에서 설명한대로 약물을 사용하지 않고 비히클을 준비하십시오 (이 경우 VL-850).
  2. 실험, 약물 치료 및 현미경 시술을 위한 Hep-3B 세포 배양
    1. 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS), 2% L-글루타민 및 1% 테트라사이클린(이하 완전 DMEM이라고 함)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)이 포함된 10cm 조직 배양 플레이트에서 Hep-3B 세포를 성장시킵니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다.
    2. 70%-80% 세포 밀도(로그 성장 단계)를 나타내는 Hep-3B 세포 플레이트를 선택하고 배지를 제거하고 플레이트를 예열 된 인산염 완충 식염수 (PBS) 5mL로 세척합니다. PBS를 제거하고 37°C에서 ~3분 동안 예열된 0.25% 트립신/0.02% EDTA 1mL와 함께 세포를 배양합니다. 조직 배양 현미경(10x)으로 세포를 관찰합니다. 세포가 둥글게 되면 트립신 분해를 중지하고 완전한 DMEM 5mL를 추가하여 플레이트에서 해리를 시작합니다. 세포를 1,000 × g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 완전한 DMEM의 5 mL에 세포를 재현탁합니다.
    3. 세포 농도를 결정하십시오. 50 μL의 세포 현탁액을 50 μL의 트리판 블루와 혼합합니다. 자동 세포 계수기를 사용하거나 혈구계 5x를 사용하여 세포를 계수하고 이러한 계수의 평균을 취하여 계수의 정확성을 보장합니다.
    4. 400 μL의 완전한 DMEM에 각 8-웰 μ-슬라이드에 42,000개의 Hep3G 세포를 시딩합니다(상기 설명된 바와 같이). 세포를 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
    5. ~80%-85% 밀도에서 24시간 후, 각 웰에서 250 μL의 배지를 제거하고, 적절한 처리 또는 비히클과 함께 50 μL의 배지를 첨가한다. 이 프로토콜을 따르기 위해, 세포를 대조군으로서 100 μM VL-850, 5 μM FCCP, 및 비히클로 처리한다.
    6. 화합물과 함께 6시간 배양한 후 염색 시약이 들어 있는 각 웰에 배지 50μL를 추가합니다(각 웰에서 250μL에 대한 염료 0.5μL). 세포를 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 염료와 함께 인큐베이션한다.
      참고: 염색 시약은 빛에 민감하므로 s를 덮어 빛에 대한 노출을 최소화amp알루미늄 호일로 하고 어두운 조명 환경(가능한 경우)에서 작업합니다.
    7. 200 μL 피펫을 사용하여 각 웰에서 모든 배지(250 μL)를 부드럽게 제거한 다음 200 μL의 예열 PBS로 세포를 세척합니다.
    8. RT에서 15분 동안 PBS에서 제조된 4% 포름알데히드와 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 200μL의 고정 용액으로 세포를 고정한다.
    9. 정착액을 경사로 세척하고 200μL의 PBS로 간단히 세척합니다.
    10. 200 μL의 PBS를 첨가하고, 세포를 4 °C에서 빛으로부터 덮고 보호하고, 24 시간 이내에 이미지를 촬영합니다.
      참고: 1.4.8단계에서와 같이 DIC, TRITC, FITC 및 DAPI를 포함한 4개 채널에서 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 치료당 ~300개의 세포를 이미지화했습니다.
  3. 이미지 분석
    1. 1.5.1-1.5.5단계를 수행합니다. 셀의 ROI를 얻으려면 셀의 영역을 강조 표시하는 이미지를 생성하십시오. 이를 위해 동일 국소화된 점(RGB) 이미지를 선택합니다(그림 4A). 전체 셀 영역을 선택하려면 프로세스 | 바이너리 | 마스크를 만들어 이진 이미지를 얻습니다(그림 4B). 셀의 영역을 분석하려면 분석 | 파티클 분석(Analyze Particles)을 선택하고 이미지의 모든 파티클을 0 에서 무한대( 파티클 분석의 기본 설정)까지 측정합니다.
    2. colocalized 미토콘드리아와 리소좀의 영역을 분석하려면 colocalized 8비트 이미지를 선택하고 프로세스 선택 | 바이너리 | 이진으로 만들기, 분석 | 입자를 분석하고 0.1625 μm24 μm2 사이의 반점의 합을 측정합니다. colocalized puncta를 측정하려면 colocalized 미토콘드리아와 리소좀의 면적을 전체 세포 면적으로 나눕니다.

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Representative Results

VL-850을 사용한 예쁜꼬 마선충 벌레와 Hep-3B 세포 모두에서 강력한 미토파지 반응 유도
VL-850은 예 쁜꼬마선충 과 인간 각질형성세포(HaCaT 세포)를 산화 스트레스로부터 보호한다23. 그 작용 메커니즘을 더 자세히 탐구하기 위해 VL-850이 예쁜꼬마선충 및 기타 인간 세포에서 미토파지를 유도하는지 여부를 조사했습니다. 이를 테스트하기 위해 예쁜꼬마선충 (젊은 성인, L1 후 3일)을 62.5μM VL-850, 5μM FCCP(양성 대조군) 및 비히클(음성 대조군)에 6시간 동안 노출시켰습니다. 상기한 바와 같이, 염색 시약을 사용하여 미토파지를 측정하였다. VL-850에 62.5μM 농도를 사용하기로 한 이유는 지렁이를 산화 스트레스로부터 보호하고 수명을 크게 연장하기 때문입니다23. VL-850은 벌레의 머리 체벽 근육에 강력한 미토파지를 유도했으며(그림 5), 이는 강력한 미토파지 유도제임을 나타냅니다. 주목할 점은 VL850의 미토파지 효능이 FCCP의 미토파지 효능과 유사하다는 것입니다(그림 5).

또한, 우리는 Hep-3B 세포에 대해 유사한 실험을 수행했습니다. 이 세포주는 원발성 간세포 암종(HCC)을 앓고 있는 8세 흑인 남성에게서 유래했습니다28. 예쁜꼬마선충 실험과 유사하게, 세포를 100μM VL-850, 5μM FCCP(양성 대조군) 및 비히클(음성 대조군)에 6시간 동안 노출시키고 염색 시약을 사용하여 미토파지를 정량화했습니다. VL-850 및 FCCP는 Hep-3B 세포에서 상당한 미토파지(유사한 정도로)를 유도했으며(그림 6), VL-850이 예쁜꼬마선충 과 인간 세포 모두에서 강력한 미토파지 유도제라는 우리의 가설을 더욱 뒷받침합니다.

Figure 1
그림 1: 예쁜꼬마선충 및 Hep-3B 세포에서의 유사분열 측정. 예쁜꼬마선충 벌레와 간암 세포 모두에서 미토파지를 측정하기 위한 염색 키트의 사용을 보여주는 개략도. 약어: VL-850 = O,O (옥탄-1,8-디일)비스(하이드록실아민); FCCP = 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존; PBS = 인산염 완충 식염수; NGM = 선충 성장 배지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 관심 있는 머리 체벽 근육 영역 선택. (A) 관심 영역이 수동으로 선택되고 마스크가 생성됩니다. (B) 결과 마스크 이미지는 주요 관심 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: C. elegans의 관심 영역에서 colocalized puncta의 정량화. (A) 관심 영역에서 푼타를 선택하려면 "AND" 연산을 선택해야 합니다. (B) 결과 이미지는 관심 영역의 반점을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 관심 영역에서 셀 선택 (A) 공국소화 점(RGB) 이미지는 공국소화 기능 후에 생성됩니다. (B) 점자를 연구할 전체 세포 영역을 나타내는 마스크 이미지. 약어: RGB = 빨강, 녹색 및 파랑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: VL-850에 의한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 강력한 미토파지 유도. (A) 화살촉은 대표적인 colocalization의 예로서 미토콘드리아와 리소좀의 colocalization을 묘사합니다. 더 나은 시각화를 위해 8배 확대된 삽입물이 제공됩니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) colocalization은 처리당 3개의 생물학적 반복과 30개의 웜으로 정량화되었습니다. 결과의 유의성은 차량 대조군과 비교하여 결정되었으며 별표는 통계적 유의성을 나타냅니다. 통계적 분석은 unpaired one-way ANOVA(Brown-Forsythe 및 Welch ANOVA 검정과 Welch's 보정)를 사용하여 수행되었으며, 0.0001 미만의 p-값(****p < 0.0001)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 약어: FCCP = 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: VL-850은 Hep-3B 세포에서 상당한 미토파지를 유도합니다. (A) 화살촉은 미토콘드리아와 리소좀의 공동 국소화를 나타내어 공동 국소화를 나타내고, 8배 확대에서 공동 국소화를 보여주기 위해 삽입물이 포함되어 있습니다. 스케일 바 = 25 μm. (B) 공동 국소화는 3개의 생물학적 반복 및 처리당 N ≥ 411 세포로 정량화되었습니다(411개는 결과에 대한 통계적 유의성 및 신뢰도를 허용하는 범위 내에 있음). 통계적으로 유의한 차이는 차량 대조군과 비교하여 평가되었으며 별표는 유의성을 나타냅니다. 데이터는 짝을 이루지 않은 일원 분산 분석(Welch's 보정을 사용한 Brown-Forsythe 및 Welch 분산 분석 검정)을 사용하여 분석되었으며 0.0001 미만의 p-값(****p < 0.0001)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 약어: FCCP = 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

다중 미토파지 경로는 다양한 단백질과 생체 분자(예: 카디오리핀29)를 포함합니다. 그러나 이러한 경로의 종점은 유사하며 리소좀 효소12,13에 의한 미토콘드리아의 분해입니다. 실제로 여러 방법에서 이 종점을 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 그러나 전자 현미경과 같은 일부 방법은 값비싼 장비, 훈련된 전문가, 표본 및 분석을 위한 연장된 준비 시간에 대한 접근을 요구합니다. 또한, 특정 조직/세포/세포하 구획에서 미토파지를 측정하는 것을 포함하는 미토파지 바이오센서를 사용하는 이점에도 불구하고, 이러한 센서의 발현은 세포(21)의 생리학을 변화시킬 수 있다. 따라서, 정상 세포 생리학에 대한 장기적인 간섭을 필요로 하지 않으면서 미토파지를 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고, 비용 효율적이며, 빠른 방법에 대한 요구가 존재한다.

여기에서 우리는 미토콘드리아/리소좀/핵 염료 칵테일의 저렴한 상업적 혼합물을 사용하는 그러한 방법을 설명합니다. 우리는 최근 예쁜꼬마선충 과 불멸화된 인간 각질세포(HaCaT 세포)에서 미토파지를 측정하는 데 유용함을 입증했습니다.23. 염색 키트 결과는 mito-Rosella( 예쁜꼬마선충) 및 cox8-mCherry-EGFP(인간 SH-SY5Y 신경모세포종 세포)를 포함한 두 개의 바이오센서와 미토콘드리아와 핵 DNA 함량 사이의 비율과 여러 미토파지/자가포식 유전자의 발현을 정량화한 qPCR 실험으로 검증되었습니다23.

이 연구에서 우리는 예쁜 꼬마선충 벌레와 인간 간 선암종 Hep-3B 세포에서 VL-850의 미토파지 활성화 효능을 탐구하기 위해 연구를 확장했습니다. 결과는 VL-850이 강력한 미토파지 유도제임을 보여줍니다(그림 5그림 6). 이러한 결과는 VL-850이 예 쁜꼬마선충 을 산화 스트레스로부터 보호하고 수명을 연장할 뿐만 아니라 HaCat 세포에서 미토파지를 유도한다는 이전 관찰을 더욱 뒷받침한다23.

염색 키트의 유용성에도 불구하고 예쁜꼬마선충 연구와 관련하여 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 적어도 연구 된 조건 하에서, 우리는 수상 돌기와 축삭의 얼룩을 관찰하지 못했습니다. 그러므로, 현재의 프로토콜은 이들 뉴런 엔티티들에서 미토파지를 측정하는데 유용하지 않다. 둘째, 장 자가형광은 미토콘드리아 염료의 녹색 형광 신호를 방해할 수 있습니다. 따라서 장에서 미토파지 측정을 위해 이 방법을 적용할 때 주의해야 합니다. 마지막으로, 특히 인간/설치류 세포주의 맥락에서 리소좀 염료는 핵 내의 산성 개체를 염색할 수 있습니다. 따라서 모든 세포주/배지 조성에 대한 염색 시약 농도/배양 시간을 경험적으로 적정하는 것이 좋습니다.

또한, 위에서 제안한 바와 같이, 미토파지를 입증하기에 충분한 단일 방법은 없습니다. 따라서 대체 방법(예: 미토파지 바이오센서, qPCR, 면역염색)을 사용하여 염색 시약 결과를 검증하고 항상 양성 미토파지 대조군(예: FCCP)을 포함하는 것이 좋습니다. 결론적으로, 염색 시약 염료 칵테일은 예쁜꼬마선충 및 인간 세포에서 미토파지를 정량화하기 위한 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 인간과 예쁜꼬마선충 세포 사이의 상당한 차이를 감안할 때, 우리는 이 방법이 다른 동물 시스템에 쉽게 적용될 수 있을 것으로 예상합니다.

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Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

원고를 비판적으로 읽고 의견과 조언을 해주신 Gross 연구소 구성원들에게 감사드립니다. 일부 균주를 제공한 국립 보건원 연구 인프라 프로그램 사무국(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에 감사드립니다. 이 연구는 Vitalunga Ltd와 Israel Science Foundation(보조금 번호 989/19)의 보조금으로 지원되었습니다. 그래픽 추상 그림(그림 1)은 BioRender.com 로 생성되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

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References

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생물학 제 195 호 Mitophagy 미토콘드리아 autophagy 리소좀 Caenorhabditis elegans Hep-3B 세포
세포 기관 특이적 염료를 사용한 <em>Caenorhabditis elegans</em> 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출
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Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

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