Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen
Summary
Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.
Abstract
Mitochondrien sind essentiell für verschiedene biologische Funktionen, darunter Energieproduktion, Fettstoffwechsel, Kalziumhomöostase, Häm-Biosynthese, regulierter Zelltod und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind für wichtige biologische Prozesse von entscheidender Bedeutung. Wenn sie jedoch nicht kontrolliert werden, können sie zu oxidativen Schäden, einschließlich mitochondrialer Schäden, führen. Beschädigte Mitochondrien setzen mehr ROS frei, wodurch die Zellschädigung und der Krankheitszustand verstärkt werden. Ein homöostatischer Prozess, der als mitochondriale Autophagie (Mitophagie) bezeichnet wird, entfernt selektiv beschädigte Mitochondrien, die dann durch neue ersetzt werden. Es gibt mehrere Mitophagie-Signalwege, wobei der gemeinsame Endpunkt der Abbau der geschädigten Mitochondrien in Lysosomen ist.
Mehrere Methoden, darunter genetische Sensoren, Antikörper-Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie, nutzen diesen Endpunkt zur Quantifizierung der Mitophagie. Jede Methode zur Untersuchung der Mitophagie hat ihre Vorteile, wie z. B. spezifisches Gewebe-/Zell-Targeting (mit genetischen Sensoren) und hohe Detailgenauigkeit (mit Elektronenmikroskopie). Diese Methoden erfordern jedoch oft teure Ressourcen, geschultes Personal und eine lange Vorbereitungszeit vor dem eigentlichen Versuch, etwa für die Erzeugung transgener Tiere. Hier stellen wir eine kostengünstige Alternative zur Messung der Mitophagie mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor, die auf Mitochondrien und Lysosomen abzielen. Diese Methode misst effektiv die Mitophagie im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in menschlichen Leberzellen, was auf ihre potenzielle Effizienz in anderen Modellsystemen hinweist.
Introduction
Mitochondrien sind für alle aeroben Tiere, einschließlich des Menschen, unerlässlich. Sie wandeln die chemische Energie von Biomolekülen durch oxidative Phosphorylierungin Adenosintriphosphat (ATP) um1, synthetisieren Häm2, bauen Fettsäuren durch β Oxidation3 ab, regulieren die Homöostase von Kalzium4 und Eisen5, kontrollieren den Zelltod durch Apoptose6 und erzeugen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die eine wichtige Rolle bei der Redoxhomöostase spielen7. Zwei komplementäre und gegensätzliche Prozesse erhalten die Integrität und ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien: die Synthese neuer mitochondrialer Komponenten (Biogenese) und die selektive Entfernung beschädigter Komponenten durch mitochondriale Autophagie (d. h. Mitophagie)8.
Mehrere Mitophagie-Signalwege werden durch Enzyme wie PINK1/Parkin und Rezeptoren wie FUNDC1, FKBP8 und BNIP/NIX 9,10 vermittelt. Bemerkenswert ist, dass der selektive Abbau von mitochondrialen Komponenten unabhängig von der Autophagosomenmaschinerie (d. h. durch mitochondriale Vesikel erfolgen)11. Die Endpunkte der verschiedenen selektiven Mitophagie-Signalwege sind jedoch ähnlich (d. h. mitochondrialer Abbau durch lysosomale Enzyme)12,13. Aus diesem Grund beruhen verschiedene Methoden zur Identifizierung und Messung der Mitophagie auf der Kolokalisation von mitochondrialen und lysosomalen Markern 14,15,16,17 und verringerten Konzentrationen von mitochondrialen Proteinen/mitochondrialer DNA 18.
Im Folgenden finden Sie eine kurze Beschreibung der bestehenden experimentellen Methoden zur Messung der Mitophagie in tierischen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf der Mitophagie-Endpunktphase liegt.
Mitophagie-Biosensoren
Der mitochondriale Abbau findet in der sauren Umgebung des Lysosoms19 statt. Daher erleiden mitochondriale Komponenten, einschließlich Proteine, am Endpunkt des Mitophagieprozesses eine Verschiebung von einem neutralen zu einem sauren pH-Wert. Dieses Muster untermauert den Wirkmechanismus mehrerer Mitophagie-Biosensoren, darunter Mito-Rosella18 und Tandem mCherry-GFP-FIS114. Diese Sensoren enthalten ein pH-empfindliches grünes Fluoreszenzprotein (GFP) und ein pH-unempfindliches rotes Fluoreszenzprotein (RFP). Daher sinkt am Endpunkt der Mitophagie das Grün-Rot-Fluoreszenz-Verhältnis aufgrund des Quenchens des GFP-Fluorophors signifikant. Die Haupteinschränkungen dieser Sensoren sind (1) ein möglicher Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorophoren; (2) die unterschiedliche Reiferate von GFP und RFP; (3) Dissoziation zwischen GFP und RFP aufgrund der proteolytischen Spaltung des Polypeptids, das sie verbindet; (4) Überlappung von Fluoreszenz-Emissions; und (5) differentielle Fluorophorhelligkeit und -abschreckung15,16.
Ein Sensor, der einige dieser Einschränkungen überwindet, ist der mitochondriale Keima-Sensor17. Der mt-Keima-Sensor (abgeleitet vom Korallenprotein Keima) zeigt einen einzigen Emissionspeak (620 nm) an. Seine Anregungsspitzen sind jedoch pH-empfindlich. Infolgedessen kommt es zu einem Übergang von einer grünen Anregung (440 nm) zu einer roten (586 nm) beim Wechsel von einem hohen pH-Wert zu einem sauren pH-Wert16,17. Ein neuerer Mitophagie-Sensor, Mito-SRAI, hat das Feld erweitert, indem er Messungen in festen biologischen Proben ermöglicht20. Trotz der vielen Vorteile genetischer Sensoren, wie z. B. der Fähigkeit, sie in bestimmten Geweben/Zellen zu exprimieren und sie auf bestimmte mitochondriale Kompartimente auszurichten, haben sie jedoch auch ihre Grenzen. Eine Einschränkung besteht darin, dass die genetischen Sensoren in Zellen oder Tieren exprimiert werden müssen, was zeit- und ressourcenintensiv sein kann.
Darüber hinaus kann die Expression der Sensoren in den Mitochondrien selbst die mitochondriale Funktion beeinflussen. Zum Beispiel erweitert die Expression von mitochondrialem GFP (mtGFP) in den Körperwandmuskeln des C. elegans-Wurms das mitochondriale Netzwerk21. Dieser Phänotyp hängt von der Funktion des stressaktivierten Transkriptionsfaktors ATFS-1 ab, der eine wesentliche Rolle bei der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort in Mitochondrien (UPRmt) spielt21. Obwohl genetisch kodierte Mitochondrien/Mitophagie-Biosensoren für die Überwachung der Mitochondrienhomöostase in vivo äußerst nützlich sind, können sie genau den Prozess beeinflussen, für den sie entwickelt wurden.
Mitochondrien/Lysosomen-spezifische Antikörper und Farbstoffe
Eine weitere Strategie zum Testen der mitochondrialen/lysosomischen Kolokalisation ist die Verwendung von Antikörpern gegen mitochondriale/lysosomale Proteine, wie z. B. das mitochondriale äußere Membranprotein TOM20 und das lysosomal-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP1)22. In den meisten Fällen werden Sekundärantikörper, die an einen Fluorophor konjugiert sind, verwendet, um das Fluoreszenzsignal mikroskopisch nachzuweisen. Eine andere Strategie besteht darin, genetische Konstrukte mit mitochondrialen/lysosomalen Farbstoffen zu kombinieren, wie z. B. die Expression eines LAMP1::GFP-Fusionskonstrukts in Zellen, während sie mit einem roten mitochondrialen Farbstoff (z. B. Mitotracker Red) gefärbt werden16. Diese Methoden sind zwar wirksam, erfordern aber spezifische Antikörper und beinhalten oft die Arbeit mit fixierten Proben oder die Erzeugung von Zellen/transgenen Tieren, die fluoreszenzmarkierte Mitochondrien/Lysosomen exprimieren.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung eines kommerziellen Lysosom-/Mitochondrien-/Kernfärbekits zur Beurteilung der Mitophagie-aktivierenden Eigenschaften von synthetischem Diamin O,O (Oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), im Folgenden als VL-85023 bezeichnet, in C. elegans-Würmern und der humanen Krebszelllinie Hep-3B (Abbildung 1). Das Färbekit enthält eine Mischung aus lysosomalen/mitochondrialen/nukleären Farbstoffen, die diese Organellen spezifisch anfärben23. Wir haben dieses Kit bereits verwendet, um die Mitophagieaktivität von 1,8 Diaminooctan (im Folgenden als VL-004 bezeichnet) in C. elegans23 nachzuweisen. Wichtig ist, dass wir die Ergebnisse des Färbekits mit dem Mito-Rosella-Biosensor und qPCR-Messungen des mitochondrial:nukleären DNA-Gehaltsvalidierten 23. Dieses Färbeset bietet die folgenden Vorteile. Erstens ist es nicht notwendig, transgene Tiere oder Zellen zu erzeugen, die einen mitochondrialen Biosensor exprimieren. Daher können wir unveränderte Wildtyp-Tiere oder -Zellen untersuchen und so viel Zeit, Geld und Arbeit sparen. Darüber hinaus kann, wie bereits erwähnt, die Expression mitochondrialer Biosensoren die mitochondriale Funktion verändern. Zweitens ist das Kit kostengünstig, einfach zu bedienen und schnell. Drittens demonstrieren wir die Methode zwar in C. elegans und menschlichen Zellen, könnten aber auch für andere Zelltypen und Organismen modifiziert werden.
Wie jede Methode hat auch das Färbekit-Protokoll Nachteile. Zum Beispiel wird die Inkubation der Würmer mit dem Reagenz in Abwesenheit von Nahrung durchgeführt (wir haben gesehen, dass selbst tote Bakterien die Färbeeffizienz erheblich verringern). Obwohl die Inkubationszeit relativ kurz ist, ist es möglich, dass auch in diesem Zeitraum die homöostatischen Reaktionen, einschließlich der Mitophagie, verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung der Farbstoffe an die ER/mitochondrialen/nukleären Proteine und andere Biomoleküle die Aktivität dieser Organellen beeinflussen. Anders als bei der Mitophagiemessung mit genetischen Sensoren arbeiten wir zudem mit Würmern und Zellen, die einer chemischen Fixierung unterzogen wurden. Daher ist es unmöglich, dieselben Würmer/Zellen zu unterschiedlichen Zeiten weiter zu überwachen. Daher empfehlen wir, verschiedene Methoden zu kombinieren, um die Funktion der Mitophagie in einem bestimmten physiologischen Prozess zu validieren. Im Folgenden präsentieren wir neue Daten, die zeigen, dass VL-850 robuste Mitophagie in C. elegans-Würmern und Hep-3B-Zellen induziert. Daher unterstützen diese Daten die Hypothese, dass VL-850 die Lebensdauer von C. elegans verlängert und C. elegans durch die Induktion einer gesunden Mitophagie vor oxidativen Schäden schützt . Als Positivkontrolle haben wir den Protonenionophor carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) verwendet, der ein potenter Mitophagie-Induktor24 ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
An mehreren Mitophagie-Signalwegen sind verschiedene Proteine und Biomoleküle (z. B. Cardiolipin29) beteiligt. Der Endpunkt dieser Signalwege ist jedoch ähnlich – der Abbau von Mitochondrien durch lysosomale Enzyme12,13. Tatsächlich nutzen mehrere Methoden diesen Endpunkt, um die Mitophagie zu quantifizieren. Einige Methoden, wie z. B. die Elektronenmikroskopie, erfordern jedoch den Zugang zu kostspieligen Geräten, geschulten Experten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Grosslabors für die kritische Lektüre des Manuskripts und ihre Kommentare und Ratschläge. Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC), das vom National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird, für die Bereitstellung einiger der Stämme. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium von Vitalunga Ltd und der Israel Science Foundation (Grant No. 989/19) unterstützt. Die graphische abstrakte Abbildung (Abbildung 1) wurde mit BioRender.com erzeugt.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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