Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos
Summary
Explorar la mitofagia a través de microscopía electrónica, sensores genéticos e inmunofluorescencia requiere equipos costosos, personal calificado y una inversión de tiempo significativa. Aquí, demostramos la eficacia de un kit de colorante de fluorescencia comercial para cuantificar el proceso de mitofagia tanto en Caenorhabditis elegans como en una línea celular de cáncer de hígado.
Abstract
Las mitocondrias son esenciales para diversas funciones biológicas, incluida la producción de energía, el metabolismo de los lípidos, la homeostasis del calcio, la biosíntesis del hemo, la muerte celular regulada y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS son vitales para los procesos biológicos clave. Sin embargo, cuando no se controlan, pueden provocar lesiones oxidativas, incluido el daño mitocondrial. Las mitocondrias dañadas liberan más ROS, intensificando así la lesión celular y el estado de la enfermedad. Un proceso homeostático llamado autofagia mitocondrial (mitofagia) elimina selectivamente las mitocondrias dañadas, que luego son reemplazadas por otras nuevas. Existen múltiples vías de mitofagia, siendo el punto final común la descomposición de las mitocondrias dañadas en los lisosomas.
Varias metodologías, incluidos los sensores genéticos, la inmunofluorescencia de anticuerpos y la microscopía electrónica, utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Cada método para examinar la mitofagia tiene sus ventajas, como la orientación específica de tejidos/células (con sensores genéticos) y gran detalle (con microscopía electrónica). Sin embargo, estos métodos a menudo requieren recursos costosos, personal capacitado y un largo tiempo de preparación antes del experimento real, como para crear animales transgénicos. Aquí, presentamos una alternativa rentable para medir la mitofagia utilizando tintes fluorescentes disponibles comercialmente dirigidos a mitocondrias y lisosomas. Este método mide eficazmente la mitofagia en el nematodo Caenorhabditis elegans y las células hepáticas humanas , lo que indica su eficiencia potencial en otros sistemas modelo.
Introduction
Las mitocondrias son esenciales para todos los animales aeróbicos, incluidos los humanos. Convierten la energía química de las biomoléculas en trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa1, sintetizan hemo2, degradan los ácidos grasos a través de la oxidación β3, regulan la homeostasis del calcio4 y el hierro5, controlan la muerte celular por apoptosis6 y generan especies reactivas de oxígeno (ROS), que desempeñan un papel vital en la homeostasis redox7. Dos procesos complementarios y opuestos mantienen la integridad y la función propia de las mitocondrias: la síntesis de nuevos componentes mitocondriales (biogénesis) y la eliminación selectiva de los dañados a través de la autofagia mitocondrial (es decir, mitofagia)8.
Varias vías de mitofagia están mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, y receptores, incluyendo FUNDC1, FKBP8 y BNIP/NIX 9,10. En particular, la degradación selectiva de los componentes mitocondriales puede ocurrir independientemente de la maquinaria del autofagosoma (es decir, a través de vesículas derivadas de mitocondrias)11. Sin embargo, los criterios de valoración de las diferentes vías de mitofagia selectiva son similares (es decir, degradación mitocondrial por enzimas lisosomales)12,13. Por esta razón, varios métodos para identificar y medir la mitofagia se basan en la colocalización de marcadores mitocondriales y lisosomales 14,15,16,17 y la disminución de los niveles de proteínas mitocondriales/ADN mitocondrial 18.
A continuación se muestra una descripción concisa de las metodologías experimentales existentes para medir la mitofagia en células animales utilizando microscopía de fluorescencia, enfatizando la fase de punto final de mitofagia.
Biosensores de mitofagia
La degradación mitocondrial ocurre dentro del ambiente ácido del lisosoma19. Por lo tanto, los componentes mitocondriales, incluidas las proteínas, experimentan un cambio de un pH neutro a un pH ácido en el punto final del proceso de mitofagia. Este patrón sustenta el mecanismo de acción de varios biosensores de mitofagia, incluyendo mito-Rosella18 y tándem mCherry-GFP-FIS114. Estos sensores contienen una proteína de fluorescencia verde sensible al pH (GFP) y una proteína de fluorescencia roja (RFP) insensible al pH. Por lo tanto, en el punto final de la mitofagia, la relación de fluorescencia verde-rojo disminuye significativamente debido al enfriamiento del fluoróforo GFP. Las principales limitaciones de estos sensores son (1) posible transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre los fluoróforos; (2) la tasa de maduración diferencial de GFP y RFP; (3) disociación entre la GFP y la RFP debido a la escisión proteolítica del polipéptido que las conecta; (4) superposición de emisiones fluorescentes; y (5) brillo y enfriamiento diferencial del fluoróforo15,16.
Un sensor que supera algunas de estas limitaciones es el sensor mitocondrial Keima17. El sensor mt-Keima (derivado de la proteína de coral Keima) muestra un pico de emisión único (620 nm). Sin embargo, sus picos de excitación son sensibles al pH. Como resultado, hay una transición de una excitación verde (440 nm) a una roja (586 nm) cuando se cambia de un pH alto a un pH ácido16,17. Un sensor de mitofagia más reciente, Mito-SRAI, ha avanzado el campo al permitir mediciones en muestras biológicas fijas20. Sin embargo, a pesar de las muchas ventajas de los sensores genéticos, como la capacidad de expresarlos en tejidos / células específicos y dirigirlos a distintos compartimentos mitocondriales, también tienen limitaciones. Una limitación es que los sensores genéticos deben expresarse en células o animales, lo que puede llevar mucho tiempo y consumir muchos recursos.
Además, la expresión de los sensores dentro de las propias mitocondrias puede influir en la función mitocondrial. Por ejemplo, la expresión de GFP mitocondrial (mtGFP) en los músculos de la pared corporal del gusano C. elegans expande la red mitocondrial21. Este fenotipo depende de la función del factor de transcripción activado por estrés ATFS-1, que desempeña un papel esencial en la activación de la respuesta proteica desplegada en mitocondrias (UPRmt)21. Por lo tanto, aunque los biosensores de mitocondria/mitofagia codificados genéticamente son extremadamente útiles para monitorear la homeostasis de las mitocondrias in vivo, pueden afectar el proceso para el que están diseñados.
Anticuerpos y colorantes específicos de mitocondrias/lisosomas
Otra estrategia para probar la colocalización mitocondrial/lisosomas es usar anticuerpos contra proteínas mitocondriales/lisosomales, como la proteína mitocondrial de la membrana externa TOM20 y la proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (LAMP1)22. En la mayoría de los casos, los anticuerpos secundarios que se conjugan a un fluoróforo se utilizan para detectar la señal de fluorescencia a través de microscopía. Otra estrategia es combinar construcciones genéticas con colorantes mitocondriales/lisosomales, como expresar una construcción de fusión LAMP1::GFP en células mientras se tiñen con un colorante mitocondrial rojo (por ejemplo, Mitotracker Red)16. Estas metodologías, aunque efectivas, requieren anticuerpos específicos y a menudo implican trabajar con especímenes fijos o generar células / animales transgénicos que expresan mitocondrias / lisosomas marcados con fluorescencia.
Aquí, describimos la utilización de un kit comercial de tinción lisosoma/mitocondria/nuclear para evaluar las propiedades activadoras de la mitofagia de la diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), en lo sucesivo denominada VL-85023, en gusanos C. elegans y la línea celular de cáncer humano Hep-3B (Figura 1). El kit de tinción contiene una mezcla de colorantes lisosomales/mitocondriales/nucleares que tiñen específicamente estos orgánulos23. Anteriormente utilizamos este kit para demostrar la actividad mitofagia del 1,8 diaminooctano (en adelante, VL-004) en C. elegans23. Es importante destacar que validamos los resultados del kit de tinción con el biosensor mito-Rosella y las mediciones por qPCR del contenido de ADN mitocondrial:nuclear23. Este kit de tinción ofrece las siguientes ventajas. En primer lugar, no hay necesidad de generar animales transgénicos o células que expresen un biosensor mitocondrial. Por lo tanto, podemos estudiar animales o células de tipo salvaje no modificados y, por lo tanto, ahorrar mucho tiempo, dinero y trabajo. Además, como se mencionó, la expresión de biosensores mitocondriales puede cambiar la función mitocondrial. En segundo lugar, el kit es rentable, fácil de usar y rápido. En tercer lugar, aunque demostramos el método en C. elegans y células humanas, podría modificarse para otros tipos de células y organismos.
Dicho esto, como cualquier método, el protocolo del kit de tinción tiene inconvenientes. Por ejemplo, la incubación de los gusanos con el reactivo se lleva a cabo en ausencia de alimentos (hemos visto que incluso las bacterias muertas disminuyen significativamente la eficiencia de tinción). Aunque el tiempo de incubación es relativamente corto, es posible que incluso en este período de tiempo, las respuestas homeostáticas puedan verse alteradas, incluida la mitofagia. Además, la unión de los colorantes a las proteínas ER/mitocondriales/nucleares y otras biomoléculas puede afectar las actividades de estos orgánulos. Además, a diferencia de la medición de mitofagia con sensores genéticos, trabajamos con gusanos y células que han sufrido fijación química. Por lo tanto, es imposible continuar monitoreando los mismos gusanos / células en diferentes momentos. Por lo tanto, recomendamos combinar diferentes metodologías para validar la función de la mitofagia en un proceso fisiológico particular. A continuación, presentamos nuevos datos que demuestran que VL-850 induce mitofagia robusta en gusanos C. elegans y células Hep-3B. Por lo tanto, estos datos apoyan aún más la hipótesis de que VL-850 extiende la vida útil de C. elegans y protege a C. elegans del daño oxidativo a través de la inducción de mitofagia sana . Hemos utilizado el ionóforo de protones cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que es un potente inductor de mitofagia24, como control positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Múltiples vías de mitofagia involucran varias proteínas y biomoléculas (por ejemplo, cardiolipina29). Sin embargo, el punto final de estas vías es similar: la degradación de las mitocondrias por enzimas lisosomales12,13. De hecho, varios métodos utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Sin embargo, algunos métodos, como la microscopía electrónica, requieren acceso a equipos costosos, expertos capacitad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Gross por la lectura crítica del manuscrito y sus comentarios y consejos. Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los Institutos Nacionales de Salud (P40 OD010440), por proporcionar algunas de las cepas. Esta investigación fue apoyada por una subvención de Vitalunga Ltd y la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 989/19). La figura gráfica abstracta (Figura 1) se generó con BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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