세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출
Summary
전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.
Abstract
미토콘드리아는 에너지 생산, 지질 대사, 칼슘 항상성, 헴 생합성, 조절된 세포 사멸 및 활성 산소 종(ROS) 생성을 포함한 다양한 생물학적 기능에 필수적입니다. ROS는 주요 생물학적 과정에 필수적입니다. 그러나 통제되지 않으면 미토콘드리아 손상을 포함한 산화적 손상을 유발할 수 있습니다. 손상된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 방출하여 세포 손상과 질병 상태를 심화시킵니다. 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)이라는 항상성 과정은 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거한 다음 새로운 미토콘드리아로 대체합니다. 여러 미토파지 경로가 있으며, 일반적인 종점은 리소좀에서 손상된 미토콘드리아의 분해입니다.
유전자 센서, 항체 면역형광 및 전자 현미경을 포함한 여러 방법론에서 이 엔드포인트를 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 미토파지를 검사하는 각 방법은 특정 조직/세포 표적화(유전자 센서 사용) 및 매우 상세하게(전자 현미경 사용)와 같은 장점이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 고가의 자원, 훈련된 인력 및 형질전환 동물을 만드는 것과 같은 실제 실험 전에 긴 준비 시간이 필요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료를 사용하여 미토파지를 측정하기 위한 비용 효율적인 대안을 제시합니다. 이 방법은 선충 Caenorhabditis elegans 및 인간 간 세포에서 미토파지를 효과적으로 측정하며, 이는 다른 모델 시스템에서 잠재적인 효율성을 나타냅니다.
Introduction
미토콘드리아는 인간을 포함한 모든 호기성 동물에게 필수적입니다. 산화적 인산화를 통해 생체분자의 화학적 에너지를 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)으로 변환하고, 헴(hem)2을 합성하고, 산화β 산화3를 통해 지방산을 분해하고, 칼슘(calcium4)과 철(iron)5 항상성을 조절하고, 세포사멸(apoptosis)6에 의한 세포 사멸을 조절하며, 산화환원 항상성(redox homeostasis)7에 중요한 역할을 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. 두 가지 보완적이고 반대되는 과정은 미토콘드리아의 완전성과 적절한 기능을 유지합니다: 새로운 미토콘드리아 성분의 합성(생물 발생)과 미토콘드리아 자가포식(즉, 미토파지)을 통한 손상된 성분의 선택적 제거8.
여러 미토파지 경로는 PINK1/Parkin과 같은 효소와 FUNDC1, FKBP8 및 BNIP/NIX 9,10을 포함한 수용체에 의해 매개됩니다. 특히, 미토콘드리아 성분의 선택적 분해는 자가포식소 기계와 독립적으로 발생할 수 있습니다(즉, 미토콘드리아 유래 소포를 통해)11. 그러나 다른 선택적 미토파지 경로의 종점은 유사합니다(즉, 리소좀 효소에 의한 미토콘드리아 분해)12,13. 이러한 이유로, 미토파지를 확인하고 측정하는 다양한 방법은 미토콘드리아 및 리소좀 마커14,15,16,17의 공동 국소화와 미토콘드리아 단백질/미토콘드리아 DNA18의 감소된 수준에 의존한다.
아래는 형광 현미경을 사용하여 동물 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 기존 실험 방법론에 대한 간결한 설명으로, 미토파지 종말점 단계를 강조합니다.
Mitophagy 바이오센서
미토콘드리아 분해는 리소좀의 산성 환경 내에서 일어난다19. 따라서 단백질을 포함한 미토콘드리아 성분은 미토파지 과정의 종점에서 중성에서 산성 pH로의 전환을 경험합니다. 이 패턴은 mito-Rosella18 및 탠덤 mCherry-GFP-FIS114를 포함한 여러 미토파지 바이오센서의 작용 메커니즘을 뒷받침합니다. 이 센서에는 pH 민감성 녹색 형광 단백질(GFP)과 pH 비민감성 적색 형광 단백질(RFP)이 포함되어 있습니다. 따라서 미토파지의 종점에서 녹색-적색 형광 비율은 GFP 형광단의 소멸로 인해 크게 떨어집니다. 이러한 센서의 주요 제한 사항은 (1) 형광단 사이의 가능한 Förster 공명 에너지 전달(FRET); (2) GFP와 RFP의 차등 성숙률; (3) GFP와 RFP를 연결하는 폴리펩티드의 단백질 분해 절단으로 인한 해리; (4) 형광-방출 중첩; 및 (5) 차등 형광단 밝기 및 담금질15,16.
이러한 한계들 중 일부를 극복하는 센서가 케이마 미토콘드리아 센서(17)이다. mt-Keima 센서(산호 단백질 Keima에서 유래)는 단일 방출 피크(620nm)를 표시합니다. 그러나 여기 피크는 pH에 민감합니다. 그 결과, 높은 pH에서 산성 pH 440로 이동할 때 녹색 여기 (586 nm)에서 적색 (16,17 nm)으로 전환됩니다. 보다 최근의 미토파지 센서인 Mito-SRAI는 고정된 생물학적 샘플(20)에서 측정을 허용함으로써 이 분야를 발전시켰다. 그러나 특정 조직/세포에서 발현하고 별개의 미토콘드리아 구획을 표적으로 삼는 능력과 같은 유전자 센서의 많은 장점에도 불구하고 한계도 있습니다. 한 가지 한계는 유전자 센서가 세포나 동물에서 발현되어야 한다는 것인데, 이는 시간과 자원 집약적일 수 있습니다.
또한 미토콘드리아 자체 내의 센서 발현은 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 예쁜꼬마선충 벌레 체벽 근육에서 미토콘드리아 GFP(mtGFP)를 발현하면 미토콘드리아 네트워크(21)가 확장된다. 이 표현형은 미토콘드리아(UPRmt)21에서 펼쳐진 단백질 반응의 활성화에 필수적인 역할을 하는 스트레스 활성화 전사 인자 ATFS-1의 기능에 의존합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 미토콘드리아/미토파지 바이오센서는 생체 내에서 미토콘드리아 항상성을 모니터링하는 데 매우 유용하지만 측정하도록 설계된 바로 그 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다.
미토콘드리아/리소좀 특이적 항체 및 염료
미토콘드리아/리소좀 colocalization을 테스트하기 위한 또 다른 전략은 미토콘드리아 외막 단백질 TOM20 및 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)22과 같은 미토콘드리아/리소좀 단백질에 대한 항체를 사용하는 것입니다. 대부분의 경우 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 현미경을 통해 형광 신호를 검출합니다. 또 다른 전략은 유전자 구조를 미토콘드리아/리소좀 염료와 결합하는 것인데, 예를 들어 세포에서 LAMP1::GFP 융합 구조를 발현하는 동시에 적색 미토콘드리아 염료(예: Mitotracker Red)로 염색하는 것입니다16. 이러한 방법론은 효과적이기는 하지만 특정 항체가 필요하며 종종 고정된 표본으로 작업하거나 형광 표지된 미토콘드리아/리소좀을 발현하는 세포/형질전환 동물을 생성하는 것을 포함합니다.
여기에서는 예쁜꼬마선충 및 인간 암 세포주 Hep-3B에서 합성 디아민 O,O(옥탄-1,8-디일)비스(하이드록실아민)(이하 VL-85023이라고 함)의 미토파지 활성화 특성을 평가하기 위한 상업용 리소좀/미토콘드리아/핵 염색 키트의 활용에 대해 간략하게 설명합니다(그림 1). 염색 키트에는 이러한 소기관을 특이적으로 염색하는 리소좀/미토콘드리아/핵 표적 염료의 혼합물이 포함되어 있다23. 우리는 이전에 이 키트를 사용하여 예쁜꼬마선충23에서 1,8 디아미노옥탄(이하 VL-004라고 함)의 미토파지 활성을 입증했습니다. 중요하게도, 우리는 미토-로젤라 바이오센서와 미토콘드리아:핵 DNA 함량의 qPCR 측정으로 염색 키트 결과를 검증했습니다23. 이 염색 키트는 다음과 같은 이점을 제공합니다. 첫째, 미토콘드리아 바이오센서를 발현하는 형질전환 동물이나 세포를 생성할 필요가 없다. 따라서 우리는 변형되지 않은 야생형 동물이나 세포를 연구할 수 있으므로 많은 시간과 돈과 노동력을 절약할 수 있습니다. 또한, 언급한 바와 같이, 발현된 미토콘드리아 바이오센서는 미토콘드리아 기능을 변화시킬 수 있다. 둘째, 키트는 비용 효율적이고 사용하기 쉽고 빠릅니다. 셋째, 예쁜꼬마선충과 인간 세포에서 이 방법을 입증하지만 다른 세포 유형 및 유기체에 대해 변형될 수 있습니다.
즉, 다른 방법과 마찬가지로 염색 키트 프로토콜에는 단점이 있습니다. 예를 들어, 시약과 함께 웜의 배양은 음식이 없을 때 수행됩니다 (우리는 죽은 박테리아조차도 염색 효율을 현저히 감소시키는 것을 보았습니다). 잠복기는 비교적 짧지만 이 기간에도 미토파지를 포함한 항상성 반응이 변경될 수 있습니다. 또한, ER/미토콘드리아/핵 단백질 및 기타 생체 분자에 대한 염료의 결합은 이러한 세포 기관의 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 유전자 센서를 사용한 미토파지 측정과 달리 화학적 고정을 거친 벌레 및 세포로 작업합니다. 따라서 동일한 웜/셀을 서로 다른 시간에 계속 모니터링하는 것은 불가능합니다. 따라서 특정 생리학적 과정에서 미토파지의 기능을 검증하기 위해 다양한 방법론을 결합하는 것이 좋습니다. 아래에서 우리는 VL-850이 예쁜꼬마선충 벌레와 Hep-3B 세포에서 강력한 미토파지를 유도한다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제시합니다. 따라서 이러한 데이터는 VL-850이 예쁜꼬마선충의 수명을 연장하고 건강한 예쁜꼬마선 충 의 유도를 통해 예 쁜꼬마선충 을 산화적 손상으로부터 보호한다는 가설을 더욱 뒷받침합니다. 우리는 강력한 미토파지 유도제24인 양성자 이오노포어 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)을 양성 대조군으로 사용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다중 미토파지 경로는 다양한 단백질과 생체 분자(예: 카디오리핀29)를 포함합니다. 그러나 이러한 경로의 종점은 유사하며 리소좀 효소12,13에 의한 미토콘드리아의 분해입니다. 실제로 여러 방법에서 이 종점을 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 그러나 전자 현미경과 같은 일부 방법은 값비싼 장비, 훈련된 전문가, 표본 및 분석을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 비판적으로 읽고 의견과 조언을 해주신 Gross 연구소 구성원들에게 감사드립니다. 일부 균주를 제공한 국립 보건원 연구 인프라 프로그램 사무국(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에 감사드립니다. 이 연구는 Vitalunga Ltd와 Israel Science Foundation(보조금 번호 989/19)의 보조금으로 지원되었습니다. 그래픽 추상 그림(그림 1)은 BioRender.com 로 생성되었습니다.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
