Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.
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Methodenartikel
Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien sind essentiell für verschiedene biologische Funktionen, darunter Energieproduktion, Fettstoffwechsel, Kalziumhomöostase, Häm-Biosynthese, regulierter Zelltod und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind für wichtige biologische Prozesse von entscheidender Bedeutung. Wenn sie jedoch nicht kontrolliert werden, können sie zu oxidativen Schäden, einschließlich mitochondrialer Schäden, führen. Beschädigte Mitochondrien setzen mehr ROS frei, wodurch die Zellschädigung und der Krankheitszustand verstärkt werden. Ein homöostatischer Prozess, der als mitochondriale Autophagie (Mitophagie) bezeichnet wird, entfernt selektiv beschädigte Mitochondrien, die dann durch neue ersetzt werden. Es gibt mehrere Mitophagie-Signalwege, wobei der gemeinsame Endpunkt der Abbau der geschädigten Mitochondrien in Lysosomen ist.
Mehrere Methoden, darunter genetische Sensoren, Antikörper-Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie, nutzen diesen Endpunkt zur Quantifizierung der Mitophagie. Jede Methode zur Untersuchung der Mitophagie hat ihre Vorteile, wie z. B. spezifisches Gewebe-/Zell-Targeting (mit genetischen Sensoren) und hohe Detailgenauigkeit (mit Elektronenmikroskopie). Diese Methoden erfordern jedoch oft teure Ressourcen, geschultes Personal und eine lange Vorbereitungszeit vor dem eigentlichen Versuch, etwa für die Erzeugung transgener Tiere. Hier stellen wir eine kostengünstige Alternative zur Messung der Mitophagie mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor, die auf Mitochondrien und Lysosomen abzielen. Diese Methode misst effektiv die Mitophagie im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in menschlichen Leberzellen, was auf ihre potenzielle Effizienz in anderen Modellsystemen hinweist.
Einleitung
Mitochondrien sind für alle aeroben Tiere, einschließlich des Menschen, unerlässlich. Sie wandeln die chemische Energie von Biomolekülen durch oxidative Phosphorylierungin Adenosintriphosphat (ATP) um1, synthetisieren Häm2, bauen Fettsäuren durch β Oxidation3 ab, regulieren die Homöostase von Kalzium4 und Eisen5, kontrollieren den Zelltod durch Apoptose6 und erzeugen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die eine wichtige Rolle bei der Redoxhomöostase spielen7. Zwei komplementäre und gegensätzliche....
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Protokoll
HINWEIS: Zur Bequemlichkeit der Leser haben wir das Protokoll in zwei Teile unterteilt: Einer konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in C. elegans und der andere konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in Leberzellen. Die Liste der Materialien finden Sie in der bereitgestellten Materialtabelle .
1. Das C. elegans-Protokoll
- Vorbereitung der Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten und des Escherichia coli OP50-Bakterienbestands
HINWEIS: Zur Klarstellung: Obwohl wir die Standardprotokolle für die Herstellung der NGM-Platten ....
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Ergebnisse
Induktion einer robusten Mitophagieantwort sowohl in C. elegans-Würmern als auch in Hep-3B-Zellen mit VL-850
VL-850 schützt C. elegans-Würmer und menschliche Keratinozyten (HaCaT-Zellen) vor oxidativem Stress23. Um seinen Wirkmechanismus weiter zu erforschen, untersuchten wir, ob VL-850 Mitophagie in C. elegans und anderen menschlichen Zellen induziert. Um dies zu testen, setzten wir C. elegans-Würmer (junge Erwachsene, 3 Tage nach L1) 6 h la.......
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Diskussion
An mehreren Mitophagie-Signalwegen sind verschiedene Proteine und Biomoleküle (z. B. Cardiolipin29) beteiligt. Der Endpunkt dieser Signalwege ist jedoch ähnlich - der Abbau von Mitochondrien durch lysosomale Enzyme12,13. Tatsächlich nutzen mehrere Methoden diesen Endpunkt, um die Mitophagie zu quantifizieren. Einige Methoden, wie z. B. die Elektronenmikroskopie, erfordern jedoch den Zugang zu kostspieligen Geräten, geschulten Experten und .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Wir danken den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Grosslabors für die kritische Lektüre des Manuskripts und ihre Kommentare und Ratschläge. Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC), das vom National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird, für die Bereitstellung einiger der Stämme. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium von Vitalunga Ltd und der Israel Science Foundation (Grant No. 989/19) unterstützt. Die graphische abstrakte Abbildung (Abbildung 1) wurde mit BioRender.com erzeugt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz oder Ressource | |||
| Analysenwaage | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Pepton | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Trypton | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Hefeextrakt | BD-Difco | 212750 | |
| Calciumchlorid | Sigma | C1016 | |
| Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemikalien | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM mit hohem Glukosegehalt | Biologische Industrie | 01-055-1A | |
| Doppelt destilliertes Wasser (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS hitzeinaktiviertes | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyd (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Puffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-Gluatamin | Biologische Industrie | 03-020-1B | |
| Lysosomen/Mitochondrien/Kernfärbung Cytopainter Reagenz | Abcam ab139487 | ||
| Magnesiumsulfat | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyd (16%) | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 15720 | |
| Poloxamer 188 Lösung | Sigma | P5556 | |
| Kaliumdihydrogenphosphat | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Kaliumphosphat zweibasisch | Sigma P3786 | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Natriumchlorid | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Natriumhydroxid | Gadot | 1310732 | |
| Natriumphosphat zweibasisches Dodecahydrat | Sigma | 4273 | |
| Tetracyclinhydrochlorid | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-Diaminooxy-octan | Patentiert< | ||
| stark>Glas/Kunststoff Einweg | |||
| 0,22 μ m Spritzenfilter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petriplatten | Corning | 430167 | |
| 1.000 mL Erlenmeyerkolben | IsoLab, Deutschland | ||
| 15 mL Steriles Polypropylenröhrchen | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petrischalen | Bar Naor | ||
| 500 mL Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,22 μ m | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Steriles Polypropylen-Röhrchen | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckglä ser Mikroskop Deckglas 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glas Reagenzgläser (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilikatglas | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-Objektträger | iBiDi | 80826 | |
| Mikroskop Deckglas 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platin Iridium 0,25 mM Draht | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell Zähler CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Konfokalmikroskop mit DAPI-, FITC und TRITC Filtern und Hellfeld, mit einem 60x CFI Plan-Apochromat Lambda Typ Objektiv (Luftlinse) und NIS-Elements Software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 Stereomikroskop | Olympus | SZ61 | |
| pH-Messgerät | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Einstellbarer Laborrotator | Labnet | H5600 |
Referenzen
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insig....
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Nachdrucke und Genehmigungen
